Оценка гомогенности белка

Особого упоминания заслуживает оценка гомогенности белка с помощью так называемого иммуноэлектрофореза. Сущность его состоит в сочетании двух приемов I) разделения белковой смеси с помощью электрофореза в геле 2) взаи- [c.36]

ОЦЕНКА ГОМОГЕННОСТИ БЕЛКА [c.34]

Если дело касается определения строения чистого гомогенного белка, то определение некоторых аминокислот с наибольшей возможной точностью принесет больше пользы, чем ориентировочная оценка содержания большого количества аминокислот . [c.9]

Методы оценки полноты очистки и гомогенности белков Глава II. Химический состав белков [c.3]

Методы оценки полноты очистки и гомогенности белков [c.35]

Заключительная оценка полноты очистки и гомогенности белка требует сочетания ряда применяемых методов. Для предварительного вывода о гомогенности необходимы прежде всего данные о невозможности дальнейшего фракционирования препарата всеми применимыми в данном случае методами. Разумеется, имеются в виду не все возможные приемы, а наиболее эффективные варианты основных методов фракционирования— ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, молекулярной фильтрации и др., причем не в препаративных, а в аналитических модификациях. При этом приходится считаться с опасностью того, что выявление, новых фракций может быть обусловлено частичной денатурацией белка при некоторых из этих процедур. С другой стороны, невозможность дальнейшего фракционирования может быть обусловлена недостаточным совершенством использованных разновидностей методов разделения. Нередко оказывалось, что применение более совершенных методов позволяло фракционировать белки, считавшиеся ранее гомогенными. [c.35]

Определение молекулярных масс белков возможно также с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии на полисахаридных или полиакриламидных гелях с поперечными сшивками (разд. 5.6.3.4). Этот метод, названный гель-фильтрацией, позволяет производить оценку гомогенности по размерам молекул, а также разделять белки с различными молекулярными массами. Зная объем элюирования изучаемого белка, можно оценить его величину, если колонка предварительно прокалибрована по белкам с известными молекулярными массами. [c.133]

Обычные критерии, принятые для оценки чистоты низкомолекулярных веществ, малоприменимы к белкам, нуклеиновым кислотам и полисахаридам. Эти макромолекулы плохо кристаллизуются и могут образовывать смешанные кристаллы с другими соединениями они, как правило, не имеют определенной точки плавлення. Определение элементного состава в этом случае не имеет смысла вследствие наличия огромного числа атомов в макромолекулах. Однако что касается белков, то число остатков каждой аминокислоты, рассчитанное на молекулу индивидуального белка, должно быть целочисленным следовательно, когда в молекулу белка входит небольшое число остатков какой-либо аминокислоты, аминокислотный анализ дает ценную информацию о гомогенности белка. [c.164]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Для оценки степени чистоты (гомогенности) выделенного белка одним из наиболее надежных методов является проба на постоянство раствори- [c.15]

Для оценки степени чистоты (гомогенности) выделенного белка одним нз наиболее надежных методов является проба на постоянство растворимости. Эта проба основана на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. При растворении смеси веществ растворимость каждого индивидуального вещества не зависит от других веществ, находящихся в смеси. Состав растворившейся и нерастворившейся частей смешанного белкового препарата будет поэтому различным. Следует также иметь в виду, что кристалличность белкового препарата не может служить критерием гомогенности. [c.16]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ НАБЛЮДЕНИЯ ЗА ВЫДЕЛЕНИЕМ БЕЛКОВ И ДЛЯ ОЦЕНКИ ИХ ГОМОГЕННОСТИ [c.16]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

В настоящее время доказано наличие в одних и тех же клетках и тканях чрезвычайно близких белков, не вполне, однако, идентичных друг другу по составу, структуре, физикохимическим свойствам и биологической активности. Таковы, например, изоэнзимы и некоторые из белков, образующихся в результате незначительных изменений в геноме клетке или искажений процессов синтеза белка в данной клетке. Это еще больше усложняет оценку гомогенности. Даже при наличии положительных данных о гомогенности по всем перечисленным выше тестам следует считать достаточно строгим лишь вывод об очень высокой степени очистки и о большой вероятности того, что данный белок является гомогенным. [c.37]

Все методы, применяемые для наблюдения за процессом выделения белков и фракционирования смесей, в которых содержатся белки, можно подразделить на три группы. В первую группу входят главным образом методы определения общего содержания белка. Сюда могут быть также отнесены методы анализа других классов веществ, с которыми соединяются белки, например липи-дов, углеводов и нуклеиновых кислот. Вторая группа охватывает специфические (химические или биологические) методы определения индивидуальных составных частей смеси. Каждая предполагаемая составная часть должна быть определена в отдельном опыте с помощью другого метода. Эти методы, особенно некоторые биологические способы анализа, различаются по своей чувствительности и специфичности. К третьей группе относятся методы (преимущественно физико-химические) оценки гомогенности белковых препаратов. В пределах применимости используемых методов при каждом из таких определений учитывается все количество белка. [c.16]

В органической химии образование кристаллов считаете. ], как правило, окончательным доказательством того, что исследуемое вещество является однородным (гомогенным). Если к тому же кристаллы плавятся после перекристаллизации при одксй и тон же температуре, то однородность соединения считается несомненной. Однако этот критерий нельзя применять к кристаллам белковых веществ. Для оценки гомогенности выделенного белка наиболее надежным методом является проба на постоянсто растворимости. Это основано на правиле фаз, согласно которому растворимость гомогенного вещества, находящегося в твердой фазе, зависит только от температуры. Другими словами, растворимость индивидуальных белков, находящихся в смеси. [c.9]

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

В первый том вошли переводы статей Тэйлора Выделение белков , Дэнюэля Общая химия аминокислот , Тристрама Аминокислотный состав белков и Путнама Химические изменения белков . В каждой из статей содержится обширный, подвергнутый критической оценке материал, отражающий уровень сведений по тому или иному разделу химии белка. Каждая статья представляет самостоятельный интерес. Особого внимания заслуживает статья Тэйлора, в которой детально рассмотрены вопросы выделения белков и определения их гомогенности. Обстоятельно написана также статья Путнама, посвященная изучению реакционных особенностей функциональных групп белковой молекулы. [c.3]

Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности препарата можно судить по характеру границы седиментации, используя метод определения скорости седиментации гомогенный препарат обычно дает одну резкоочерченную границу. Присутствующие в препарате примеси проявляются в виде дополнительного пика или плеча они же обусловливают асимметрию основного пика. [c.63]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология