Денатурация термодинамика

Термодинамика и кинетика денатурации. ... Рекомендуемая литература. . . ...... [c.4]

Термодинамика и кинетика денатурации [c.191]

Термодинамика процесса денатурации довольно своеобразна. Происходящее при денатурации нарушение различных связей, определяющих конформацию полипептидных цепочек, приводит к большей их подвижности. Возрастает число возможных вариантов формы и расположения полипептидных цепочек в пространстве. Пользуясь терминологией статистической тер мо-динамики, можно сказать, что возрастает число возможных микросостояний системы и, следовательно, увеличивается вероятность системы. Как известно, это выражается возрастанием [c.191]

В заключение необходимо обратить внимание на те трудности, которые возникают при изучении термодинамики и кинетики реакции денатурации из-за необратимости этого процесса для большинства белков. Известны лишь немногие случаи обратимой денатурации — например, для трипсина, химотрипсина, рибонуклеазы и ингибитора трипсина. Не следует думать, что немногочисленность известных случаев обратимой денатурации—это лишь следствие недостаточности наших знаний об условиях обращения процесса для большинства белков. Напротив, необратимость денатурации белков, построенных относительно более сложно и менее жестко , чем перечисленные выше, является закономерным следствием ничтожной вероятности полного восстановления чрезвычайно сложной системы связей, стабилизирующих конформацию полипептидных цепочек в нативной молекуле. Однако при рассмотрении обратимых реакций термодинамические и кинетические характеристики наиболее доступны и полнее выявляются. Возможно поэтому, что особый интерес представит в будущем выявление и исследование промежуточных состояний денатурируемого белка, сколь бы кратковременно ни было их существование. [c.193]

Из сказанного выше ясно, что процесс денатурации можно рассматривать как со статистической, так и с энергетической точки зрения. Энергетика денатурации может быть исследована количественно на основании законов термодинамики. Согласно второму закону термодинамики, для каждой реакции верно следующее уравнение [c.157]

Термодинамические аспекты. Изучение денатурации привело в начале 1970-х годов к доказательству того, что сборка трехмерной структуры глобулярных белков представляет собой самопроизвольно протекающий, быстрый и безошибочный процесс. Утвердилось представление, что он термодинамически обратим, относится к переходам первого ряда и описывается равновесной термодинамикой и статистической физикой. Нативное состояние белка имеет наименьшую свободную энергию Гиббса, т.е. является глобальным, в физиологических условиях, а термодинамически устойчивое состояние статистического клубка глобально в условиях полной денатурации. [c.348]

Тепловую денатурацию белка можно представить как реакцию пер-вого порядка с константой скорости, подчиняющейся обычным законам термодинамики. Так, константа скорости у ден связана с температурой следующим уравнением [c.84]

Имеется еще одно возражение против гипотезы о расплавленной глобуле, использующейся вместе с аппаратом равновесной термодинамики и формальной кинетики для объяснения экспериментальных фактов. Конкретной теоретической основой интерпретации данных о денатурации служит термодинамическая теория двух состояний Брандтса [12, 13]. Как уже отмечалось, белковая молекула в растворе, согласно этой теории, может быть представлена большим количеством микросостояний. Все они входят в состав либо распределения N (нативное макросостояние белка), либо О (денатурированное макросостояние). Теория Брандтса сделала возможным относительно простой термодинамический анализ конформа-ционного перехода N — О в предположении, что реализующиеся микросостояния не являются чем-то вновь созданным, а присутствуют в распределении N и О. Это означает, что в теории постулируется отнюдь не очевидное положение об отсутствии новых промежуточных конформационных состояний в области перехода N - О. Следовательно, главный критерий справедливости теории двух состояний Брандтса состоит в требовании отсутствия максимумов, минимумов и потенциальных ям в наблюдаемых изменениях энтальпии и энтропии при переходе от О к N (и наоборот). Иными словами, если образование трехмерной структуры белка происходит, как того требует теория двух состояний, путем постоянного усложнения и приближения к нативному состоянию, то изменения энтальпии, энтропии и свободной энергии по ходу ренатурации должны быть монотонными. Отсутствие экстремумов означает отсутствие между нативной структурой и статистическим клубком метастабильных промежуточных состояний. Механизм сборки белка проходит в этом случае в одну стадию. А теперь обратимся вновь к обсуждаемой гипотезе о расплавленной глобуле в которой постулируется образование на пути к нативной структуре близкое к ней промежуточное состояние. При существовании достаточно устойчивых обнаруживаемых экспериментально интермедиатов зависимости изменений энтальпии, энтропии и свободной [c.85]

В тех случаях, когда биофизика изучает биомолекулы in vitro, применимы представления равновесной термодинамики, и в этом смысле исследование денатурации белка не отличается дт исследования любого физико-химического процесса в нежи- [c.48]

В первые на поли-у-бензил-Ь-глутамате было показано, что переход спираль — клубок можно проследить достаточно эффективно, пользуясь методом измерения оптического вращения [80]. Этот конформационный переход обычно совершается в присутствии добавок, которые способствуют ослаблению водородных связей, стабилизирующих спиральную структуру. Например, в смешанных растворителях, состоящих из дихлорэтана (растворитель, способствующий образованию спирали) и дихлоруксусной кислоты (способствующей образованию конформации клубка), этот полипептид претерпевает обратимый переход первого рода при содержании кислоты в смеси приблизительно 76 об. % (или 80 вес. о) (рис. 58). Такой резкий переход наблюдали также и в случае других пар растворителей он может даже происходить при добавлении небольших количеств нерастворителя, например воды, к раствору полипептида в хорошем растворителе задолго до осаждения полипептида (Доти и Янг, неопубликованные данные). Конформационный переход можно осуществить, не изменяя состав растворителя, просто понижением или повышением температуры раствора, состав которого близок к составу, при котором наблюдается переход в нормальных условиях. Более ярко конформационный переход показан на рис. 59, на котором приведены дисперсионные кривые, нормальная для конформации клубка и аномальная для спиральной формы. (Направление перехода в этом случае противоположно направлению аналогичного перехода при денатурации белков в последнем случае повышение температуры способствует возникновению разупорядоченной формы. Причину этого обращения направления конформационного перехода можно объяснить исходя из данных по термодинамике [80].) Поскольку а-спирали стабилизованы кооперативным влиянием водородных связей, можно ожидать, что резкость перехода должна зависеть от молекулярного веса и распределения по молекулярным весам полипептида, что в действительности было обнаружено для поли-у-бензил-Ь-глутаматов [80]. Кроме того, было показано, что включение в Ь-полипептид небольшого количества В-остатрюв приводит к ослаблению спиральной конформации, в результате чего при увеличении количества О-остатков до [0/(Ь + О) С 0,5] точка перехода сдвигается в направлении меньшей объемной доли дихлоруксусной кислоты [81]. [c.113]

Рассмотренные модели белкового свертывания содержат ряд общих черт принципиального порядка, наличие которых совершенно неизбежно при изучении явления методами статистической физики и равновесной термодинамики. Во всех модельных описаниях динамики белковой цепи предполагают равновесность и двухфазность процесса, т.е. основываются на теории двух состояний Брандтса [214] (подробно см. гл. 11). В подтверждение этому обычно ссылаются на работы 1960-х и начала 1970-х годов, посвященные экспериментальному исследованию механизма денатурации малых белков. Однако единство моделей в этом отношении отнюдь не следует из существования однозначной трактовки результатов эксперимента. Напротив, большая часть опытных данных, особенно полученная позднее, свидетельствует о более сложном характере процесса. Дело в том, что предположение о двухфазном равновесном механизме свертывания белковой цепи становится неизбежным при выборе чисто статистического, феноменологического подхода, не учитывающего конкретную гетерогенность аминокислотной последовательности и обусловленную ею конформационную специфику. Кроме того, представление белкового свертывания в виде монотонного увеличения популяции одного оптимального состояния при одновременном, точно таком же уменьшении популяции другого оптимального состояния и при отсутствии видимого количества промежуточного метастабильного состояния накладывает существенное ограничение на предполагаемую динамику процесса и упрощает его рассмотрение. В этом простейшем варианте свертывания белковой цепи профиль популяции ( У) выражается зависимостью свободной энергии от степени упорядоченности, имеющей больцмановский вид 1п . Другая общая черта касается представления о нативной конформации белковой молекулы. Во всех моделях важнейшей характеристикой упорядоченного состояния белка считается глобулярность его пространственной организации. Под глобулой подразумевается структура, удовлетворяющая следующим двум условиям. Во-первых, размер глобулы значительно превышает эффективное расстояние действия сил, ее формирующих. Это условие позволяет выразить свободную энергию глобулы через ее объем и поверхность. Во-вторых, глобула предполагается структурно гомогенной, что избавляет от учета гетерогенности белковой цепи и неравномерности упаковки аминокислотных остатков в нативной конформации. [c.301]

Для познания принципов структурной организации белковых молекул огромный интерес представляет явление денатурации. Переход нативной конформации белка в развернутую неструктурированную форму и обратный переход флуктуирующей полипептидной цепи в исходную компактную трехмерную структуру есть не что иное, как непосредственный процесс разрушения и формирования именно тех самых взаимодействий, которые и обусловливают структурную организацию белковой молекулы. Иными словами, при свертывании и развертывании полипептидной цепи проявляется прямая связь между химическим и пространственным строением белка. Изучение денатурации позволило сформулировать фундаментальное положение о том, что нативная конформация белковой молекулы отвечает термодинамически равновесному состоянию. Ее свободная энергия является функцией состояния и как таковая не зависит от конкретного пути свертывания белковой цени (in vivo или in vitro), т.е. от предыстории, а определяется только составом и порядком расположения аминокислот в последовательности. Трансляция линейной информации в трехмерную структуру возможна, однако только при определенных физиологических условиях (температура, давление, pH, ионная сила, наличие простетических групп, ионов металлов и т.д.). При соблюдении этих условий процесс свертывания полипептидной цепи осуществляется спонтанно принятие белком нативной конформации не требует какого-либо морфогенетического молекулярного аппарата. Самопроизвольный характер процесса, подчиняющегося второму началу термодинамики, свидетельствует о том, что сборка компактной структуры белка сопровождается понижением свободной энергии Гиббса системы, включающей свертываемую полипептидную цепь и среду. [c.338]

При исследовании термодинамики и кинетики денатурации рибонуклеазы А Т. Тсонг и соавт, [53] столкнулись с парадоксальной ситуацией, впрочем, уже встречавшейся при изучении денатурации цитохрома с. С одной стороны, термодинамика свертывания белка в нейтральной среде показывает отклонение, а в кислой — близкое соответствие двухфазному процессу (М О). С другой стороны, кинетика развертывания рибонуклеазы А в этих условиях свидетельствует об обратном. Попытка объяснить наблюдаемое несоответствие термодинамических и кинетических данных привела Тсонга и соавторов к разработке так называемой постадийной модели свертывания и развертывания белка, претендующей на обобщение известных фактов о денатурации. [c.355]

После обнаружения целой гаммы промежуточных состояний на пути от полностью денатурированного белка к нативному Крейтон детально изучил кинетику изменений и взаимопревращений этих состояний в ходе свертывания и развертывания белковой цепи. Далее он выяснил оптимальные условия моментальной остановки процесса ренатурации БПТИ и гашения тиол-дисульфидной реакции обмена, а затем разработал способы фиксации и выделения промежуточных состояний, определения у них количества дисульфидных связей и мест их локализации в аминокислотной последовательности БПТИ. Таким образом, последующее изучение денатурации белка, а именно получение количественных данных о кинетике и термодинамике всех этапов процесса и доказательное описание механизма самоорганизации пространственной структуры белка in vitro, имеет серьезную основу, созданную Крейтоном в результате огромной целенаправленной подготовительной работы. [c.367]

Термодинамика процесса денатурации лизоцима, как и некоторых других белков, была детально охарактеризована П.Л. Приваловым [40]. В его работе с У. Пфейлем была обнаружена высокая чувствительность энтальпии и энтропии развертывания белковой цепи к температуре, что, согласно закону Кирхгофа, должно свидетельствовать о различии в теплоемкостях свернутого и развернутого состояний [100]. Это видно из рис. III.13, где представлены зависимости эн-тальпийных (Н°) и энтропийных (TS°) вкладов в свободную энергию свернутой и развернутой форм лизоцима. Более высокое значение теплоемкости развернутого состояния, по мнению Привалова, Пфейля и других исследователей [100-103], связано прежде всего с температурнозависимым упорядочением молекул воды вокруг неполярных остатков, более доступных в этом случае. На рис. 111.13 показаны также температурная зависимость свободной энергии Гиббса (G°) двух состояний и температурная зависимость разности ДО = [c.379]

Привлечение к проблеме свертывания белка сайт-направленного мутагенеза и использование уравнений равновесной термодинамики и формальной кинетики позволили Фершту и соавт. предпринять попытку решить две задачи. Первая из них основывалась на опытных значениях констант равновесия и заключалась в определении вызванных мутациями изменений в стабильности основных состояний белковой цепи. Ее цель состояла в установлении эмпирических соотношений между глобальной свободной энергией и энергией невалентных взаимодействий боковых цепей в различных областях белковой глобулы [133]. Вторая задача исходила из результатов кинетических измерений процессов свертывания и развертывания нативного белка и мутантов и имела цель обнаружить изменения энергии промежуточных состояний и энергии активации (рис. П1.16). Различия в энергетических уровнях промежуточных (AAGj) и переходных (ДДО ) состояний помогали определить их положения на пути структурной самоорганизации белковой цепи. При этом каждая аминокислотная замена служила своеобразной репортерской меткой наблюдаемого изменения, происходящего на мутированном участке по ходу ренатурации или денатурации. [c.390]

Термодинамика плавления природных ДНК значительно сложнее термодинамики плавления модельных олигонуклеотидов, поэтому кинетика денатурации и ренатурации ДНК также должна быть более сложной. Действительно, некоторые аспекты этого процесса до сих пор не вполне понятны, хотя в течение пятнадцати последних лет в этой области ведутся интенсивные исследования. Представление об основных трудностях, которые встречаются при анализе этого процесса, дает рис. 23.14. В случае коротких олигомеров для описания большинства наблюдаемых результатов достаточно учесть лишь нуклеа-цию и рост спиральной области. При анализе денатурации ДНК следует принять во внимание образование и слияние петель, происходящее из-за крупномасштабной гетерогенности по нуклеотидному составу. Плавление коротких олигомеров полностью обратимо, чего нельзя сказать о модельных полинуклеотидах. Изменение их оптических свойств при плавлении действительно обратимо, для гидродинамических же свойств наблюдается гистерезис,(гл. 22) [c.341]

Большая величина ЯактСАЯ ) в приведенном уравнении — это именно то, что отличает тепловую денатурацию белков от обычных химических процессов. Поэтому с изменением температуры скорость денатурации изменяется очень быстро. Величину АО можно рассчитать на основе теории абсолютных скоростей реакций. При скорости денатурации в пределах 10 —величина ДОФ составляет около 80 кДжХ Хмоль-. Так как ДЯ Ф АОФ+7 А5Ф, а величина ДЯФ обычно лежит в пределах 300—500 кДж мoль- из этого следует, что Д5Ф имеет необычно большую величину, лежащую между 200 и 1000 Дж-град- Х Хмоль- Этот факт имеет очень простое объяснение. В начале денатурации происходит разрыв множества связей, значительные конформационные перестройки белка и высвобождение ассоциированных молекул растворителя, что сопровождается увеличением энтропии, т. е. возрастанием степени неупорядоченности. Величина Д5 для процесса денатурации в целом, при полной неупорядоченности полипептидных цепей, может составлять несколько тысяч Дж-град- моль Процесс денатурации может включать несколько стадий, идущих по различным альтернативным путям, однако для описания всего процесса в целом с точки зрения термодинамики необходимо знать только величину энергии активации самой медленной стадии. Такой стадией обычно является первая стадия процесса. [c.84]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология