Зонды гомологичные

Если специфический зонд отсутствует, то его можно синтезировать химическими методами, если известна полностью или частично аминокислотная последовательность белка — продукта интересующего нас гена. Конечно, определить точную нуклеотидную последовательность, исходя из аминокислотной последовательности, нельзя, поскольку каждая аминокислота может кодироваться разными триплетами (от 1 до 4). Однако зная аминокислотную последовательность, можно синтезировать набор зондов и идентифицировать с их помощью плазмиды с частично гомологичными последовательностями. [c.316]

Идентификация нужного гена из клонотеки. В этом случае задача исследователя сводится к поиску среди миллионов клонов тех, которые содержат фрагмент ДНК с интересующим его геном. В настоящее время для решения такой задачи применяются молекулярные зонды (пробы). Зонд представляет собой меченую молекулу нуклеиновой кислоты, гомологичную последовательности гена. [c.46]

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как Р или Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК [c.308]

Идентификация специфических космидных клонов может проводиться либо (в редких случаях) с применением селективной системы, специфичной для клонируемой последовательности, либо, как правило, путем отбора клонов, несущих последовательности, гомологичные специфическому ДНК-зонду. Эта процедура обычно проводится методом гибридизации при высокой плотности колоний [8]. [c.77]

Генетические способы отбора требуют значительно меньших затрат труда, чем методы скрининга, что позволило разработать новые подходы, позволяющие проводить генетическую селекцию клонов, содержащих последовательности, гомологичные любой желаемой последовательности-зонду. Это дало возможность расширить применение этого метода, распространив его на задачи, обычно решаемые с помощью более трудоемких (и часто менее специфичных) методов скрининга. В общих чертах в основе всех этих подходов лежит следующее обстоятельство хотя в случае большинства специфических эукариотических последовательностей нельзя обеспечить генетическую селекцию в клетках Е. соИ, можно сконструировать пары векторов, позволяющие селектировать продукты гомологичной рекомбинации, обусловленной гомологией последовательностей между клонами. Такая селекция основана на том факте, что процессы, подобные репликации ДНК, транскрипции, мобилизации плазмид или упаковке ДНК в фаговые частицы, могут происходить только по is-схеме в отношении соответствующего регуляторного элемента (области начала репликации, промотора, сигнала мобилизации или упаковки). Чтобы исключить рекомбинацию между векторными последовательностями, нужно подбирать векторные пары, не обладающие взаимной гомологией (или в случае рекомбинации фагов без взаимной гомологии в пределах той области, которая определяется маркерами, используемыми для селекции). Соблюдение этого главного принципа лежит в основе и скрининга фаговых клонов с использованием рекомбинации между [c.77]

Первая постановка задачи выравнивания "из угла в угол" характерна для анализа сходства заведомо близких текстов, например гомологичных белков или сигналов, для которых начала и концы функционально значимы. Вторая постановка задачи "от границы до границы" встречается при секвенировании для стыковки прочитанных фрагментов, а также при выравнивании последовательностей, когда функционально-значимые точки на них неизвестны, но предполагается отсутствие несовпадающих участков на краях. Есть еще одна постановка задачи глобального выравнивания - среди всех путей найти наилучший. Здесь не ставится никаких ограничений на положения концов путей. Такая постановка задачи типична при исследовании функциональных сигналов, сайтов рекомбинации, подборе зондов и пр. [c.24]

Гомологичные зонды. Использование гомологичных зондов, т.е. зондов, последовательность которых полностью соответствует исследуемому гену, становится возможным в том слу- [c.163]

С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены чело- [c.189]

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизацрш с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для вьывления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК-зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. соИ. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. [c.112]

В том случае, если в каждом праймере содержатся рестрикционные сайты, клонируют ПЦР-продукт, несущий пойманный экзон, и используют последний в качестве зонда для скрининга кДНК-библиотеки. Зная нуклеотидную последовательность пойманного экзона, предпринимают поиск гомологичных ему последовательностей в базе данных. Если есть основания полагать, что пойманный экзон с большой вероятностью является частью гена данного заболевания, то характеризуют и секвенируют геномные клоны, охватывающие место расположения данного гена, и исследуют образцы ДНК больных и здоровых индивидов с целью выявления мутаций. Поскольку мутации, ответственные за патологию, не всегда бывают равномерно распределены по всем экзонам, чем больше размер сканированной кодирующей области предполагаемого гена, тем больше вероятность обнаружения мутации. [c.476]

Internet Line). Они созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна из них - ожидаемая нуклеотидная последовательность кодирующей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов. Нуклеотидную последовательность предполагаемого экзона можно использовать для поиска гомологичных ей последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью гена-мишени. [c.476]

Идентификация искомых клонов занимает иногда многое времени. Если же клонирование гена проведено, выявить сходные гены в банках кДНК относительно несложно, если применить метод Грюнштейна и Хогнесса. В этом случае колонии бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверхность питательной среды. Затем бактериальные клетки разрушают, а высвободившуюся ДНК денатурируют. При этом она остается связанной с фильтром. Далее на фильтр наносят радиоактивный зонд — денатурированную ДНК или РНК, которая связывается с гомологичной или частично гомологичной бактериальной ДНК- Избыток радиоактивных молекул зонда,, которые не связались специфически с гомологичной ДНК, удаляют промыванием и выявляют лизированные колонии, связавшие зонд, методом радиоавтографии. Бактерии, для которых наблюдалась положительная реакция в этом тесте, можно выделить из дубликата — реплики набора колоний. [c.316]

Мультилокусные зонды дают наилучший результат при использовании чистой, беспримесной ДНК. Однако судебные медики редко работают на свежем материале хорошего качества. Как правило, образцы чем-то загрязнены, например почвой или бактериями. Часто требуется более мощный метод. Этого достигают с помощью однолокусного зонда. Такой зонд можно использовать при работе с небольшими участками ДНК (например, с частично разрушенной ДНК), а также с малым количеством материала. Зонд распознает лишь одиночную короткую повторяющуюся последовательность, которая уникальна для одного минисателлита и поэтому обнаруживается только на определенной паре гомологичных хромосом. При рестрикции образуются два характерных фрагмента для каждого индивидуума, и, следовательно, на радиоавтографе появятся две полосы, одна материнского и одна отцовского происхождения (рис. 25.35). Если используют два однолокусных зонда, то появится четыре полосы если три, то — шесть, и т. д. Если требуется очень высокая достоверность в определении различий между двумя индивидуумами, то нужно использовать большое количество зондов (см. ниже). Этот метод называют генотипи-рованием, а получаемый при этом профиль используют в судебной экспертизе чаще всего. [c.266]

Недавно удалось идентифицировать рецегп ор ретиноевой кислоты. Им оказался белок, гомологичный рецепторам стероидных и тиреоидных гормонов он связывается с определенными последовательностями ДНК и регулирует транскрипцию определенных генов. Была выделена и секвенирована к ДНК. кодирующая рецептор. В настоящее время для выявления рецепторов в тканях подобных зачаткам конечностей, используются как ДНК-зонды, так и соответствующие антитела. [c.106]

Одно важное преимущество метода с использованием протекторного эффекта в РНКазной реакции по сравнению с любым другим методом состоит в том, что он позволяет точно определить в препарате содержание РНК, гомологичной зонду. Описание метода и пример его использования приведены в разд. 1.4.3. Обратите внимание на то, что метод дает абсолютные цифры (количество молекул на клетку), а не относительную величину, полученную путем сравнения с концентрацией некой стандартной мРНК, например мРНК актина. [c.15]

Индукция профага приводит к упаковке космиды Кт , но не плазмиды Ар Однако если между фрагментами ДНК, клонированными в космиде и в плазмиде, имеется гомология, то между гомологичными последовательностями может с частотой 10 произойти рекомбинация, в результате которой оба вектора объединяются в одну крупную кольцевую космиду. Только в этом случае упаковка обеспечит возможность трансдукции обоих маркеров Д /п и Лр . Поэтому для клонирования какого-либо гена достаточно лишь вставить небольшой фрагмент его ДНК в плазмиду-зонд, содержащуюся в линии хелперных клеток, суперинфицировать их космидной библиотекой (упакованной, как указано в разд. 2.2.8.5), индуцировать профаг в хелперных клетках и высеять их на чашки с Km и Ар. Колонии с двойной лекарственной устойчивостью должны в принципе содержать ген, клонированный в космиде, в которую интегрировала плаз-мида-зонд. [c.62]

Принцип метода схематически показан на рис. 3.2. Космидные библиотеки, сконструированные в гесЛ -клетке, упаковывают в Я-частицы, чтобы получить лизат с высоким титром трансдуцирующих частиц. Аликвоты упакованной библиотеки используют затем для заражения гес+-клеток, в которые предварительно введена последовательность (или последовательности) -зонд, клонированная в плазмиде, не имеющей гомологии с космидным вектором. Через 30 мин — 2 ч, в течение которых должна произойти рекомбинация, космиды вновь упаковывают в фаговые частицы. Упакованные космиды используют для заражения гесЛ -хозяина, проводя селекцию по обоим маркерам лекарственной устойчивости — плазмидному и космидному. Поскольку плазмида не несет os-последовательностей, она будет перенесена в реципиентные клетки только в случае рекомбинации с гомологичной последовательностью в космидном клоне. Для того чтобы восстановить исходную космиду, можно вновь разделить два клопа в результате второго рекомбинационного события и после переноса в нового хозяина идентифицировать ревертантов на индикаторных чашках. Как будет сказано ниже, точное восстановление, однако, не всегда возможно (или желательно). [c.78]

В качестве примера рассмотрим теперь основные этапы анализа гена тяжелой цепи миозина [482]. Вначале был получен кДНК-зонд для гена тяжелой цепи миозина кролика. Поскольку гомологичные гены различных млекопитающих в общем сходны, их гибридизация проходит без затруднений. Зонд клонировали в плазмиде и [c.130]

Проведя гибридизацию рестрикционных фрагментов, полученных прямо из клеток 5. typhimurium дикого типа и различных делеционных мутантов, можно выявить, какие из них гомологичны специфической ДНК-зонду. С помощью такой гибридизации можно определить как приблизительный порядок этих делеций на карте, так и положение их концов. [c.50]

Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу. После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК, меченной с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, мол<но определить размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной ДНК-зонду. [c.50]

При гибридизации фрагменты одноцепочечной ДНК известного микроорганизма (ДНК-репер) закрепляют на фильтре и добавляют радиоактивно меченные фрагменты одноцепочечной ДНК изучаемого штамма. Контролем служит связывание гомологичной реперу ДНК (100%-пая гибридизация). Меченая ДНК (зонд) должна составлять в опыте не более 1 300— 1 500 части от прикрепленной к фильтру немеченой ДНК-репера. Связывание зонда в пределах 100—70% считают штаммовыми различиями, 70— [c.145]

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рас-севают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры [235, 236]. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. [c.163]

Наиболее распространенная причина появления ПДРФ — точечные мутации, делеции, вставки и инверсии, приводящие к исчезновению одних и образованию других сайтов рестрикции. В итоге гомологичные геномные фрагменты, образующиеся при гидролизе ДНК соответствующими рестриктазами, будут иметь разную длину. Разницу в длинах рестриктов можно выявить на электрофореграммах с помощью гибридизационньгх зондов блотингом по Саузерну (см. прило- [c.294]

Программы дизайна зондов учитывают два возможных источника информации для синтеза праймеров — ДНК (или РНК) и белок. В обоих случаях задается интервал нуклео.идной или аминокислотной последовательности, и программа предлагает лучший вариант для этого интервала. Из-за вырожденности кода зонд, синтезированный на основе данных по аминокислотной последовательности, не может быть полностью комплементарным отыскиваемой последовательности. В заданном интервале программа отыскивает участок, содержащий метионины и фиптофаны (они имеют по одному кодону) и не включающий лейцины, серины и аргинины (они имеют по шесть кодонов). Как правило, программа предлагает вырожденные праймеры, отличающиеся друг от друга одним нуклеотидом. Вырожденные праймеры используются, когда неизвестна точная структура отыскиваемой последовательности (поиск нового гена какого-либо семейства генов, поиск межвидовых гомологичных генов, известна только структура белка). [c.472]

Отсутствие заметной гомологии между ДНК многих микоплазм было отмечено еще в работах конца 60-х годов [58—60]. По более точным количественным данным перекрестной гибридизации ДНК разных микоплазм в растворах было установлено, что гомология по ДНК у большинства видов не превышает 2 %, и только у нескольких пар сравниваемых микоплазм гомология составила от 4 до 21 % [61—63]. В нашей работе [64] по перекрестной блот-гибридизации ДНК ряда микоплазм показано, что при низком уровне гомологии ДНК исследованных видов эта гомология касается отдельных протя- женных фрагментов генома, а не коротких участков, распределенных по всей его длине. Более того, у некоторых микоплазм единственными гомологичными участками ДНК оказываются рибосомные гены., На основании этих результатов мы начали использовать в качестве гибридизационных зондов для обнаружения и идентификации микоплазм тотальные препараты ДНК, полученные из микоплазм, выращенных на специальных средах. Такие зонды оказались высокоэффективными и достаточно специфичными, но их нельзя рекомендовать к широкому применению, так как получение чистых культур микоплазм и их выращивание в препаративных количествах связаны со значительными техническими трудностями. В связи с этим мы предприняли клонирование случайных рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм в бактериальной плазмиде pBR322 и проверку рекомбинантных Ь лазмиЯ на специфичность в опытах по блот- и дот-гибридизации с ДНК различных микоплазм и ДНК клеток эукариот. Был составлен комплект плазмид-зондов, содержащих фрагменты ДНК, видоспецифичные для каждой из взятых микоплазм. В дальнейшем этот комплект должен быть расширен. [c.118]

Так, Р- и у-актины человека различаются всего по четырем аминокислотным остаткам. У большинства организмов гены, кодирующие различные актины. образуют мультигенные семейства, а кодирующие области этих генов гомологичны у разных видов. Например, аминокислотная последовательность а-актина скелетных мышц одинакова у курицы и млекопитающих, а актиновая мРНК, выделенная из вегетативных клеток Di tyostelium, служит также хорошим зондом при отборе клонированных актиновых генов дрожжей, кукурузы, сои и млекопитающих. [c.172]

Гаплоидный геном лабораторных штаммов S. erevisiae содержит примерно 35 Ту-элементов, что составляет 1% всего генома. У других штаммов дрожжей число копий Ту меньше. Помимо полноразмерных Ту-элементов, у S. erevisiae имеется примерно 100 одиночных 6-сегментов, не имеющих отношения к Ту-элементам. Гибридизация клонированных Е-зондов с рестрицированной геномной ДНК из разных штаммов дрожжей говорит о том, что гомологичные сегменты различаются по числу копий и по размерам это согласуется с представлением о нефиксированной локализации Ту-элементов. [c.249]

Морфологические изменения второго типа обнаруживаются в нормальных во всем остальном хромосомах и проявляются в атипичном характере исчерченности определенных областей при дифференциальном окрашивании (рис. 7.23) эти области называют гомогенно окрашивающимися (HSR). Как правило, они весьма протяженны, и хромосома, содержащая HSR, длиннее своего гомолога (рис. 10.88, ). В клетках, устойчивых к метотрексату, после гибридизации in situ с радиоактивным зондом, представляющим собой клонированный дигидрофолатредуктазный ген, и обработки фото-чувствительной эмульсией на HSR обнаруживаются зерна серебра. Таким образом, амплифицированные последовательности находятся внутри HSR. В хромосомах клеток сирийского хомячка, содержащих амплифицированные гены аспартат-карбамоил-трансферазы, также обнаруживаются лишние протяженные участки. Поскольку эти участки окрашиваются негомогенно, они не являются HSR, но тем не менее содержат амплифицированные сегменты ДНК (рис. 10.88, В). В некоторых случаях амплификация гена AD происходит и в нормальном локусе AD сирийского хомячка (в хромосоме В9р), хотя другие хромосомы тоже могут содержать много копий этого гена и иметь разнообразные аномалии (рис. 10.88, Г). Могут встречаться и двойные мини-хромосомы. Во всех исследованных случаях амплификация касается только одной пары гомологичных хромосом. В отличие от нестабильных амплифицированных генов в двойных мини-хромо- [c.309]

В основе этого подхода лежит тот факт, что разные аллели одного локуса различаются по нуклеотидной последовательности. Это могут быть одиночные нуклеотидные замены, делеции, вставки или другие перестройки, в результате которых изменяется сайт узнавания для той или иной рестри-ктируюшей эндонуклеазы или расстояние между этими сайтами. Как следствие может изменяться размер фрагмента(ов) ДНК гомологичных хромосом, которые гибридизуются с данным зондом, и наблюдается неодинаковый профиль гибридизации у разных особей одного вида [в качестве примера можно привести аллели овальбуминового гена [c.353]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология