Электрофорез иммуно

По окончании электрофореза фитили из фильтровальной бумаги удаляют, а канавки в агаровом геле заполняют иммунной сывороткой, соответствующим образом разведенной физиологическим раствором. (Для заполнения канавки требуется около 1 мл сыворотки.) [c.140]

Буферный раствор Михаэлиса очень удобен для иммуно-электрофоретического анализа белков сыворотки крови. Однако можно использовать и другие буферные растворы. В этих случаях, разумеется, следует готовить агаровый гель на том же буферном растворе, в котором проводится электрофорез. [c.140]

Внесение иммунной сыворотки. По окончании электрофореза ранее размеченную канавку освобождают от агарового геля и при помощи капиллярной пипетки или туберкулинового шприца заполняют специфической иммунной сывороткой (рекомендуется за- [c.142]

Метод иммуноэлектрофореза позволяет сравнивать между собой не только смеси белков (антигены) с помощью данной иммунной сыворотки, но также и иммунные сыворотки с помощью данного антигена. Для такого исследования в пластинке агарового геля вырезают две параллельные канавки, а между ними на расстоянии 3 мм от края каждой делают лунку для образца. В нее вносят раствор определенного белка и, проведя электрофорез, заполняют канавки сравниваемыми иммунными сыворотками. Полосы преципитации, которые появляются с обеих сторон от нанесенного образца, позволяют сопоставлять исследуемые иммунные сыворотки. [c.148]

После внесения раствора антигена и иммунной сыворотки проводят электрофорез (см. стр. 139) до тех пор, пока в геле между двумя лунками не образуются полосы преципитации. [c.154]

Рекомендуется использовать электрофоретический прибор с охлаждением. По окончании электрофореза область разделения исследуемого образца в агарозном геле вырезают в виде узкой продольной полосы, содержащей белковые фракции (фиг. 33), и помещают ее на пластинку агарозного геля с иммунной сывороткой. [c.155]

Приготовление геля агарозы, содержащего иммунную сыворотку, и вторая стадия анализа электрофорез фракций, полученных на первой стадии). Специфическую иммунную сыворотку в соответствующем разведении смешивают с 1%-ной агарозой и наслаивают на стеклянную пластинку размером 10 хЮ см слой толщинои 1,5 мм. [c.155]

Электрофорез на ацетат-целлюлозных мембранах описан на стр. 71. По окончании электрофореза на закрепленную в электрофоретической камере мембрану капиллярной пипеткой наносят иммунную сыворотку. Наносить следует по возможности одним движением на расстоянии 0,1—1,0 см от места нанесения исследуемого образца параллельно направлению его разделения при электрофорезе. После того как нанесенная иммунная сыворотка впитается, мембрану извлекают из электрофоретической камеры и погружают в вазелиновое масло. Остальные стадии методики те же, что и в предыдущем методе исследования (стр. 161). [c.162]

Электрофорез и иммуно-форез в агаровом геле на предметных стеклах 26Х 76 мм ТУ 42-2-70—71 [c.287]

До настоящего времени гель-фильтрация в тонком слое находила применение главным образом при разделении белков. Разработаны модификации метода, сочетающие гель-фильтрацию с электрофорезом и иммунной преципитацией. Настоящая глава посвящена методическим аспектам тонкослойной гель-фильтрации, некоторым приложениям метода, а также указанным модификациям. Большое внимание, уделяемое разделению белков, отражается и в подборе конкретных примеров. Однако это не означает, что область применения метода ограничивается этой группой веществ. [c.256]

Приведенные примеры ясно показывают, что тонкослойная гель-фильтрация в сочетании с иммунной преципитацией является простым и удобным методом, который может дополнить иммуноэлектрофорез при идентификации белков в биологических жидкостях или при выделении белков. В случае необходимости чувствительность и разрешение метода можно повысить, выполняя электрофорез после тонкослойной гель-фильтрации в геле агарозы, содержащем антитела. [c.275]

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

Большим достоинством книги является подробное описание многочисленных вариантов метода иммуноэлектрофореза, в котором высокая разрешающая способность, свойственная электрофорезу в гелях, сочетается со строгой специфичностью иммунных реакций. [c.6]

Скорость течения жидкости (скорость элюции) можно регулировать наклоном пластины (обычно в диапазоне 5—20°). Для проявления результатов фракционирования удобнее всего воспользоваться методом снятия реплики. На влажный гель на 1 мин кладут листок толстой фильтровальной бумаги ( Whatman 3 ММ ) и прижимают его стеклянной пластиной. За это время жидкость из пространства между гранулами переходит на бумагу, а вместе с ней — и макромолекулы, находившиеся в подвижной фазе каждой хроматографической зоны. Фильтровальную бумагу затем подсушивают и пятна на ней выявляют одним из многочисленных методов окраски белков или НК, путем регистрации ферментативной активности, радиоактивности, иммунными методами и т. д. Все эти методы выявления были подробно рассмотрены при описании электрофореза и иммуноэлектрофореза [Остерман, 1981, 1983]. [c.163]

А. Иммуноэлектрофоретический анализ (ИЭА) [41], Антигены вначале разделяют путем электрофореза в агарозном геле, Верхняя часть рисунка демонстрирует классическое расположение ИЭА нижняя часть ИЭА называется тандемной стрелки показывают положение лунок, в которые заливают перед электрофорезом растворы антигенов. После электрофореза в геле параллельно направлению электрофоретической миграции прорезается канавка, которая заполняется иммунной сывороткой. Антитела и антигены диффундируют в гель, встречаются и образуют дуги преципитации, [c.102]

Б. В Иммуноэлектродиффузия или ракетный иммуноэлектрофорез [66], Гель агарозы содержит равномерно распределенную иммунную сыворотку. В лунки внесены антигенные растворы разных концентрации. Электрофоре. проводится при pH, при котооом антитела не мигрируют либо мигрируют очень мало. Антигены под действием электрического поля мигрируют в геле, содержащем антитела. Комплексы при избытке антигенов вначале растворимы, продолжают мигрировать в ходе электрофореза, а также посредством диффузии, обогащаются антителами, н, когда соотношение антигенов и антител достигает точки эквивалентности, они осаждаются в форме ииков. [c.102]

В/см. В ходе электрофореза белковые фракции диффундируют из полоски в гель, содержащий антитела. Мигрируя в нем под действием электрического поля, они образуют преципитационные пики в результате специфической реакции с соответствующими антителами. Контуры преципитационных пиков формируются благодаря электрофоретической миграции антигена, а также постепенному уменьшению его избытка в результате этой миграции в геле агарозы. (Известно, что избыток антигена растворяет иммунные преципитаты, поэтому полосы преципитации образуются только там, где избыток антигена исчезает благодаря электрофоретической миграции.) [c.156]

На стеклянную пластинку обычным способом наносят 1 %-ный гель агарозы, содержащий 2,5%-ную иммунную сыворотку анти-IgG. В затвердевшем геле агарозы вырезают нужное число круглых лунок для исследуемой сыворотки и IgG и заливают в них по несколько капель агарозного раствора. Препараты IgG известной концентрации в соответствующем разведении вносят в несколько лунок в остальные лунки заливают образцы исследуемых сывороток и проводят электрофорез, как описано выше. В зависимости от соотношения концентрации антигена и антител продолжительность электрофореза может варьировать от 2 до 10 ч. Электрофорезг следует закончить, когда прекратится увеличение преципитационных пиков, т. е. когда избыток антигена будет нивелирован электро- [c.156]

Сначала исследуемый антлген подвергают электрофорезу макрометодом, описанным на стр. 137. Затем в непосредственной близости от области разделения антигена в агаровом геле вырезают широкий желобок, который заполняют смесью расплавленного агара с иммунной сывороткой. Белки, разделенные в электрическом поле, диффундируют в агаровый гель, содержащий антитела. Расстояние, проходимое белкамй обусловлено закономерностями линейной дис узии в геле (см. стр. 128). Поэтому, измерив смещение вершин преципитационных полос от границы желобка, можно определить скорость диффузии, т. е. величину А, а с ее помощью и концентрацию исследуемых белковых фракций. [c.161]

Принцип метода. Исследуемый антиген подвергают электрофорезу на ацетат-целллюлозной мембране. После этого на мембрану наносят специфическую иммунную сыворотку, и в результате ее диффузии образуются полосы преципитации, выявляемые при окрашивании. [c.162]

Immunelektrophorese f иммунный электрофорез иммуноэлектрофорез Immunitat f иммунность невосприимчивость состояние высокой коррозионной стойкости (металла) Impedanz / импеданс полное сопротивление [c.102]

При исследовании компонентов моноклонального иммуноглобулина Гоббс [15] применил тонкослойную гель-фильтрацию сыворотки в сочетании с зональным электрофорезом и иммуноэлектрофорезом. Такое сочетание эффекта молекулярных сит и иммунной преципитации позволило обнаружить очень интересный компонент иммуноглобулина, представляющий собой половину молекулы иммуноглобулина О [26]. Парвес [27] предложил применять гель-фильтрацию в тонком слое для диагностики болезни тяжелых цепей , характеризующейся присутствием в сыворотке и моче больных аномального белка, напоминающего тяжелую полипептидную цепь иммуноглобулина О (или А). Этот пример приведен на рис. 3. [c.264]

В качестве поддерживающей среды можно применять и агаровый гель, но размер пор в нем гораздо больше, и движение белковых частиц происходит беспрепятственно (гель с низкой разрешающей способностью ). Большая скорость диффузии и прозрачность геля были использованы Грабаром и Уильямсом, которые создали так называемый иммуноэлектрофорез , являющийся развитием ранее существовавшего метода имму но диффузии . Суть иммуноэлектрофореза состоит в том, что для проявления электрофореграммы и идентификации белковых компонентов применяется преципитация их иммунной сывороткой крови. После предварительного электрофореза на бумаге из последней вырезают продольную полоску, не проявляя зон. Еще влажную бумагу прижимают к поверхности агарового геля. Параллельно этой полоске вырезают канавку в агаре и наливают в нее иммунную сыворотку. В результате встречной диффузии антитело встречается с антигеном происходит преципитация, и в прозрачном геле образуются дугообразные ясно видимые полосы, которые можно еще окрасить. [c.99]

После окончания электрофореза в канавку О, ирорезанную вдоль агарового блока на расстоянии порядка 1 см от нанесенного в начале образца белка А, заливается иммунная аптисы-воротка к исследуемой белковой смеси. Весь блок помещается на длительное время (7—14 суток) в сосуд, в котором поддерживается насыщенная упругость паров воды. Антитела диффундируют навстречу антигенам и дают при достижении критического интервала концентраций, благоприятного для преци-питиповой реакции, видимые глазом осадки в форме тонких дуг. Подобная форма осадков вполне понятна. В тех областях агара, где концентрация белка после электрофореза максимальна, точка выпадения осадка будет наиболее удалена от канавки, заполненной антителами, так как самая низкая концентрацпя антител в поле диффузии окажется достаточной, чтобы вызвать преципитацию. В других точках зоны, в которых концентрация белка ниже максимальной, выпадение осадка произойдет ближе к канавке с антителами. Отсюда картина дугообразных преципитатов. [c.136]

Уже давно известно, что антитела находятся в глобулиновой фракции иммунной сыворотки. Это наблюдение послужило основой для представления о том, что антитела в большей или меньшей степени рыхло связаны с сывороточными глобулинами. Если иммунную сыворотку фракционировать при помощи сернокислого аммония, то антитела обнаруживаются главным образом во фракции у-глобулинов [30]. Фракционирование глобулиновой фракции этиловым спиртом показало, что антитела присутствуют во фракциях 11-1, П-2 и П-3, а также во фракции ПМ [31]. Некоторые антитела осаждаются вместе с эвглобулинами при диализе против дестиллированной воды, другие же антитела обнаруживаются во фракции псевдоглобулинов [32]. Как правило, иммунная сыворотка содержит больше у-глобулинов, чем нормальная сыворотка. Кроме а-,, 8- и у-глобулинов, присутствующих и в нормальной сыворотке, иммунная сыворотка иногда содержит также новую фракцию (Т), которая при электрофорезе движется между р- и у-фракциями. Т-фракция также содержит антитела [33, 34]. Исследования последних лет показали, что сыворотка многих новорожденных животных, например жеребят [35] или кроликов [36], бедна глобулинами. Это хорошо согласуется с тем фактом, что в сыворотке новорожденных животных антитела отсутствуют [37]. [c.335]

Электрофорез на тонких слоях геля крахмала применяли для разделения белков сыворотки [191—193]. Для обнаружения фракций белка слои геля крахмала окрашивали красителем амидным черным 10 В. Обнаружение и идентификацию зон, разделенных электрофоретически, осуществляют методом иммуно-электрофореза. Корнгольд [194] использовал метод, при котором зоны, полученные электрофорезом геля крахмала, диффундировали в слои агара, где они реагировали с нанесенной антисывороткой. Для этого после завершения электрофоретического разделения слой крахмала подрезали лезвием бритвы и осторожно переносили на слой агарового 1,2 %-ного студня. По- [c.516]

Недавно проведенные исследования Шмида и сотр. [44—48] показали, что препарат -кислого гликопротеина, гомогенный при свободном электрофорезе после очистки на ионообменной смоле, разделяется на семь компонентов при электрофорезе на крахмале по Смитису [49]. После удаления сиаловых кислот были получены три основные зоны. Эти опыты хорошо воспроизводимы, и их можно повторить на препаратах, полученных разными методами. До настоящего времени не удалось обнаружить каких-либо различий в соотношениях аминокислотных и углеводных компонентов во всех полученных фракциях (за исключением одного компонента, содержащего немного меньше тирозина и триптофана), и все фракции одинаково реагировали с иммунной сывороткой козы. [c.72]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Выделение гибридных белков, содержащих -галактозида-зу, было детально описано в предыдущей главе. Для иммунизации мышей требуются относительно небольшие количества антигена, поэтому его можно наработать любым методом. Хотя белковый материал, полученный в результате препаративного ДСН-электрофореза в ПААГ, не всегда обладает такими имму-ногенными свойствами, которые присущи большинству нативных препаратов, он имеет то преимущество, что вызываемый им иммунный ответ обусловлен устойчивыми к денатурации эпитопами. Используемый нами метод выделения нерастворимых гибридных белков приведен в табл. 6.4. Моноклональные антитела к таким эпитопам часто удается с успехом использовать в последующем детальном иммунохимическом анализе белковых антигенов. Наличие абсолютно чистого иммуногена не требует- [c.180]

Иммунологические методы пгароко используются для идентификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно-блоттинг (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата на рия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последуюп] его выявления с по- [c.202]

Рис. 82, А. Двухмерная двойная иммунодиффузия из прямоугольных канавок. / — канавка для антигена — канавка для антител. Б. Иммуноэлектрофорез. Л 5—5 — электрофорегически разделенные компоненты смеси антигенов 2 прямоугольная канавка для смеси антигенов (стартовая зона электрофореза) б —канавка для антител (иммунной сыворотки).

Альпер и Джонсон предложили метод, позволяющий с минимальной диффузией проводить преципитацию электрофоретически разделенных белков [27]. После завершения электрофореза в агарозном геле на его поверхность равномерно наносят соответствующую иммунную сыворотку, и гель, установленный в строго горизонтальное положение, инкубируют во влажной атмосфере в течение 2 ч. Затем гель покрывают тонким листом влажной фильтровальной бумаги, на который сверху кладут три листа толстой бумаги и стеклянную пластинку с грузом 2— [c.246]

Замечания по технике проведения перекрестного иммуно электрофореза. В оригинальной методике Лорелла [739] при электрофорезе в первом направлении рекомендуется вырезать канавку для образца размером 1ХЮ мм. Кроме того, необходимо использовать буфер, обладающий не слишком низкой ионной силой (например 70 мМ вероналовый буфер, pH8,6), и высокое напряжение (до 20 В/см) с эффективным охлаждением системы. Для электрофореза во втором направлении из центральной части электрофореграммы вырезают полоску шириной [c.255]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология