Хроматография разделение пептидов

Для фракционирования пептидов используют различные методы колоночной хроматографии и ТСХ. Ранее мы уже знакомились с разделением пептидов гель-фильтрацией и обратнофазовой гидрофобной хроматографией. Нередко, если пептидов много, хроматографические методы следуют один за другим. Например, сначала пептиды разделяют на группы по размерам гель-фильтрацией, а затем следует ХОФ или ионообменная хроматография. [c.299]

При выборе методов разделения пептидов учитывают физ.-хим. свойства, кол-во и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционирования смесей коротких пептидов, содержащих до 15-20 аминокислотных остатков, в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах. Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля. [c.251]

Только благодаря появившимся в начале 40-х годов новым методам, вопрос об определении аминокислотного состава получил свое полное и окончательное разрешение. В настоящее время основными способами такого определения являются следующие 1) распределительная хроматография 2) ионофорез 3) электрохроматография 4) ионообменная хроматография и 5) противоточное распределение. Последним методом пользуются главным образом при разделении пептидов. Метод распределительной хроматографии на бумаге, разработанный в 1941 г. Гордоном, Мартином и Синджем, положил начало новой эры в развитии химии белка. [c.479]

Для предварительного разделения пептидов на фракции часто применяют так называемый четырех- или пятикамерный электрофорез. Он позволяет отделить основные, кислые н нейтральные пептиды друг от друга. Каждую из фракций можно подвергнуть затем разделению яри помощи ионообменной хроматографии, микропрепаративным электрофорезом на бумаге или противоточным распределением, ограничиваясь при этом несколькими миллиграммами вещества. В качестве примера представлена схема разделения химотрипсиногена, проведенная Шор-мом с сотрудниками (см. схему на стр. 517). Прекрасные результаты дает метод Хирса, Мура и Штейна— автоматическое разделение пептидов на смоле Дауэкс-50. Строение пептидов, полученных в результате разделения, устанавливают. описанными выше методами. [c.519]

Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол-уксусная кислота-вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами. [c.28]

Рис. Ч. Разделение пептидов методом ионообменной хроматографии.

Адсорбционную хроматографию на угле, крахмале и других классических сорбентах вообще не применяют для разделения пептидов. Этот метод представлен здесь аффинной хроматографией, основанной на биоспецифической сорбции. Правда, аффинную хроматографию в основном применяют при выделении белков, однако метод может оказаться полезным при изучении физиологически активных пептидов. [c.390]

В данном разделе приведено несколько примеров разделения пептидов методом гель-проникающей хроматографии. [c.397]

Ионообменная хроматография является важнейшим и наиболее широко применяемым методом разделения пептидов. В обширной литературе и в ряде обзоров можно найти подробные описания техники эксперимента и многочисленных модификаций метода. В данном разделе приведены краткие сведения о применяющихся ионитах, а также ряд примеров, демонстрирующих возможности метода. [c.402]

Наиболее наглядным примером разделения пептидов методом распределительной хроматографии на сефадексе G-25 является выделение трех главных компонентов актиномицина С (актиномицинов i, Сг и Сз) (фиг. 40). Здесь также вначале готовили гель [c.196]

Ионообменная хроматография позволила проводить адсорбцию органических катионов, нанример алкалоидов, разделение смесей кислых, нейтральных и основных аминокислот, анионов различных органических кислот, антибиотиков, очистку сахаров, углеводородов, многоатомных спиртов и антибиотиков от катионов и анионов, разделения пептидов и белковых веществ. [c.197]

Разделение пептидов с помощью ионообменной хроматографии 169 [c.124]

Рнс. 12.25. Разметка листа бумаги и результаты разделения пептидов методом двухмерной хроматографии [82]. [c.333]

Более быстрым методом разделения пептидов энзиматического гидролизата является метод пептидных карт ( отпечатка пальцев , или фингерпринта ), сочетающий высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге. С помощью этого метода возможно сопоставление пептидных смесей, получаемых при расщеплении различных белков, и выявление столь малых различий в аминокислотном составе отдельных пептидов, как замещение единичной аминокислоты какой-либо другой. Такие различия имеют большое значение при сравнительном изучении гомологичных белков различных видов растений и животных, а также прй определении генетических изменений в структуре белка, возникающих в результате точечной мутации. [c.81]

Метод ионообменной хроматографии является наиболее совершенным приемом разделения пептидов. Как и при хроматографии аминокислот, для этой цели используют полистирольные смолы типа Дауэкс, причем тип избираемой смолы (анионо- или катионообменник) зависит от характера разделяемых пептидов. Хроматографию кислых и нейтральных пептидов лучше проводить на сильных анионообменниках (Дауэкс-1, активная ионогенная группа — четвертичное аммониевое основание), тогда как [c.83]

В ходе очистки вслед за электрофорезом при разных значениях pH для разделения пептидов применяется хроматография набумаге. [c.38]

На пластинке Фиксион 50x8 изомеры-трипептиды Гли-L-Ала-Ь-Лей и Гли-О-Ала-Ь-Лей разделяются довольно хорошо. По интенсивности пятен разделенных пептидов можно оценить степень рацемизации препарата. Хроматографию проводят на уравновешенных пластинках в буферном растворе Е (табл. 10), т. е. во втором буферном растворе одноколоночной системы анализатора. Для получения оптимального разделения на пластинку наносят 10 мкл раствора образца в 0,01 н. НС1 (концентрация пептида 10 мг/мл). Хроматографируют при комнатной температуре до высоты 12—15 см. Если требуется количественно определить степень рацемизации (с точностью 5—10%), применяют денситометрию тонкослойных хроматограмм. Для получения более точных результатов целесообразно воспользоваться автоматическим анализатором. [c.261]

Для аналитических и препаративных разделений пептидов и белков применяются такие гидрофильные полимерные материалы, как полидекстрины. В эксклюзионной хроматографии используют пористые полимеры с широкими порами. Эксклюзионная хроматография с органическими элюентами называется гель-проникающей хроматографией и применяется для разделения полимеров. Эксклюзионная хроматография с водными элюентами — гель-фильтрационная хроматография — используется для разделения биомолекул. [c.312]

В этой главе рассматривается жидкостная хроматография нитросоединений, мочевины и ее производных, гуанидинов, нит-розаминов, амидов, азосоединений и ароматических гидразосо-единений. Хроматография амидов описывается лишь кратко, так как практическая ценность хроматографического разделения пептидов и их смесей очень велика. Поэтому этим методам посвящена специальная глава [34]. Основной областью применения жидкостной колоночной хроматографии для других указанных соединений является отделение их от соединений других типов. Все современные методы хроматографии можно было бы с успехом применять для разделения разбираемых в этой главе соединений, однако до сих пор этому вопросу уделяли мало внимания. Интересный способ был разработан для нитросоединений, некоторые из них синтезируют непосредственно в хроматографической колонке, где они затем отделяются от других соединений реакционной смеси. [c.296]

Описаны методы ступенчатого [99] и градиентного элюирования [134] пептидов с использованием анионообменной смолы. Сильноосновный анионит дауэкс 1-Х2 с низкой сшивкой был использован в дополнение к методике разделения пептидов на катионите. Эта низкосшитая смола имеет недостаток она сильно сжимается, что приводит к резкому повышению рабочего давления на колонке. Часто это вызывает необходимость повторной набивки колонки. Анионообменники к тому же имеют ограниченный срок службы, поскольку из-за нестабильности функциональных групп — третичных и четвертичных аммониевых оснований — меняется профиль элюирования хроматографических пиков. Некоторые из этих недостатков удалось устранить, применяя полученную сравнительно недавно анионообменную смолу типа 1-5 [92], которая была использована для хроматографии нейтральных сахаров. [c.37]

Колоночная хроматография на иопообмеиных смолах применяется также и для фракционирования пептидов. После первых относительно малоуспешных работ по разделению пептидов на смоле Дауэкс 50X8 стали использовать для этих целей менее сшитую смолу Дауэкс 50X2, пористость которой лучше соответствовала размерам молекул пептидов. На этой смоле был проведен ряд успешных работ Хирса, Мура и Штейна [36, 37] по разделению ферментативных гидролизатов окисленной рибонуклеазы. Однако общим недостатком этих работ являлось использование солевых буферных растворов, что приводило к необходимости их последующего удаления из элюатов. Последнее осуществлялось или путем динитрофенилирования и экстракции полученных ДНФ-производных пептидов с помощью органических растворителей [38], или путем использования в качестве буферов растворов ацетата или формиата аммония, которые удалялись сублимированием или заменой натрия в элюатах на аммоний путем ионного обмена на сильно сшитой смоле в аммониевой форме с последующим удалением аммониевых солей путем сублимации [39]. [c.169]

Процесс хроматографии пептидов, для регистрации которых использован описанный выше двойной автоматический анализатор, также усовершенствован. Разделение пептидов производят на колонке 100x0,6, наполненной сульфополистиролом с 4% поперечных связей и размером частиц 20—22 мк (Te hni on romobead D) при температуре 38° и скорости элюирования 0,42 мл мин. [c.176]

Хроматография гидролизатов проводилась при +4° С на колонке с фосфоцеллюлозой 2,4x25 см со скоростью 60 мл/час. Химотрипсиновый гидролизат лизоцима фракционировался с возрастающим градиентом pH аммонийно-ацетатного буфера от 3,4 до 9,0 и возрастанием концентрации от 0,02 до 0,3 М. Пепсиновый гидролизат фракционировался с возрастанием pH пиридин-ацетат-ного буфера от 3,9 до 5,4 и возрастанием концентрации от 0,05 до 0,45 М. Фракционирование по такой схеме дает очень хорошее групповое разделение пептидов (до 3—6 пептидов в одном пике). Сопоставление таких групп, полученных действием разных ферментов, позволяет составить полную аминокислотную последовательность исходного белка. [c.185]

Другой пример разделения ферментативного гидролизата лизоцима можно найти в работе Жолле [7]. В своей обзорной статье он подробно разбирает возможности ионообменных смол и целлюлозных ионитов для хроматографии пептидов и приводит примеры разделения пептидов, полученных гидролизом ряда белковых объектов, на целлюлозных сорбентах. [c.185]

Из других работ по хроматографии пептидов на целлюлозных сорбентах следует назвать работы по выделению активных фрагментов из автолизата пепсина на ДЭАЭЦ и КМЦ [9] по разделению пептидных цепей фибрина [10] по разделения В- и С-цепей а-химотрипсина [И] по разделению пептидов из ферментативного [c.185]

Двумерные разделения в настоящее время выполняются почти исключительно на бумаге, хотя известны подобные разделения на геле и комбинированные — на бумаге и геле. Ниже мы кратко опишем процедуру двумерного разделения на бумаге, не касаясь принципов методов хроматографии и электрофореза (см. соответствующие статьи настоящего сборника, а также работы [1, 2]), а затем приведем примеры применения двумерных методов разделения на бумаге. При разделении пептидов обычно используется Whatman 3 ММ или хроматографическая бумага с номи- [c.234]

Метод пептидных карт на одном листе бумаги сейчас следует рассматривать скорее как аналитический, чем как препаративный. При препаративном разделении пептидов в тех же условиях обычно смесь пептидов последовательно разделяется методами электрофореза и хроматографии в несколько приемов, каждый раз нанося пробу во всю ширину бумаги. После проведения электрофореза вырезают полосы бумаги таким образом, чтобы в середине и по трем краям оставались узкие полоски бумаги. После проявления этих полосок нингидрином вырезанные полосы вставляются обратно, и на них карандашом отмечаются пептидные зоны. Пептиды соответствующих зон с нескольких листов бумаги после смывания объединяются и хроматографируются опять же на полном листе (каждая объединенная зона отдельно). Подобные трудоемкие операции связаны с необходимостью иметь достаточное количество вещества для дальнейшего анализа. Повышение чувствительности методов анализа концевых групп даст возможность определять всю аминокислотную последовательность пептида после получения пептидной карты на одном листе бумаги. Для анализа К-концевых аминокислот уже разработан [8] флуоресцентный метод с 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлЬри-дом, который в сто раз чувствительнее (достаточно 10 — 10" мкмоль пептида) обычно используемого метода с динитро-фторбензолом [9]. [c.237]

Электрофорез аминокислот и пептидов на бумаге проводили методом Михля с охлаждением инертными жидкостями [69], который может быть успешно использован даже для получения пептидных карт. Примеры разделения пептидов приведены на рис. 12.25, а состав буферов для разделения —в табл. 12.13. Аминокислоты и пептиды разделяли также методом электрофореза в тонком слое целлюлозы [28] и силикагеля [42]. В этом методе хроматография (в основном ТСХ) предшествует электрофорезу, который применяется для анализа во втором направлении (см. табл. 12.5). [c.333]

Фракционирование пептидов на ионообменных смолах основано на целом ряде принципов, о которых уже говорилось выше (гл. I и II). Сюда входят и различия в электрохимических свойствах разделяемых фрагментов, и различное сродство неполярных радикалов к бензольным кольцам матрицы смолы, и изменение концентрации конкурирующих ионов в буферном растворе. Поэтому элюция пептидов со смолы достигается путем пропускания через колонку буферных растворов изменяющейся ионной силы и pH. Это изменение концентрации ионов и pH может осуществляться линейно или ступенчато. Элюируемые компоненты идентифицируют нингидриновой колориметрией, лиофилизуют (высушивают из замороженного состояния) и проверяют на гомогенность с помощью хроматографии на бумаге и методом пептидных карт. Негомогенные пики фракционируют дополнительно. В качестве примера можно привести разделение пептидов, полученных триптическим гидролизом окисленной (т. е. лишенной дисульфидных мостиков) рибонуклеазы (рис. 11). [c.84]

Ричард [187] разработал методику двумерного разделения пептидов в одном направлении проводится хроматографическое разделение пробы, в другом — электрофорез. Адсорбентом служит силикагель G перед опытом предварительно выявляют лучший растворитель при разделении ферментативного гидролизата белков. Автор методики приводит список восьми систем растворителей. В качестве нейтральных систем можно использовать н-пропанол или 96 %-ный этанол и воду (7 3) в качестве основных систем — н-пропанол или 96 %-ный этанол и 34 %-ный гидроксид аммония (7 3) или хлороформ—метанол— 34 %-ный гидроксид аммония (2 2 1). К кислым растворителям относятся н-пропанол или 96 %-ный этанол—вода—уксусная кислота (7 2 1) или н-бутанол—вода—уксусная кислота (4 1 1). После выбора лучшего растворителя пробу подвергают хроматографическому анализу на тонкослойной пластинке размером 200x200 мм. Разделение предпочтительно вести методом восходящей хроматографии, однако при неудовлетворительном разделении можно прибегнуть и к непрерывному хроматографированию по методике Бреннера и Нидервизера [188] либо применить усовершенствованный прибор, описанный Ричардом. Пластинки затем удаляют и после 10-минутной сушки при 100 °С охлаждают и опрыскивают соответствующим буфе- [c.515]

На следующем этапе исследования белок подвергают ферментативному гидролизу на пептиды, например под действием трипсина, химотрипсина и пепсина. Разделение пептидов осуществляют с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге. Затем, пользуясь ДНФБ-методом, определяют аминокислотную последовательность, начиная с Ы-конца. [c.289]

Все описанные до сих пар хроматаграфические. методы вначале испытывались на смесях аминокислот, а затем уже применялись для разделения пептидов. Другой /аспект этой проблемы — распространение на пептиды тех методов, которые начинают оправдывать себя в хроматографии белков, — до сих пор еще мало изучен. Разрешение этой задачи, возможно, позволит осуществить хроматографическое разделение крупных пептидов, которое в настоящее время производится с мало удовлетворительными результатами. [c.156]