Пептиды хроматографическое разделение

Рис. 6-8. Пептидная карта, полученная после расщепления нормального гемоглобина человека трипсином. Каждое пятно содержит один из пептидов. Чтобы получить такую двумерную карту, смесь пептидов наносят на лист бумаги квадратной формы, проводят электрофорез в одном направлении, параллельном одной из сторон квадрата, после чего бумагу высушивают, а затем проводят хроматографическое разделение пептидов в другом направлении, перпендикулярном первому. Ни один из этих двух процессов в отдельности не позволяет разделить пептиды полностью, однако последовательное их осуществление оказывается очень эффективным способом разделения сложных пептидных смесей.

Методы хроматографического разделения гликопротеинов фактически не отличаются от методов, используемых в химии белков и пептидов. Также имеется ряд белков, которые в обычном смысле не считаются гликопротеинами, хотя они содержат один или несколько гликозидных остатков. Конечно, существует множество методов, с помощью которых могут разделяться различные гликопротеины. С точки зрения хроматографиста, здесь не следует детально их описывать. С другой стороны есть хроматографический метод, специфичный для структурных анализов гликопротеинов и гликопептидов. Специфичность основана на вы-боре подходящей системы детектирования, а не собственно метода разделения. Здесь будет кратко рассмотрен метод, описанный в работе [221- [c.145]

Применение распределительной хроматографии для изучения химии и обмена аминокислот и белков имеет наибольшее значение, так как с ее помощью удается разрешить труднейшие задачи разделения, идентификации и выделения индивидуальных аминокислот и пептидов из их смесей. В литературе описано много работ по хроматографическому разделению и определению аминокислот. [c.144]

Раствор пептидов, остающийся в надосадочной жидкости, наносят на мокрую фильтровальную бумагу и подвергают действию электрического поля высокого напряжения. Под влиянием поля пептиды разделяются, причем подвижность каждого из них определяется в первую очередь величиной заряда. Затем под углом 90° к направлению первоначального разделения проводится хроматографическое разделение. После того как бумага [c.223]

В газовой хроматографии градиентная элюция осуществляется в результате непрерывного изменения температуры в колонке, что осуществляется в результате перемещения кольцевой печки вдоль колонки. Решающую роль градиентная элюция играет в хроматографическом разделении полимеров [5]. Правда, количественные закономерности этого процесса иные, так как он основан на сочетании градиентного изменения состава раствора и наличия градиента температуры в колонке. Подобный процесс относится к особому типу хроматографии — к осадочной хроматографии. Смесь полимеров, находящаяся в верхней части колонки в виде осадка, растворяется в результате введения хорошего растворителя и переносится вниз по колонке, где снова выпадает в осадок, попадая в более холодную часть колонки. Многократное повторение, актов растворения и осаждения является лучшим методом хроматографического разделения гидрофобных высоко-полимеров. Вместе с тем этот метод применим и для разделения смеси пептидов. [c.115]

Проводимое таким образом хроматографическое разделение пептидов осуществляется за 27 час, т. е. в 4 раза быстрее, чем в работе Шредера [42]. Однако, как можно судить из приводимых в работах хроматограмм, в последнем случае разделение получается менее четким. Кроме того, недостатком этого процесса, если его использовать в препаративных целях, является применение солевых буферных растворов. [c.176]

Наибольшей скоростью прохождения колонки обладают компоненты, не способные проникнуть в зерна гелевой фазы. Сефадексы 0-10 и 0-15 служат для фракционирования низкомолекулярных веществ, первый из них используется для веществ с молекулярным весом до 700, а второй — до 1500. Гели сефадекса 0-25 не способны поглощать, а следовательно, и задерживать перемещение по колонке веществ с молекулярным весом 3500— 4500. Этот предел для сефадекса 0-50 лежит в области значений молекулярных весов 8000—10000, а для сефадекса 0-75 эта величина достигает 40000—50000. Медленно перемещаются по колонке низкомолекулярные вещества, для которых коэффициент распределения между гелевой и жидкой фазами приближается к единице. Во многих случаях компоненты смеси при хроматографическом разделении на сефадексах следуют в порядке уменьшения их молекулярных весов. Однако наблюдается иногда и специфическое сорбционное взаимодействие разделяемых веществ с матрицей сефадекса, что влечет за собой увеличение коэффициента распределения К и снижение скорости перемещения по колонке. Так, замедление движения хроматографических зон наблюдается у основных пептидов и аминокислот в основных растворителях и кислых аминокислот и пептидов в кислых растворителях. Наблюдается также повышение степени удерживания в колонке ароматических веществ при гельфильтрации [22]. Ряд белков, таких как рибонуклеаза, лизоцим, трипсин, бычий сывороточный альбумин, в отсутствие солей также сорбируется и удерживается сефадексом при хроматографии. В связи с этим целесообразно проводить элюирование на сефадексах растворами солей или кислот. [c.202]

Условия нанесения образца па ОФ-колонку существенно влияют на результаты фракционирования. При выделении пептидов для структурных исследований практикуется нанесение образцов в растворах, содержащих мочевину или Gu-H l. Это помогает растворить образцы, предотвращает агрегацию молекул, способствует адсорбции образца на носителе. Адсорбция образца, позволяющая нанести вещество ровным слоем и создать оптимальные условия для взаимодействий между подвижной фазой и растворенным веществом, является одним из важнейших условий успешного фракционирования полипептидов. При больших объемах наносимого образца повышается эффективность последующих хроматографических разделений. [c.213]

Для фракционирования пептидов используют различные методы колоночной хроматографии и ТСХ. Ранее мы уже знакомились с разделением пептидов гель-фильтрацией и обратнофазовой гидрофобной хроматографией. Нередко, если пептидов много, хроматографические методы следуют один за другим. Например, сначала пептиды разделяют на группы по размерам гель-фильтрацией, а затем следует ХОФ или ионообменная хроматография. [c.299]

Гидролиз химотрипсином проводят при 37° С в щелочной среде (pH 8,0—8,6). Отношение фермента к белку 1 100 (по весу). При длительном гидролизе фермент к субстрату добавляют двумя или тремя порциями. Природа буфера, используемого для гидролиза, зависит от характера последующей работы. При разделении пептидов гидролизата хроматографическими и электрофоретическими методами на бу- [c.140]

Неионообменная порошковая целлюлоза применяется в качестве носителя при распределительной хроматографии и электрофорезе на колонках и в слоях. Целлюлоза используется для хроматографического разделения сахаров, глицеридов, спиртов, фенолов, аминов, карбоновых и аминокислот, пептидов, белков, нуклеиновых кислот, уроновых кислот, липидов, алкалоидов, антибиотиков, гормонов, ферментов, витаминов, гербицидов и инсектицидов, неорганических ионов, красителей, углеводородов и других веществ. Применяется также для электрофореза белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов. [c.127]

В этой главе рассматривается жидкостная хроматография нитросоединений, мочевины и ее производных, гуанидинов, нит-розаминов, амидов, азосоединений и ароматических гидразосо-единений. Хроматография амидов описывается лишь кратко, так как практическая ценность хроматографического разделения пептидов и их смесей очень велика. Поэтому этим методам посвящена специальная глава [34]. Основной областью применения жидкостной колоночной хроматографии для других указанных соединений является отделение их от соединений других типов. Все современные методы хроматографии можно было бы с успехом применять для разделения разбираемых в этой главе соединений, однако до сих пор этому вопросу уделяли мало внимания. Интересный способ был разработан для нитросоединений, некоторые из них синтезируют непосредственно в хроматографической колонке, где они затем отделяются от других соединений реакционной смеси. [c.296]

Для выделения белков и пептидов, содержащих свободные 5Н-группы, целесообразно использовать высокое сродство меркапто-соединений к ионам тяжелых металлов, главным образом ртути. В табл. 11.1 дан ряд примеров выделения как белков, так и пептидов, основанного на образовании упомянутого комплекса. На рис. 6.10 приведены результаты выделения 5Н-протеазы из неочищенного экстракта бобов, осуществленного в колонке на оксиал-килметакрилатном геле, содержащем ртутное производное мета-криланилида [57]. 5Н-протеазу с оптимумом протеолитической активности при pH 8 можно выделить из смеси протеолетических ферментов этим способом за одно хроматографическое разделение. После удаления неактивного материала гель-фильтрацией через сефадекс 0-75 сразу получается гомогенная протеаза [58]. [c.124]

Ионообменная смола, обычно используемая для хроматографического разделения аминокислот, пептидов и несложных родственных им соединений, содержащихся в физиологических жидкостях, представляет собой сополимер стирола и дивинил-бензола в виде шариков. Смола, как правило, характеризуется процентным содержанием дивинилбензола или степенью поперечной сшивки, образующей трехмерную ароматическую сетку необработанного полимера. Для получения катионо- или анионообменной смолы в этот продукт необходимо ввести дополнительные функциональные группы. Для получения сильнокислотного катионита проводят сульфирование избытком серной или хлор-сульфоновой кислоты в присутствии катализатора при этом на каждые десять ароматических колец вводится 8—10 сульфо-групп. Путем хлорметилирования (хлорметиловый эфир) гранул необработанного полимера в присутствии катализатора с последующей обработкой третичным амином (триметиламин) получают сильноосновный анионит, имеющий четвертичные атомы азота. При введении функциональных групп в полимер чрезвычайно важно контролировать побочные реакции. Можно ввести сульфоновые поперечные мостики в сильнокислотный катионит и получить более сильно сшитый продукт. Повышенное сшивание можно наблюдать при синтезе анионитов в том случае, когда хлор хлорметильной группы одного кольца и водород соседнего кольца сближены [87]. Поэтому важно, чтобы процесс полимеризации и введение функциональных групп тщательно контролировались на хроматографическую воспроизводимость. Как указывалось выше, функциональной группой катионообменных смол является —SOsNa (когда используются натрийцит-ратные буферы), а анионообменных смол—группа—М(СНз)зОН . [c.18]

Конингсберг и Хилл ввели важное усовервгенствование в этот метод, а именно хроматографическое разделение очищенного деградированного пептида, что открыло возможность идентификации отщепленной N-концевой аминокислоты путем сравнения результатов аминокислотного анализа исходного и деградированного пептида. Благодаря этому реактив Эдмана занял теперь центральное место в арсенале средств, используемых для установления последовательности аминокислот. Определение концевой аминокислоты можно повторять многократно, идентифицируя один N-концевой остаток за другим (после того как будет отщеплен предыдущий). Теоретически так можно пройти по всей пептидной цепи, однако на практике приходится сталкиваться с трудностями, которые вынуждают ограничиться примерно пятью успешными определениями. [c.87]

После специфического расщепления полипентидных цепей и хроматографического разделения продуктов гидролиза следующей задачей оказывается определение аминокислотной последовательности для канедого из продуктов деградации. Обычно оно включает 1) определение аминокислотного состава каждого пептида, 2) определение N- и С-концевых групп и 3) дальнейшее расщепление (если это необходимо). [c.91]

Полипептидный гормон инсулин участвует в регуляции углеводного обмена. Молекула бычьего инсулина содержит 51 аминокислоту и состоит из двух цепей. Последнее подтвернедается присутствием двух N-концевых аминокислот — глицина и фенилаланина. Цепь с N-концевым глицином называется А-цепью и содержит 21 аминокислоту цепь с N-концевым фенилаланином называется В-цепью, и в состав ее входит 30 аминокислот. Сэнгер и его сотрудники окислили инсулин надмуравьиной кислотой и провели хроматографическое разделение двух цепей. После этого каждую цепь подвергли ферментативному и кислотному гидролизу. На фиг. 27 и 28 указаны главные пептиды, полученные при гидролизе каждой из цепей, и приведены полные структуры цепей, установленные на основе этих данных. Видно, что места, в которых трипсин, химотрипсин и пепсин расщепляют цепи, согласуются с тем, что мы знаем о специфичности этих ферментов в отношении синтетических соединений. Обнаружено также и несколько дополнительных мест расщепления, в частности при гидролизе, катализируемом пепсином. Особо следует обратить внимание на то, что перекрывающиеся пептиды, полученные при использовании разных гидролитических методов, дополняют друг друга и позволяют однозначно установить общую аминокислотную последовательность. Для каждого из главных пептидов, приведенных на фиг. 27 и 28, аминокислотная последовательность была определена путем неспецифического гидролиза кислотой, установления последовательности аминокислот в образовавшихся ди-, три- и тетрапептидах и объединения полученных данных в общую картину. Как указывалось выше, в настоящее [c.91]

Таким образом, описываемая конструкция анализатора, помимо регистрации выходной кривой, дает также дополнительную качественную характеристику разделенных пептидов. Однако эта характеристика бесполезна для определения чистоты фракции. С этой точки зрения значительно интереснее использование так называемого автоматического накапывательного устройства с проточной микропипеткой, изготовляемого опытными мастерскими Чехословацкой Академии наук. С помощью этого устройства небольшая часть фракции отделяется и автоматически закапывается на бумажный лист, намотанный на барабан, который при смене фракции автоматически поворачивается на определенный угол. После окончания опыта остается только провести хроматографическое разделение нанесенных на бумагу проб элюата и определить, таким образом, чистоту каждой фракции, собранной в пробирках коллектора. [c.176]

О возрастающем интересе к применению автоанализаторов Д.ЧЯ хроматографического разделения аминокислот, пептидов и белка свидетельствует работа бельгийских авторов [47]. В этой работе описывается применение автоанализатора для хроматографического разделения аминокислот. В автоанализатор вводится как один из блоков разделительная колонка с ионообменной смолой. Пропорциональный насос автоанализатора используется для прокачивания элюирующего раствора через колонку, подачи нингидринового реактива и циркуляции воды через рубашку разделительной колонки для ее термостатирования. В проточном реакторе автоанализатора проводится нингидриновая реакция. Автор работы указывает, что благодаря фрагментации элюата с помощью пузырьков азота удается использовать в реакторе широкую (2 мм) стеклянную капиллярную трубку, что исклю- [c.177]

Вследствие относительно высокой упругости паров соединений, содержащих фтор [50], газо-жидкостная хроматография применяется для разделения К-ТФА-эфиров ди-, три- и тетрапептидов, Газо-хроматографический анализ различных летучих производных коротких пептидов проводился рядом автором [51—56]. Бименом и Веттером, например, осуществлено хроматографическое разделение N-aцeтилиpoвaнныx аминоспиртов и полиаминов, полученных из лейцил-аланина, глицил-фенилаланина, фе-нилаланил-глицина, лейцил-аланил-пролина и лейцил-аланил-глицил-лейцина с последующим масс-спектрометрическим определением последовательности аминокислот в пептидных цепях [53]. Однако наибольшего успеха удалось достигнуть при применении, как и в случае разделения аминокислот, К-трифторацетилирован-ных метиловых эфиров (рис. 9). Указанный метод, по-видимому, имеет ограниченное применение при исследовании структуры пептидов [64] и степени рацемизации при их синтезе [55]. [c.267]

Фосфорильная группа присоединяется к энзиму необратимо и не удаляется диализом, при денатурации или гидролизе. Получив ДФФ-производное белка и осуществив гидролиз его, можно затем выделить пептид, к которому присоединен ДФФ. Задача облегчается, если берут ДФФ, меченный изотопом фосфора,— тогда из хроматографически разделенной смеси пептидов отбирается пептид, который обладает радиоактивностью. Проведя затем полный гидролиз этого пептида, можно установить аминокислотный состав активного центра фермента. С помощью этого приема, первоначально на химотрипсине, было показано, что ДФФ реагирует с ОН-группой одного из сериновых остатков [c.73]

Анализ этого типа состоит в параллельном ферментативном расщеплении сравниваемых белков и сопоставлении их электрохроматограмм. Для этого на угол большого листа хроматографической бумаги типа ватман № 3 наносится образец гидролизата, который затем подвергают электрофорезу при напряжении около 1,5—3 кв в пиридин-ацетатных или ацетат-формиатных буферных растворах. При этом исходная смесь разделяется на ряд фракций на основании различия электрохимических свойств соответствующих фрагментов белка. Однако полного разделения пептидных осколков электрофорез дать не может. Поэтому по окончании электрофореза лист высушивают и пятна подвергают хроматографическому разделению в перпендикулярном нгдрав-лении с использованием различных систем растворителей. По окончании хроматографии лист высушивают и опрыскивают раствором нингидрина пятна пептидов проявляются при кратковременном нагревании при 70° или при выдерживании листа в темноте в течение 12—24 часов. При соблюдении постоянства всех условий и стандартности материалов картина воспроизведения пептидных карт постоянна, и положения пятен от опыта к опыту совпадают с точностью от 3 до 5 мм. [c.82]

Перед хроматографическим разделением природных аминокислот, чтобы предотвратить размывание задней границы пятен и ее деформацию, иногда приходится удалять мешающие анализу вещества. Это в особенности относится к пробам мочи и гидролизатов белков или пептидов, содержащих большие количества солей. В настоящее время разработан и опробован ряд методов обессоливания а) электрофорез [3—5] б) обработка ионообменными смолами [6—11], сефадексом [12—14], нейтральными полистирольными смолами (поропак Q) [15—16], ионоудерживающими смолами [17, 18] и в) экстракция растворителями [19, 20]. Хискот и др. [18] сравнили степень извлечения аминокислот из ионоудерживающих смол био-рад АО 11А [c.478]

Ричард [187] разработал методику двумерного разделения пептидов в одном направлении проводится хроматографическое разделение пробы, в другом — электрофорез. Адсорбентом служит силикагель G перед опытом предварительно выявляют лучший растворитель при разделении ферментативного гидролизата белков. Автор методики приводит список восьми систем растворителей. В качестве нейтральных систем можно использовать н-пропанол или 96 %-ный этанол и воду (7 3) в качестве основных систем — н-пропанол или 96 %-ный этанол и 34 %-ный гидроксид аммония (7 3) или хлороформ—метанол— 34 %-ный гидроксид аммония (2 2 1). К кислым растворителям относятся н-пропанол или 96 %-ный этанол—вода—уксусная кислота (7 2 1) или н-бутанол—вода—уксусная кислота (4 1 1). После выбора лучшего растворителя пробу подвергают хроматографическому анализу на тонкослойной пластинке размером 200x200 мм. Разделение предпочтительно вести методом восходящей хроматографии, однако при неудовлетворительном разделении можно прибегнуть и к непрерывному хроматографированию по методике Бреннера и Нидервизера [188] либо применить усовершенствованный прибор, описанный Ричардом. Пластинки затем удаляют и после 10-минутной сушки при 100 °С охлаждают и опрыскивают соответствующим буфе- [c.515]

Имеется, естественно, много методов хроматографического разделения, принципы которых будут рассмотрены в разделе, посвященном пептидам (стр. 151). Здесь же, чтобы не перегружать изложения, мы обсудим только вопрое о распределительной хроматографии, значение которой все еще возрастает. Мур и Штейн недавно описали обший метод разделения аминокислот, пептидов и белков посредством их элюирования из колонки, заполненной ионообменной смолой дауэкс-50 (сульфированной полкстирольной смолой) [2656, 268]. [c.138]

Хроматографическое разделение пептидов было рассмотрено в ряде обзоров [329, 353]. Его принципы идентичны с принципами хроматографичеокого разделения аминокислот. [c.151]

Все описанные до сих пар хроматаграфические. методы вначале испытывались на смесях аминокислот, а затем уже применялись для разделения пептидов. Другой /аспект этой проблемы — распространение на пептиды тех методов, которые начинают оправдывать себя в хроматографии белков, — до сих пор еще мало изучен. Разрешение этой задачи, возможно, позволит осуществить хроматографическое разделение крупных пептидов, которое в настоящее время производится с мало удовлетворительными результатами. [c.156]

Природа пептидов, выделяющихся при превращении яичного альбумина в плакальбумин, была изучена Оттесоном и Вилли [151 г]. Применив хроматографическое разделение на колонке с крахмалом, эти исследователи обнаружили три пептида, обозначенные ими как А, В и С. Пептид А оказался гексапептидом, в состав которого входят аминокислоты аланин, валин, глицин и аспарагиновая кислота в соотношении 3 1 1 1. Пептид В представляет собой тетрапептид, состоящий из тех же аминокислот [c.333]

Главное требование, предъявляемое к методикам хроматографического анализа пептидов, заключается в том, чтобы они позволяли разделять близкородственные аналоги. По традиции разделение олигопептидов проводят методом ионообменной или тонкослойной хроматографии. Однако разработанный позднее метод ВЭЖХ позволяет следить за ходом реакций, контролировать чистоту синтетических пептидов, изучать пути метаболизма. а также осуществлять препаративное разделение смесей. В силу полярности незащищенных пептидов их разделение на силикагеле сопряжено со значительными трудностями [142— 144], поэтому чаще всего пептиды разделяют в виде их производных. [c.59]

Обратнофазовую гидрофобную хроматографию исноль.зуют обычно для разделения относительно мелких пептидов, наиример трипсиновых гидролизатов белка. Ввиду наличия в составе пептидов как гидрофобных, так и гидрофильных аминокислотных остатков их взаимодействие с гидрофобизированной матрицей оказывается не слишком сильным, и в практике встречаются режимы хроматографической элюции, сходные с оппсапными для ФТГ-АК. [c.201]

Рассмотрение принципа действия и особенностей использования аминокислотного анализатора начнем с того, что сформулируем представления об анализируемом препарате. Для наиболее интересного случая — анализа состава белка — им является смесь 20 природных аминокислот. Все компоненты этой смеси представляют одинаковый интерес, подлежат полному разделению и количественной оценке. Интервал. молекулярных масс простирается ог 75 (Gly) до 204 (Тгр), диапазон значений р1 — от 2,97 (Glu) до 10,76 (Arg). Различия в стеиени гидрофобности тоже выражены сильно от гидрофильных дикарбоновых и оксикислот до весьма гидрофобных, несущих довольно протял<енные алифатические и ароматические боковые группы. Заметим сразу, что такие различия должны облегчить задачу хроматографического разделенпя, но вряд лн позволят обойтись без ступенчатой смены элюентов. В обычных условиях хроматографии все алшнокислоты достаточно устойчивы, но следует обратить внимание с этой точки зрения и на предшествующий хроматографии этап исчерпывающего гидролиза белков и пептидов (от него будут зависеть и результаты анализа). Агрегация аминокислот маловероятна, за исключением возможности окисления цистеинов до цистинов. Не-специфическая сорбция за счет гидрофобных взаимодействий с материалом матрицы безусловно возможна, но здесь она будет использоваться в интересах фракционирования. [c.515]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология