Периплазматические ферменты

Фаговый дисплей в исследовании ферментов. С 1991 г. с помощью фагового дисплея было исследовано более 30 ферментов 97]. Поскольку перед встраиванием в фаговую оболочку гибридные белки должны быть как минимум перенесены в периплазматическое пространство бактериальных клеток, наибольшей эффективности фагового дисплея удается достичь с секретируемыми белками протеиназами, бактериальными секретируемыми и периплазматическими ферментами, антителами и др. Помимо этого ограничения имеется немало и других узких мест, которые мешают эффективному использованию системы для изучения полноразмерных полипептидных цепей ферментов. [c.345]

Внешние клеточные стенки микроорганизмов исключительно разнообразны по структуре и составу. Поэтому осуществимость предложенного выше механизма будет зависеть от того, какой тип микроорганизмов исследуется. В общем случае грам-отрицательные микроорганизмы устроены более сложно, чем грам-положительные. Доступ к восстановительным областям облегчен, если микроорганизм имеет экзоферменты, но становится все труднее в ряду периплазматические ферменты - цитоплазматические ферменты-митохондрии в эукариотических клетках. Многие бактерии [c.250]

Для преодоления этих ограничений в отношении коммерческих препаратов может быть использована их замена целыми клетками, внешние слои которых защищает ферменты, локализованные внутри клетки или в периплазматическом пространстве, от неблагоприятного действия реакционной смеси. [c.47]

Важные моменты контроля метаболизма связаны с пространственной организацией клетки. У бактерий периплазматическое пространство (гл. 5, разд. Г) изолировано от цитозоля, и ферменты, локализованные в этом пространстве, не смешиваются с другими ферментами клетки. Ряд ферментов локализован в мембране или прикреплен к ней. Эукариотические клетки имеют больше изолированных отсеков, чем бактериальные это ядра, митохондрии (включающие их внутреннюю полость и межмембранное пространство), лизосомы, микротельца и вакуоли. Еще один ограниченный мембранами отсек — это цитозольные канальцы и пузырьки эндоплазматического ретикулума. [c.68]

Периплазматическое пространство, куда погружен пептидогликановый слой, заполнено раствором, в состав которого входят специфические белки, олигосахариды и неорганические молекулы. Периплазматические белки представлены двумя типами транспортными белками и гидролитическими ферментами. Транспортные белки — это переносчики, связывающиеся с соответствующими субстратами внешней среды и транспортирующие их от наружной мембраны к цитоплазматической. [c.37]

Функции клеточной стенки прокариот. Клеточная стенка прокариот выполняет разнообразные функции механически заш иш ает клетку от воздействий окружаюш,ей среды, обеспечивает поддержание ее внешней формы, дает возможность клетке суш,ествовать в гипотонических растворах. В первую очередь, в этом заслуга пептидогликана. Структурная дифференцировка клеточной стенки у грамотрицательных прокариот, приведшая к формированию дополнительного слоя в виде наружной мембраны, значительно расширила круг функций клеточной стенки. Прежде всего это связано с проблемами проницаемости и избирательного транспорта веществ в клетку. Наружная мембрана имеет специфические и неспецифические каналы (диффузионные поры) для пассивного транспорта веществ и ионов, необходимых клетке, т. е. осуществляет функции дополнительного клеточного барьера (основной — ЦПМ). Она препятствует проникновению в клетку токсических веществ, что находит отражение в большей устойчивости грамотрицательных прокариот (сравнительно с грамположительными) к действию некоторых ядов, химических веществ, ферментов и антибиотиков. Появление у грамотрицательных прокариот дополнительной мембраны в составе клеточной стенки фактически привело к созданию обособленной полости (периплазматического пространства), отграниченной от цитоплазмы и внешней среды специфическими мембранами и несущей важную [c.19]

Когда оценивают уровень секреции в периплазматическое пространство, эффективность образования сферопластов определяют по периплазматическим маркерным ферментам. Кроме того, контролируется степень лизиса клеток с помощью определения активности такого цитоплазматического фермента, как алкоголь-дегидрогеназа [49] (табл. 4.28). [c.133]

Принцип действия клеточного дисплея заключается в экспрессии на поверхности клеток гетерологичных белков (белков-пассажиров), которые отсутствуют у данного организма, объединенных в составе гибридной молекулы с помощью пептидного спейсера с полипептидной цепью белка-носителя, обеспечивающего заякоривание всей конструкции в мембране клеток. При этом используют гибридные белки трех типов, в которых белок-пассажир находится на N-конце, С-конце или во внутренней части белка-носителя в виде сэндвича. Для успешного выполнения своих функций белки-носители должны отвечать, по крайней мере, четырем требованиям 1) обладать эффективной сигнальной или транспортной последовательностью, обеспечивающей прохождение гибридного белка через внутренние мембраны клеток 2) проявлять сильные якорные свойства для прочного удерживания белка-пассажира на поверхности клеток 3) должны быть совместимыми с белками-пассажирами, т.е. не дестабилизироваться после объединения с ними 4) демонстрировать устойчивость к протеолитическим ферментам, присутствующим в периплазматическом пространстве или культуральной жидкости. В качестве векторов для генов гибридных белков используют экспрессирующие плазмиды или хромосомы вирусов. [c.350]

Для экстракции рестриктаз, расположенных в периплазматическом пространстве грамотрицательных клеток, был апробирован их осмотический шок [179, 251], что нашло применение при разработке схемы очистки рестриктазы Pst I [251]. В дальнейшем этот метод в препаративных работах по выделению рестриктаз не получил распространения, что, учитывая ограниченный выход целевых ферментов в раствор [251] и относительную трудоемкость обсуждаемой процедуры, является вполне объяснимым. [c.144]

Применение осмотического шока оказалось очень полезным при изучении некоторых ферментов грамотрицательных бактерий. Эти ферменты локализуются между плазматической мембраной и наружными слоями клеточной стенки в периплазматическом пространстве, и поэтому их называют периплазматическими ферментами [32, 33]. Обычно это гидролазы, такие, как щелочная фосфатаза, рибонуклеаза I и циклическая фосфоди-эстераза. Метод выделения этих Лерментов из клеток Е. oli описан Хьюзом и др. [22]. Он включает следующие этапы 1) тщательное промывание клеток свежей средой или соответствующими буферами 2) суспендирование промытого осадка клеток в растворе 0,5 М сахарозы (80 частей) 3) центрифугирование и декантирование надосадочной фракции 4) быстрое диспергирование осадка путем сильного встряхивания в холодном [c.380]

М растворе Mg l2 (80 частей) 5) центрифугирование и изучение надосадочной фракции с целью выявления периплазматических ферментов. [c.380]

Макромолекулы ферментов, продуцируемые микробной клеткой, могут находиться в цитоплазме, периплазменном пространстве, быть связанными на клеточной стенке и, наконец, выделены в окружающую среду. Соответственно ферменты подразделяются на внутри-, внеклеточные и связанные с клеточной стенкой. В настоящее время белок считают внеклеточным, если он выходпт за пределы цитоплазматической мембраны (Безбородов, Астапович, 1984). Ферменты способны накапливаться в периплазматическом пространстве между клеточной мембраной и клеточной стенкой. Так, у бактерий периплазматические ферменты могут связываться со структурными элементами клетки. [c.69]

Оказалось, что из клеток грамотрицательных бактерий, подвергнутых на холоду осмотическому шоку (быстрому переносу из гипертонической среды в гипотоническую в присутствии ЭДТА), освобождается ряд периплазматических ферментов и наряду с ними белки, способные активно связывать некоторые субстраты, образуя с ними прочные комплексы с константами диссоциации, близкими к величинам Кт, для соответствующих транспортных систем. Одновременно с освобождением периплазматических белков нарушается транспорт этих субстратов в клетки бактерий, а добавление шоковой жидкости или очищенных связывающих белков в некоторых случаях восстанавливает нормальный транспортный процесс. Синтез связывающих белков индуцируется параллельно с индукцией транспортной системы, а у мутантов, дефектных по транспорту, соответствующие связываюпдие белки отсутствуют. Таким образом, участие связывающих белков в транспорте не вызывает сомнений. [c.55]

Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты эндонуклеазы рестриьщии у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной. [c.248]

Было обнаружено также, что многие бактерии способны в больщих количествах вырабатывать ферменты (гликозидазы, протеазы, липазы и др.), гидролизующие все типы полимерных молекул. Последними могут быть как молекулы, синтезируемые самой клеткой, так и чужеродные, попавшие в клетку извне. Отрицательные последствия гидролиза собственных молекул (самопереваривание) очевидны. В то же время прокариоты нуждаются в гидролитических ферментах, так как это расширяет круг используемых ими веществ, включая в него полимеры разного типа. Становится понятна необходимость изолирования этих ферментов от цитоплазматического содержимого. Грамположительные эубактерии выделяют гидролитические ферменты во внешнюю среду, у фамотрицательных они локализованы в периплазматическом пространстве. [c.37]

Супероксиддисмутаза изученных хемотрофных прокариот — не связанный с мембранами фермент, локализованный в цитоплазме. У Е. oli, в клетках которой обнаружены Fe-, Mn- и Fe/Mn-формы фермента, Ре-супероксиддисмутаза локализована в периплазматическом пространстве, а Мп-содержащий фермент — в цитоплазме. В связи с этим высказывается предположение, что металлоформы фермента играют разную роль в защите клетки от OJ Fe-содсржащий фермент защищает клетку от экзогенных супероксидных анионов, а Мп-содержащий — от эндогенных. [c.336]

У грамположительных бактерий экзоферменты топологически могут быть строго внеклеточными (многие протеазы, гликозидазы и др) и локализованными с наружной стороны клеточной мембраны, например, а-глюкозидаза у Вас h henifonms (это можно доказать при протопластировании клеток, когда ферменты переходят в окружающую среду после удаления клеточной стенки) Грибы в отношении секреции экзоферментов уподобляют грам-положительным бактериям У грамотрицательных бактерий экзоферменты дополнительно могут находиться в периплазматическом пространстве Казалось бы, что такие ферменты должны рассматриваться внутриклеточными, однако они достаточно легко освобождаются при осмотическом шоке или в результате протоп-ластирования клеток [c.56]

Мембраной (ЦПМ) осуществляется у дрожжей пиноцитоз — захват проникших в периплазматическое пространство капель липидов, углеводородов, белков. Образование пиноцитирующего пузырька и перенос его через мембрану по цитоплазме к вакуоле (а там гидролитические ферменты и т.д.) см. на рис. 3 в теме Транспорт . [c.45]

Дальнейший контроль за пулом активированных моносахаридов мо т осуществляться с помощью гидролаз UDP- axa-ров, хот я эти ферменты и являются периплазматическими. Кроме того, некоторые ферменты, участвующие в синтезе нуклео-тиддифосфатуглеводов, связаны с мембраной и неизвестно, могут ли продукты этих реакций находиться в свободном состоянии в цитоплазме. [c.230]

Наружная мембрана плотно прилегает к муреиновому слою и связана с ним липопротеинами. Муреиновый слой, видимо, свободно проницаем для различных веществ. Промежуток между муреином и плазматической мембраной называют периплазматическим пространством. В нем находятся белки, в том числе деполимеразы (протеиназы, ну-клеазы, например рестрикционный фермент E oRI), периферические белки плазматической мембраны и так называемые связующие белки. Последние участвуют в переносе некоторых субстратов в цитоплазму и служат рецепторами хемотаксических стимулов. Периплазматическое пространство, по всей вероятности, играет также роль в осморегуляции. [c.60]

Цитоплазматическая мембрана непосредственно прилегает к клеточной стенке. Но у некоторых бактерий между ними есть пространство, которое можно с некоторым допущением назвать периплазматическим. Здесь, по-видимому, сосредоточиваются гидролитические ферменты и вещества, транспортируемые внутрь клетки и за ее пределы. Цитоплазматическая мембрана бактерий представляет собой липопротеидную трехслойную мембрану (липидный слой покрыт с двух сторон белковым слоем). Толщина мембраны около 7,5 нм. Она является главным осмотичёским барьером клетки, ею контролируются поступление и выброс веществ, водный и солевой обмены. Цитоплазматическая мембрана имеет многочисленные выпячивания (инвагинации). Внутри них находятся пузырьки и канальца, организованные в трубчатые и пластинчатые тилакоиды, бухтоообразные и спиралевидно закрученные тельца — мезосомы. Предполагают, что одни из них выполняют функции митохондрий, другие —эндоплазматического ретикулума, третьи — аппарата Гольджи и т.д. Но это пока недостаточно четко подтверждено экспериментально. Очевидно только, что в цитоплазматической мембране происходят важнейшие биохимические превращения с участием различных ферментов, осуществляется синтез некоторых компонентов клеточной стенки и капсулы. С мембраной частично связаны рибосомы клетки. Цитоплазматическая мембрана составляет около 20% сухой массы клетки. [c.32]

У прокариот клеточная стенка и ЦПМ являются существенным препятствием для высокомолекулярных веществ. Поэтому такие соединения сначала расщепляются вне клетки на олиго- и мономеры соответствующими гидролазами. У грамотрицательных бактерий эти ферменты либо расположены на наружной стороне ЦПМ, либо локализованы в периплазматическом пространстве. Высокомолекулярные вещества проникают в их периплазму с помощью белков-поринов в наружной (внешней) мембране. [c.102]

Структура простагландин-Нз-синтазы (РСН8). Вырабатываемые железами внутренней секреции гормоны попадают в кровь и с ее током достигают различных органов и тканей. Поэтому для них, помимо исключительной специфичности и высокой активности, характерна удаленность действия от мест синтеза. В организме, кроме гормонов, есть и другие сигнальные медиаторы, которые секретируются не в кровь, а во внеклеточную периплазматическую жидкость и оказывают влияние на состояние только ближайших клеток. Важным семейством таких локальных химических медиаторов, источником которых являются клетки многих типов, служат простагландины - производные жирных кислот с 20 атомами углерода в цепи. Они связываются с большим числом рецепторов клеточной поверхности и вызывают сокращение гладких мышц, снижают способность тромбоцитов к агрегации, активизируют центральную нервную систему, действуют на воспалительные процессы и высвобождают ренин [258]. Недавно было установлено, что простагландины играют также важную роль в патофизиологии рака и при сердечно-сосудистых заболеваниях [259, 260]. В отличие от большинства сигнальных молекул они не накапливаются в клетках, а непрерывно синтезируются в мембранах из предшественников и сразу же освобождаются во внеклеточное пространство, где в течение короткого времени (от долей секунды до двух минут) разрушаются. Уменьшение локальной концентрации простаглан-динов вне клеток активирует работу синтезирующих их ферментов, что по механизму обратной связи оказывает воздействие на состояние клеток, выделяющих простагландины, и на их ближайших соседей. [c.64]

Согласно этой модели, при добавлении аттрактанта периплазматический рецепторный белок активирует МБХ, в результате концентрация X возрастает и кувыркание подавляется. Но происходящее через некоторое время метилирование МБХ возвращает фермент в нормальное состояние, и концентрация X постепенно падает до уровня покоя. Теперь клетка адаптирована и частота кувырканий нормальная, но эта частота вновь изменится при изменении уровня аттрактанта понижение концентрации аттрактанта приведет к отделению рецептора от МБХ, к временной инактивации этого фермента и как следствие к усиленному кувырканию (рис. 13-51,Б), а ее повышение-к связыванию с МБХ еще одного рецептора (что на короткое время активирует фермент и подавит кувыркание рис. 13-51, А). Бактерии не будут реагировать на дальнейшее повьпцение концентрации аттрактанта только в том случае, если она уже достаточно высока, чтобы в молекулах МБХ все участки связывания рецептора и все участки метилирования оказались насыщенными. [c.289]

Однако чаще это происходит не сразу после их биосинтеза,, сопровождающего рост продуцента. Первоначально они накапливаются в мицелии, как связанные в цитоплазматической мембране. Участвующие в их биосинтезе связки рибосом и соответствующая информационная РНК локализуются на внутренней стороне плазматической мембраны (рис. 6.1). Формируемый ими фермент локализуется внутри нее и представляет собой в это время высокомолекулярный фосфолипопротеин, содержащий одновременно ли-пофильную и гидрофильную с терминальной МНг-группой цепи,, способствующие ее транспортировке через мембрану. Окончательно сформированный энзим попадает далее в периплазматические пузырьки — мезосомы, причем его молекулярная масса падает в - 20 раз, видимо, за счет потери транспортных устройств, отщеп- [c.144]

Было обнаружено, что многие бактерии способны в больших количествах вырабатывать ферменты (гликозидазы, протеазы, липазы и др.), гидролизующие все типы полимерных молекул. Последними могут быть как молекулы внутриклеточного происхождения, т. е. синтезируемые самой клеткой, так и чужеродные, попавшие в клетку извне. Отрицательные последствия гидролиза собственных молекул (самопереваривание) очевидны. В то же время прокариоты нуждаются в гидролитических ферментах, так как это расширяет круг используемых ими веществ, включая в него полимеры разного типа. Становится понятна необходимость изолирования этих ферментов от цитоплазматического содержимого. Грамположительные бактерии выделяют гидролитические ферменты во внешнюю среду, у грамотрицательных они локализованы в периплазматическом просгранстве. Там же содержатся и водорастворимые белки, участвующие совместно с другими ферментными белками в активном транспорге веществ. [c.32]

При разрушении клеток С. pasteurianum гидрогеназная активность проявляется только в растворимой фракции. Более детальное изучение локализации в клетке этого фермента обнаружило его в периплазматическом пространстве и цитоплазме. Гидрогеназа, локализованная в периплазматическом пространстве, по имеющимся данным, катализирует необратимую реакцию поглощения Нг. Находящаяся в цитоплазме гидрогеназа способна катализировать реакции как поглощения, так и выделения Нг. У клостридиев она входит в состав ферментного комплекса, осуществляющего окислительное декарбоксилирование пирувата (см. рис. 62). [c.205]

Как уже отмечалось, грамотрицательные бактерии имеют дополнительный барьер проницаемости в виде внешней мембраны, через которую не проникают белковые молекулы. Поэтому некоторые ферменты, например фосфатазы, которые обычно секретируются грамположительными бактериями, задерживаются у них в периплазме. Однако и среди грамотрицательных бактерий есть виды и штаммы, способные продуцировать внеклеточные белки. Так, штаммы Е. соН, несущие плазмиду, детерминирующую синтез гемолизина, приобретают способность и к его секреции. Первоначально гомолизин, по-видимому, поступает в периплазматическое пространство. Для выведения его из клетки необходим синтез двух белков, кодируемых той же плазмидой. Эти белки встраиваются во внешнюю мембрану и обеспечивают энергозависимое перемещение гомолизина наружу (W. Goebel et al., 1984). [c.67]

Процессы активного транспорта весьма сложны и протекают с участием нескольких мембранных компонентов. Иногда для описания транспортного процесса (чаще у микроорганизмов) используют термин пермеаза. Этот термин включает в себя либо всю систему транспорта, либо только часть ее. Часто пермеазой называют фермент, непосредственно связывающий вещество и переносящий его на малоспецифический переносчик. Компонентами пермеазных систем является группа связывающих белков, количество Которых год от года увеличивается. Большинство таких белков выделено у микроорганизмов. Они имеют некоторые общие черты молекулярная масса 30 000—35 ООО Д, константы связывания веществ белками совпадают с константами транспортирования, высокая специфичность, находятся в периплазматическом пространстве или не очень прочно связаны с плазматической мембраной. [c.47]

Генная инженерия позволяет также создавать микроорганизмы с повыгиенным потреблением субстрата (так легче приводить его в контакт с ферментом) и тем самым улучшить параметры отклика и чувствительность сенсора. Можно также изменить локализацию в клетке представляющего интерес фермента. Так, если в бактерии локализовать его в периплазматическом пространстве, это также облегчит доступ субстрата. Наконец, можно модифицировать гены, кодирующие стенку используемых микроорганизмов, чтобы последние легче было прикреплять к поверхности сенсора или чтобы улучшился перенос электрона к ней. Эта идея представляется несколько умозрительной, поскольку пока что трудно представить, какие именно генетические изменения необходимы для достижения желаемого эффекта. Как и в белковой инженерии, такое применение генной инженерии предполагает предварительное знание физиологии и генетики конкретного микроорганизма, следовательно, для этих целей наиболее пригодны хорошо охарактеризованные виды микроорганизмов, в том числе те, в которые с помощью генной инженерии вводят и экспрессируют интересующие исследователей гены. [c.98]

ЭТОЙ протеазы клонировали в Е. oli, и был продемонстрирован синтез и образование внеклеточного активного фермента в данной гетерологичной системе. Зрелый фермент имеет молекулярную массу 106 кДа, но первоначально он синтезируется в виде предшественника массой 169 кДа. Предшественник содержит три функциональных домена N-концевой лидер, который обеспечивает транспорт белка через плазматическую мембрану, собственно протеа-зу и С-концевой домен-помощник, необходимый для прохождения макромолекулы через внешнюю мембрану. N-концевой лидер (сигнальный пептид) отщепляется в процессе секреции белка-предшественника через плазматическую мембрану в периплазматическое пространство (рис. 2.48). После этого С-концевой домен-по-мощник выполняет роль поры (белка порина) [c.131]

Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, называемые поринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие молекулы массой до 7 кД. Между наружной и цитоплазматической мембранами находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты. При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием фермента лизоци-ма или пенициллина, а также защитных факторов организма образуются клетки с измененной, часто шаровидной формой протопласты — бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, и сферопласты — бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. После удаления ингибитора синтеза клеточной стенки такие измененные бактерии могут реверсировать, т. е. приобретать полноценную клеточную стенку и восстанавливать исходную форму. Бактерии сферопластного или протопластного [c.24]

Эукариотные и прокариотные клетки имеют пространственные отсеки , в которых локализована часть их ферментативного аппарата. Так, у грамотрицательных бактерий некоторые гидро-лазы локализованы в периплазматическом пространстве (между внешней и цитоплазматической мембранами). Эти обстоятельства создают возможность регуляции ферментативной активности путем управления скоростью проникновения в отсек субстрата или выхода из него фермента (компартментация). [c.51]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология