Выделение белковых включений

Некоторые белки, синтезирующиеся в клетках в избыточном количестве, образуют нерастворимые частицы (тельца включения). После разрущения клеток их легко можно отделить от большинства других клеточных компонентов. Вначале исследователям не удавалось дезагрегировать выделенные тельца включения так, чтобы при этом не произошла необратимая денатурация белков, но позже были разработаны методы, позволяющие ренатурировать рекомбинантный белок и восстановить его активность. Ясно, что все эти дополнительные процедуры увеличивают стоимость процесса очистки. [c.367]

В любом случае выделение и очистка ферментов — это наука, граничащая с искусством В самом деле, если химическая реакция протекает с выходом 0,1 % и с сотней побочных продуктов, то вряд ли химик-органик проявит интерес к процессу получения (и, тем более, очистки) целевого продукта Но именно такие задачи встают перед биотехнологами, желающими получить индивидуальный белок В работе с биологическим материалом необходимы и важны знания предварительных характеристик по содержанию белка в различных биообъектах (даже в органах и тканях одного и того же вида животного) От этого зависит выбор материала, его предварительная подготовка для включения в технологический процесс [c.54]

Ядра, митохондрии и хлоропласты растений, как сообщалось, также синтезируют белок. Ядра, тщательно выделенные из гороха, включают в белок меченый лейцин в присутствии других белковых аминокислот и АТФ. Синтез белка в митохондриях растений показан не очень убедительно, так как не было исключено загрязнение данной фракции рибосомами. Препараты хлоропластов, как обнаружено, также катализируют включение аминокислот в белок. [c.482]

Поскольку выделение мутантов у микроорганизмов — задача относительно несложная, микроорганизмы являются очень удобным объектом при исследовании метаболических процессов и изучении физиологической роли определенных биохимических реакций, тем более что протекающие в живых организмах метаболические процессы в основном универсальны. Например, бактерии, птицы, рептилии и млекопитающие нуждаются в синтезе одинаковых низкомолекулярных соединений. Далее, различные виды организмов используют одинаковый клеточный аппарат для включения этих соединений в определенные макромолекулы. Так, оказывается, что последовательность аминокислот в некоторых белках достаточно близка у таких далеких организмов, как микробы и млекопитающие. Информацию, необходимую для решения некоторых общих проблем биохимии, можно получить при работе с любыми живыми организмами, однако бактерии обладают тем преимуществом, что при работе с ними можно использовать такие методы, которые неприемлемы при работе с другими организмами. Как отметил Дж. Уотсон [43] [c.29]

Из таблицы видно, что после введения мясного бульона радиоактивность отделов желудочно-кишечного тракта выше, чем натощак (статистически достоверные результаты получены для поджелудочной железы, тонкого кишечника, пилорического и пищеводного отделов желудка). Следовательно, в период активной секреции пищеварительных желез, вызванной мясным бульоном, происходит повышение скорости включения радиоактивного метионина в белки. Это указывает на усиленный синтез или на преобладание процессов синтеза белков над процессами выделения их в составе пищеварительных соков. [c.449]

Так же как и для отмерших бактериальных клеток, изотопный состав азота белков и нуклеиновых кислот, выделенных из основной массы органического вещества почвы, характеризуется достаточной однородностью, свидетельствующей об одновременном включении внесенного меченого азота в эти фракции. [c.223]

Кроме ферментов, в которых весь связанный металл либо его часть играют в большей степени структурную, чем каталитическую роль, известны ферменты, содержащие два различных металла, которые, по-впдимому, играют одинаковую каталитическую роль, например алкогольдегидрогеназа, выделенная из дрожжей, выращенных в присутствии СоСЬ [92] (разд. 5). В таких случаях смешанная стехиометрия может быть результатом либо наличия двух металлоферментов в соответствующем соотношении, либо образования истинного гибридного металлофермента. Нет простых методов, чтобы установить разницу между этими двумя возможностями, кроме тех случаев, когда в результате замещения металла происходит изменение свойств белка. И хотя включение нескольких металлов в фермент является обычно результатом заранее обдуманного введения этих металлов в пищу или в питательную среду, однако такие же ситуации могут иметь место и в природе, [c.459]

Л. К. Островской установлено, что питание растений солями, содержащими тяжелый азот в нитратной или аммиачной группах, и последующий масс-спектрометрический анализ-выделенных из растений соединений, содержащих азот, дают основание сказать, что участие меди в ассимиляции этих форм азота различно. При питании нитратами недостаток меди тормозит образование какого-то из ранних продуктов их восстановления и вначале не сказывается на обогащении азотом аминокислот, амидов, белков, пептонов и полипептидов. В дальнейшем же наблюдается сильное торможение обогащения всех фракций органического азота, причем оно особенно значительно в амидах. При питании аммиачным азотом недостаток меди задерживает включение тяжелого азота в белок, пептоны и пептиды уже в первые часы после внесения азотной подкормки. Это указывает на особо важную роль меди при применении аммиачного азота. [c.21]

Белковые примеси могут оказывать влияние на эффективность растворения, расщепления и восстановления исходной конформации рекомбинантных белков. В качестве исходного материала для таких экспериментов часто отдают предпочтение выделенным и отмытым белковым включениям. [c.104]

Рис. 4,8. Основные этапы выделения активных, растворимых эукариотических белков из нерастворимых включений клеток.

Не изменены ли свойства индивидуальных звеньев Вообще говоря, нам хорошо известны ионные равновесия, химические и физические свойства всех обычных боковых цепей, входящих в белки и нуклеиновые кислоты. Однако эти свойства часто изменяются, когда остатки оказываются включенными в упорядоченную вторичную структуру или структуры высших порядков. Это изменение может явиться источником информации о локальной структуре вблизи данного остатка. Изменение свойств можно исследовать при помощи некоторых физических методов с гораздо более высоким разрешением, чем это удается при исследовании структуры как целого методом рентгеновской кристаллографии. Например, определенные спектроскопические методы обладают высокой чувствительностью к характеру химической связи или к распределению электронов вокруг данного атома. Если этот атом чем-то выделен, он может служить зондом, поскольку его можно изучать на фоне всей макромолекулы. [c.29]

Свендсен [1254] сконструировал аппарат, в котором фракционирование содержимого колонки с градиентом плотности осуществляется при включенном электрическом поле. В этом аппарате нижний электрод отделен от колонки полупроницаемой мембраной и расположен в опециальном отсеке с подводящей и отводящей трубками, что позволяет прокачивать через него электролит из другого резервуара и таким образам удалять выделяющиеся при электролизе пузырьки газа. По окончании ИЭФ, не отклю чая напряжения, в пространство, находящееся непосредственно над полупроницаемой мембраной, насосом подают концентрированный раствор сахарозы. Одновременно вторым насосом из колонки откачивают жидкость через расположенную над мембраной выводную трубочку, причем скорость отсасывания содержимого колонки должна превышать скорость поступления раствора сахарозы. Благодаря такой разнице в производительности насосов образуется очень стабильная контактная поверхность раздела между поднимающимся снизу плотным раствором сахарозы и опускающейся сверху до уровня выводной трубки менее плотной жидкостью, заполняющей колонку. Описанная система полностью исключает перемешивание раздел ившихся белков, неизбежно происходящее в отсутствие электрического поля из-за наличия диффузии. Поэтому удается получить очень узкие зоны. К сожалению, pH собранных фракций сильно изменяется под влиянием раствора сахарозы, который может быть кислым или щелочным. Вследствие этого невозможно определить изоэлектрические точки выделенных белков. [c.139]

Дальнейшие исследования показали, что в клетках Е. соИ при высоком уровне продукции как прокариотических, так и эукариотических белшв, превышающем 20 % суммарного клеточного белка, во многих случаях в цитоплазме образуются тельца включения — нерастворимые агрегаты (гранулы), хорошо видимые под фазово-контрастным микросшпом. Обнаружено, что гранулы, формируемые при сверхсинтезе белка, содержат и небольшое количество примесей, в состав которых входят различные белки клетки, рибосомные РНК и даже плазмидная ДНК. Эти примеси, по-видимому, со-осаждаются с белком, образующим тельца включения. В настоящее время разработаны достаточно простые методы выделения телец включения и перевода их в растворимое состояние. [c.154]

В ряде лабораторий (в частности, в лаборатории С. Бреннера) были получены данные о возможности существования в клетках в соединении с рибосомами короткоживущей РНК, названной информационной (иРНК). Сейчас она обозначается как матричная РНК (мРНК), потому что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой осуществляется синтез белка. Эта блестящая гипотеза затем экспериментально бьша доказана в лаборатории М. Ниренберга. При изучении влияния различных фракций клеточной РНК на способность рибосом, выделенных из Е. oli, к синтезу белка было установлено, что некоторые из них стимулировали включение С-аминокислот в синтезируемый полипептид. Добавление синтетического полинуклеотида, в частности полиуридиловой кислоты (поли-У), в белоксинтезирующую систему приводило к включению в синтезирующуюся белковую молекулу единственной аминокислоты -фенилаланина. Поли-У вызывал синтез в бесклеточной системе необычного полипептида полифенилаланина. Таким образом, искусственно синтезированный полирибонуклеотид, добавленный к препаратам рибосом, включавшим известные к тому времени факторы белкового синтеза и источники энергии, вызывал синтез определенного, запрограммированного полипептида. [c.519]

Хлорофиллы локализованы в пластинках, где они, по-видимому, находятся в виде комплекса с липидом и белком. Предполагают, что хлорофилл расположен между липидом и белком таким образом, что гидрофильное ядро порфирина связано с белком, а липофильная цепь фитола — с липидными слоями. Из хлоропластов Euglena выделен комплекс хлорофилла с белком (хлоропластин), обладающий ферментативной активностью. Этот комплекс катализирует реакцию Хилла (см. стр. 261) и незначительно катализирует включение неорганического фосфата в лабильный фосфат. [c.258]

На этом рисунке видно, что вне области сравнительно резких изменений величины т характер зависимостей г от температуры для зонда АХЦ6), включенного в мембраны, и липид, выделенный из мембран, практически один и тот же, поэтому можно считать, что в мембранах зонд АХ 1(6) локализован в липидных областях. Характер же зависимостей х от температуры для зонда BIV, локализованного в мембранах и липиде, вне области резких изменений отличен, в то время как при локализации радикала на мембране и на белке, выделенном из мембран, зависимость т от температуры отсутствует. На этом основании в работе [113] сделан вывод о том, что зонд ВIV в отличие от зонда АХ 1(6) преимущественно связан с белками мембран. [c.182]

После скармливания М -аспарагиновой кислоты наивысшая концентрация изотопа обнаруживается в выделенной из тканевых белков глутаминовой кислоте. Высокая концентрация изотопа в дикарбоновых аминокислотах хорошо согласуется с большой скоростью переаминирования этих аминокислот и с данными о включении азота аммиака в глутаминовую кислоту под действием глутаматдегидрогеназы. Тот факт, что после скармливания животным Ы -аспарагиновой кислоты наибольшая концентрация изотопа обнаруживается в глутаминовой кислоте, находится в соответствии с широким распространением и высокой активностью глутамат-аспартат-трансаминазы. Исследования Шёнхаймера и его сотрудников показали также, что, хотя введенные per os К °-аминокислоты могут служить прямыми предшественниками соответствующих аминокислот белка, они разбавляются в организме одноименными присутствующими в нем аминокислотами. [c.177]

Сейчас мы переходим к изложению наиболее важного метода прямой расшифровки кода. В нем используется изучение синтеза белка в так называемых бесклеточных полных системах (Замеч-яик, Хогланд, Липман). Давно известно, что можно наблюдать эффект включения радиоактивных аминокислот в белки, если вести реакцию на препарате рибосом, выделенных из вскрытых клеток. Подобный процесс требует присутствия а) самих рибосом, являющихся универсальной мастерской для синтеза белка б) ряда пока неидентифицированных ферментов в) всех 20 аминокислот одновременно г) РНК — переносчика или растворимой РНК, прикрепляющейся к молекулам аминокислот и осуществляющей их активацию д) источника энергии в форме аденозинтрифосфор-ной кислоты (АТФ), гуанозинтрифосфорной кислоты (ГТФ) и ферментативной системы, призванной непрерывно возобновлять запас этих соединений е) наконец, для синтеза белка в открытой [c.423]

Известно, что ядерные белки, например гистоны, могут регулировать синтез ДНК за счет изменения затравочной способности самой матрицы [22]. По-видимому, синтез гистонов предшествует синтезу ДНК в ходе клеточного цикла. Следствием этого является постепенное увеличение отношения гистон ДНК, что приводит к прекращению синтеза ДНК незадолго до наступления митоза. Разные по составу гистоны угнетают синтез ДНК в различной степени. Так, например, гистон, богатый аргинином, угнетает синтез примерно на 30—40%, а лизиновый гистон на 80% [22]. Интересно, что при небольших значениях соотношения гистон ДНК синтез ДНК может даже стимулироваться. При выделении ДНК и отдельных фракций ДНП из ядер регенерирующей печени крыс, облученных дозой 800 р и испытании их в качестве затравки в системе синтеза ДНК оказалось, что облучение сильно ингибирует синтез ДНК во всех случаях, когда в качестве затравки применялись различные фракции ДНП. Если затравкой служил полностью депротеинизированный образец ДНК, то включение меченого предшественника ДНК почти не отличалось от контроля [28]. При исследовании включения [c.126]

Не следует думать, что аминокислоты, раз войдя в структуру молекулы белка, пребывают там до ее разрушения неиз.меино, н что белковая молекула, раз построенная, также остается неизмен1юй до своего распада. Идея о постоянном обновлении организма принадлежит А. Я. Данилевскому. Более поздние исследования других авторов показали, что в белках живых тканей идет непрерывная замена аминокислот. Были синтезированы аминокислоты с тяжелым азотом они были скормлены крысам и мышам. Потом гидролизованы белки их тела и изолированы различные аминокислоты из гидролизатов. Затем определен в выделенных аминокислотах N 5 для того, чтобы установить, какое количество введенного азота пошло на построение белков тела, безразлично— форме ли введенной аминокислоты, или в форме других аминокислот, возникших из введенных путем переаминирования или вследствие других процессов. Оказалось, что включение в тканевые белки начинается почти непосредственно, и хотя большая часть меченого N1 была вчленена в форме скормленной аминокислоты, все же значительная часть меченого азота была найдена распределенной в белках среди других аминокислот. [c.365]

При использовании описанного выше метода лизиса клеток Е. oli из них высвобождаются белковые включения, которые, как правило, остаются в нерастворимой форме. Поскольку рекомбинантный белок находится в виде дискретных включений, его выделение из клеточного лизата само по себе может служить стадией очистки. Включения эти обладают достаточно высокой плотностью, и поэтому их можно выделять центрифугированием. Средний разхмер и плотность включений могут варьировать в зависимости от природы экспрессируемого белка [16]. Это подтверждается опубликованными данными о выделении включений при использовании разных скоростей центрифугирования (величина центробежного ускорения) от 500 до 12 000 g [1]). Обычно можно эмпирически определить скорость центрифугирования и время, необходимые для осаждения включений, такие, чтобы другие специфические белки оставались в надосадочной фракции. Типичный метод выбора оптимальных условий разделения выглядит следующим образом. [c.101]

Как показано на рис. 4.4, после выделения включения могут быть загрязнены различными примесями. Дальнейшую очистку можно осуществить путем отмывки включений растворами, солюбилизирующими примеси, но не рекомбинантный белок. Так, например, два основных примесных компонента, загрязняющих включения прохимозина, по всей видимости, — белки наружной [c.102]

Биохимический состав хромосом. Для изучения химического состава хромосом пользуются различными способами. Наиболее распространенными из них являются окраска специфическими красителями, исследование спектров поглощения в ультрафиолетовых лучах, авторадиография (включение меченых изотопов в состав хромосом), а также биохимические анализы ядер, и выделенных из них компонентов. Согласно биохимическим исследованиям Хромосомы состоят преимущественно из ДНК (около 40%) и гистонов (40%)—белков основного характера с высоким содержанием аргинина и лизина. Второй компонент, часто называемый нуклеогистоном является наиболее постоянной частью химического состава хромосом. Кроме того, в их состав входят РНК и негистоновые (остаточные) белки (20%). Негистоновые хромосомные белки — это главным образом кислые белки. Существует больше ста, вероятно несколько сотен, таких белков. К ним относятся белки ответственные за движение хромосом (актин, миозин, тубулин), ферменты синтеза РНК и ДНК (полимеразы), а также, вероятно, белки, регулирующие активность отдельных генов. Комплексы РНК и негистоновых белков лабильны, тогда как содержание ДНК в хромосомах в пределах вида— относительно постоянная величина. [c.83]

Ha рис. 12.7 представлены типичные результаты измерений упруговязкой релаксации ДНК. Обратите внимание на чрезвычайно большие времена релаксации молекул, массы которых составляют 10 и более а.е.м. Отличное согласие с экспериментом, полученное для ДНК с известными молекулярными массами, показывает, что формула (12.34) правильна. Данный метод с успехом использовали для определения молекулярных масс ДНК вплоть до зничений, близких к Ю . Гигантские молекулы ДНК с такой молекулярной массой (примером которых могут служить молекулы, выделенные из целых развернутых хромосом бактерий или эукариот) настолько непрочны, что их невозможно даже переместить из одного сосуда в другой. Для того чтобы их исследовать, необходимо клетки, содержащие такую ДНК, подвергнуть лизису непосредственно в ротационном вискозиметре и освободить ДНК in situ от связанных с ней белков посредством обработки детергентами и ферментативного расщепления. Для смешивания этих реагентов с клеточным лизатом можно использовать только конвекцию, поскольку любое перемешивание недопустимо. Естественно, приходится ограничиваться очень малыми скоростями ротора, чтобы уменьшить вероятность разрыва молекулы в градиенте скорости. Угол, на который повернется ротор за промежуток времени между включением вращающего момента и началом процесса релаксации, должен быть минимальным это всегда менее одного оборота. [c.282]

Смотреть страницы где упоминается термин Выделение белковых включений: [c.113] [c.39] [c.15] [c.7] [c.199] [c.200] [c.57] [c.103] [c.192] [c.277] [c.282] [c.191] [c.46] [c.441] [c.85] [c.127] [c.127] [c.460] [c.201] [c.474] [c.165] [c.279] [c.14] [c.85] [c.105] [c.627] [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология