Пептиды гель-фильтрация

Для качественного и количественного определения аминокислот используют гель-фильтрацию, бумажную, тонкослойную, ионообменную и газовую (для сложных эфиров) хроматографию. Эти методы очень важны для установления последовательности аминокислот в пептидах и белках. [c.345]

Гель-фильтрация белков и пептидов 227 [c.227]

Для фракционирования пептидов используют различные методы колоночной хроматографии и ТСХ. Ранее мы уже знакомились с разделением пептидов гель-фильтрацией и обратнофазовой гидрофобной хроматографией. Нередко, если пептидов много, хроматографические методы следуют один за другим. Например, сначала пептиды разделяют на группы по размерам гель-фильтрацией, а затем следует ХОФ или ионообменная хроматография. [c.299]

Глава X ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ [c.220]

Гель-фильтрация белков и пептидов 221 [c.221]

При групповом разделении смеси высокомолекулярные соединения не фракционируются. Гель-фильтрация в данном случае, подобно диализу, используется для отделения белков от низкомолекулярных примесей и может заменить его. Обессоливание белков можно проводить на сефадексах G-25 и G-50, а также на биогелях Р6 и РЮ. Для обессоливания пептидов следует применять сефадексы G-10 и G-15 или биогели Р2 и Р4. [c.221]

Гель-фильтрация белков и пептидов 223 [c.223]

При специфическом ферментативном гидролизе или химическом расщеплении любого белка среднего молекулярного веса получается довольно сложная смесь пептидов. Выделение и очистка всех пептидов, из которых состояла полипептидная цепь и которые содержатся в нефракционированном гидролизате, — задача достаточно трудная. Поэтому гидролизат белка рекомендуется сначала подвергнуть предварительному разделению. Среди современных методов фракционирования наиболее подходящим для этой цели является гель-фильтрация. [c.226]

Пролактолиберин (пролактин-рилизинг-фактор, ПРФ) — гормон гипоталамуса, стимулирующий секрецию пролактина. В чистом виде он до сих пор не получен. На основании поведения при гель-фильтрации на сефадексахи некоторых других свойств ПРФ можно предположить, что этот гормон — низкомолекулярное вещество, скорее всего пептид. [c.286]

Обессоливание и смена буфера с помощью гель-фильтрации широко используются в ходе очистки белков и пептидов для освобождения от сульфата аммония или в качестве промежуточной операции, подготавливающей препарат к последующему этапу хроматографии (ионообменной, аффинной или других видов). Если объем раствора белка изл еряется миллилитрами, то рутинную операцию его очистки нередко ведут вслепую . Однажды откалибровав небольшую колонку с сефадексом С-25, последующий отбор фракций, содержащих высокомолекулярные компоненты, производят по объему элюата, нередко просто путем отсчета капель. Соотношение объемов исходного раствора и колонки в этом случае может составлять примерно 1 10. В препаративных вариантах обессоливания, когда желательно максимально использовать объем колонки и избежать разбавления препарата, 5то соотношение можио увеличить до 1 3, контролируя выход хроматографических зон по УсГ-поглощению. Скорость элюции в таких опытах может быть значительной, порядка 20мл/см -ч (скорость продвижения фронта зоны очищаемого вещества по колонке — 20 см/ч). [c.137]

В книге подробно рассматриваются автоматический метод анализа пептидов и белков с помощью ионообменной хроматографии, газожидкостная хроматография аминокислот и пептидов, очистка белков с помощью гель-фильтрации и электрофореза, изучение функциональных групп в белках с привлечением химических методов. Отдельная глава посвящена изучению четвертичной структуры белков. [c.2]

Иногда для разделения пептидов энзиматического гидролизата применяется и метод гель-фильтрации. Принцип этого метода уже излагался вьпие (гл. I). Поэтому следу-ет указать только, что наиболее подходящим для этой цели является сефадекс Г-25. [c.83]

При двумерном разделении белков и пептидов возможны различные комбинации методов электрофорез с градиентным гелем и изоэлектрической фокусировкой [212], гель-фильтрация с изоэлектрической фокусировкой [213], гель-фильтрация с электрофорезом [214], двумерный электрофорез с различными буферными системами [215—218], двумерная хроматография с различными растворителями [219—221] и хроматография в сочетании с электрофорезом или изоэлектрической фокусировкой. Райт и др. [222] оценивали результаты одно- и двумерного разделения сложных смесей белков, подсчитывая число разделенных полос, и установили, что двумерный электрофорез на геле акриламида дает большее число полос, чем периодический или непрерывный градиентный электрофорез на геле акриламида, изоэлектрическая фокусировка или изоэлектрическая фокусировка, сопровождаемая непрерывным градиентным электрофорезом на геле. [c.518]

При этом образуются два фрагмента, так называемые S-пептид и S-белок. Они могут быть разделены путем гель-фильтрации на сефадексе G-25. Каждый из этих фрагментов в отдельности неактивен, но при их смешивании активность рибонуклеазы восстанавливается. Такой реконструированный белок получил название рибонуклеазы S. По-видимому, присоединение S-пептида к S-белку происходит в данном случае путем нековалентного взаимодействия. До недавнего времени синтетические исследования рибонуклеазы были в основном связаны с синтезом S-nen-тида а также небольших фрагментов S-белка В 1969 г. осуш,ествлен синтез рибонуклеазы А твердофазным методом и рибонуклеазы S с использованием метода N-карбоксиангидридов [c.181]

При выделении интерферона 60 мл раствора частично очищенного белка, полученного после фракционирования на сефадексе G-100 в 4 М мочевине, наносили на ОФ-колонку [26]. Патроны Sep-Pak применяли для отделения пептидов от мочевины после гель-фильтрации в растворах муравьиной кислоты [31]. Элюирование проводили в ацетате, содержащем ацетонитрил. [c.213]

Гель-фильтрация на сефадексе I в-25 или 6-50 1 Элюирование пептидов с бумаги и определение аминокислотной последовательности [c.345]

Пептидная связь Asp-Pro особенно лабильна в условиях мягкого кислотного гидролиза 58, 73, 97, 108]. Избирательное расщепление может идти в кислой среде при гидролизе пепсином, при обработке белка раствором бромоциана в 70%-ной муравьиной кислоте или в процессе очистки пептидов гель-фильтрацией в водной уксусной или муравьиной кислоте. Частичный гидролиз связи Asp-Pro наблюдался, в частности, при обработке глутаматдегидрогеназы бромоцианом в 70%-ной муравьиной кислоте [140] в этой же работе обсуждается вероятный механизм кислотного гидролиза пептидной связи Asp-Pro. [c.93]

С-Концевые пептиды А-цепи инсулина, лизоцима, цитохрома с, трипсина выделяли после блокирования всех свободных карбоксильных групп глициламидом при помощи водорастворимого карбодиимида ( 1-этил-3 (3-диметиламинопропил) карбодиимид, ЭДК) и расщепления полипептидов трипсином [33]. Все триптические пептиды, за исключением блокированного С-концевого, содержали свободные карбоксильные группы и присоединялись к анионообменной смоле AG-1-X2 (фирма Biorad). Перед хроматографией гидролизат обрабатывали карбоксипептидазой В, так как положительно заряженные Arg-содержащие пептиды не связывались со смолой и элюировались вместе с С-концевым пептидом. Свободный Arg отделяли от С-концевого пептида гель-фильтрацией или катио- гообменной хроматографией. Несмотря на то что эта многостадийная методика представляется продолжительной, ее рекомендуют как простую и довольно быструю. [c.483]

Пролактостатин (пролактинингибирующий фактор, ПИФ) — гормон гипоталамуса, угнетающий секрецию пролактина. У млекопитающих и, по-видимому, у рептилий и амфибий ингибирующее влияние гипоталамуса преобладает над стимулирующим. ПИФ до сих пор не получен в чистом виде, поэтому о его химической структуре можно говорить только на основании косвенных данных. На основании поведения при гель-фильтрации на сефадексах и других свойств частично очищенных препаратов ПИФ полагают, что этот гормон — низкомолекулярное вещество, по-видимому, низкомолекулярный пептид. [c.286]

Возможно идентифицировать и смеси коротких пептидов, получаемых после обработки белков ферментами, частичного разделения с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Сопоставление масс-спектров, полученных при различных температурах источника, а также использование полного метилирования и дейтерометилирования, обычно позволяют правильно идентифицировать пики исходных пептидов. [c.278]

Предварительное разделение смеси пептидов в соответствии с их электростатическим зарядом можно осуществить с помощью свободного ионофореза (или многокамерного электрофореза), который успешно применяли Сэнгер и Туппи [72]. Однако этот метод в настоящее время полностью вытеснен гель-фильтрацией, т. е. разделением в соответствии с размерами молекул. После появления первых работ в этом направлении [44, 83] чрезвычайно полезный метод гель-фильтрации был разработан Поратом и Флодиным [61 ] позднее Флодин теоретически обосновал его [20]. [c.37]

Одним из наиболее значительных преимуществ этого метода является его пригодность для исследования очень небольших количеств белка или пептидов. Это особенно ценно, например, для анализа разбавленных элюатов, получаемых при хроматографии и гель-фильтрации. Диск-электрофорез позволяет анализировать эти элюаты без предварительного концентрирования. [c.92]

Гель-фильтрация. Для фракционирования папаинового гидролизата примерно 100 мг IgG используют колонку размером 2х ХбО см. После нанесения препарата его остатки смывают тремя порциями буферного раствора по 4 мл и начинают гель-фильтрацию со скоростью 40—60 мл/час. На кривой оптической плотности элюата появляются два следующие непосредственно друг за другом пика, а через некоторое время после них — третий пик. Фракция элюата, соответствующая первому пику, содержит негидролизованный IgG (резистентные к папаину молекулы IgG). Во фракции, соответствующей второму пику, содержатся Fab- и F -фрагменты. Третья фракция, соответствующая на диаграмме третьему пику, состоит из низкомолекулярных пептидов. После пропускания через колонку одного объема буферного раствора ее можно использовать вновь. [c.224]

Модификацию карбоксильных групп в коротких пептидах осуществляют с помощью водорастворимого карбодиимида путем конденсации с соответствующими диаминами (1,2-диамнноэта-ном или диаминометаном). При соответствующем выборе диамина остатки аспарагиновой кислоты превращаются в аналог лизина [112]. Реакцию конденсации пептида с 2 М диамином проводят при pH 4,75 в присутствии 0,4 М солянокислого 1-этил-3-(3-диэтиламинопропил) карбодиимида при 20 °С в течение 1 ч. Затем добавляют вторую порцию карбодиимида и инкубируют еще в течение 5 ч. Модифицированные пептиды отделяют от продуктов реакции и избытка реагентов путем гель-фильтрации. В результате происходит необратимая модификация всех карбоксильных групп белка. Возможности использования этого типа реакции для модификации высокомолекулярных белков не исследовались. Указанным способом был модифицирован 29-членный пептид глюкагон это самый крупный пептид, подвергнутый такой модификации. [c.146]

В соответствии с механизмом гель-фильтрации при выборе марки (О-индекса) сефадекса следует руководствоваться предполагаемой величиной молекулярного веса пептидов. Если гидрОлизат содержит крупные пептиды, целесообразно использовать сефадекс 0-50 или 0-75. Если средняя величина молекулярного веса пептидов невелика, то предварительное фракционирование проводят на сефадексе 0-25. Чем выше специфичность расщепления (например, при действии трипсина на ацетил- и трифторацетилбелки или при расщеплении бромцианом), тем больше вероятность получения крупных пептидов. В этих случаях используется сефадекс с более высоким значением индекса О. При неспецифическом гидролизе (гидролиз химотрипсином, субтилизином, папаином, пепсином, кислотой и т. п.) обычно получаются мелкие пептиды, которые следует предварительно фракционировать на сефадексах с низким значением индекса О. [c.227]

Для выделения белков и пептидов, содержащих свободные 5Н-группы, целесообразно использовать высокое сродство меркапто-соединений к ионам тяжелых металлов, главным образом ртути. В табл. 11.1 дан ряд примеров выделения как белков, так и пептидов, основанного на образовании упомянутого комплекса. На рис. 6.10 приведены результаты выделения 5Н-протеазы из неочищенного экстракта бобов, осуществленного в колонке на оксиал-килметакрилатном геле, содержащем ртутное производное мета-криланилида [57]. 5Н-протеазу с оптимумом протеолитической активности при pH 8 можно выделить из смеси протеолетических ферментов этим способом за одно хроматографическое разделение. После удаления неактивного материала гель-фильтрацией через сефадекс 0-75 сразу получается гомогенная протеаза [58]. [c.124]

Л— — отдельные фракции пептидов, полученные гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией. Во фракции А пептиды Р, и Рг присутствуют в приблизительно эквимо-лярном соотношеини, фракции В и С содержат только примеси. Фракция О содержит преимущественно побочный продукт (87% Р,), фракции Е и — главный продукт Р (83% Рз во фракции Е). Данные о составе электролитов приведены в табл. 12.15. Время анализа одной фракции 10 мин, скорость бумаги 12 см/мин. Процеятный состав фракций можно рассчитать из относительной длины зов по калибровке методом стандартных добавок. Запись позволяет также определить содержание ацетат-ионов, которые перемещаются в зоне между ведущим С1--ионом и первой УФ-поглощающей примесью (например, фракция Р содержит 4% уксусной кислоты) на рисунке показана только часть зоны 1. Стрелка 1 указывает направление оси времени, стрелка Т — направление увеличения термического сигнала, а стрелка УФ — направление увеличения УФ-поглощения при [c.338]

Для разделения аминокислот, пептидов и белков применяли методы гель-фильтрации на сефадексе. Такой выбор весьма логичен, так как сефадекс обеспечивает разделение соединений в соответствии с их молекулярными массами. Детерман [169] разделял тирозин, тирозил-лейцил-глицилглутамилфенилала- [c.511]

Сиаловые кислоты, входящие в состав гликонротеинов, защищают их от действия протеолитических ферментов, поэтому необходимо предварительно отщепить их нейраминидазой. После удаления сиаловых кислот гликопротеины частично расщепляются протеолитическими ферментами (папаин, проназа) на гликопептиды, доступные для дальнейшего исследования. Гликопептиды затем обрабатывают ферментами, отщепляющими аминокислоты (например, карбоксипептидазой после защиты конечной аминогруппы), и превращают в олигосахариды, содержащие только одну аминокислоту. Углеводные компоненты гликапро-теинов, имеющих щелочелабильную связь углевод—аминокислота, отщепляют щелочной обработкой или ферментами, разрушающими связи такого типа. Полученные таким образом гетеросахариды или гетеросахариды с одной аминокислотой очищают от примесей пептидов и аминокислот переосаждением из водноорганических смесей (вода-спирт, вода—ацетон), экстракцией фенолом, хроматографией, электрофорезом или гель-фильтрацией. [c.76]

A.LL Методика. Навеску белка растворяют (10—20 мг/мл) в 70%-ной муравьиной кислоте и добавляют твердый бромоциан (2 мг/мг белка или 20— 100-мольный избыток в расчете на метионин). Инкубацию ведут при комнатной температуре без доступа света в тече1Н1е 18—20 ч. По завершении реакции реакционную смесь разбавляют 5—10 объемами воды и высушивают лиофильно. Продукты реакции разделяют гель-фильтрацией. Продолжительность реакции может быть существенно мсньнге. Иапример, 0,5 мкмоль пептида/мл обрабатывали бромоциаиом (5 мг/мл) при комнатной температуре в течение 4 ч [101, 200]. [c.101]

AieroduKa [123]. Пептид 89—169 основного белка бычьего миелина (1—7 мкмоль/мл) инкубируют с ВКР5--скатолом (17 мкмоль/мл) в 75%-ной уксусной кислоте при 37 в течение 24 ч. Затем избыток реагента и побочные продукты реакции отделяют повторной экстракцией этилацетатом, водный слой высушивают лиофильно. Очистку пептидных фрагментов ведут с по-мои ью гель-фильтрации. [c.109]

Ввиду устойчивости цистинсодержащих пептидов в слабокис-/юй среде (pH 2,0—6,5) для фракционирования используют гель-фильтрацию [8] и ионообменную хроматографию [2, 41]. Гель-фильтрацию проводят на сефадексе в 257о-ной уксусной кислоте [17], ионообменную хроматографию — на катионитах [45]. При фракционировании необходимо прежде всего разделить цистинсодержащие пептиды, отделение их от других пептидов вовсе не обязательно [36, 41]. Прочие пептиды легко отделить на последующей стадии, после окисления цистина в цистеиновую кислоту. Например, пептиды с цистеиновой кислотой можно эффективно фракционировать с помощью высокоэффективной или ион-парной хроматографии [23]. В присутствии фосфорной кислоты достигается почти идеальное разрешение при хроматографии па эффективных колонках в органических растворителях (гл. 6). [c.173]

Гели на основе полисахаридов или полиакриламида, используемые в обычной гель-фильтрации, очень слабо взаимодействуют с белками и пептидами. Иная картина наблюдается при работе на носителях, применяемых в ВЭЖХ. [c.201]