Вирусы реакция гемагглютинации

Рис. 6.3. Титрование вируса гриппа в реакции гемагглютинации. Для постановки реакции готовят серии двукратных разведений исследуемого вируса в планшетах с круглодонными лунками, как описано в разд. 3.1. Конечной точкой считают минимальное разведение вируса, при котором наблюдается агглютинация 50% эритроцитов, В ряду 1 (а) разведения 1/2—1/16 дают полную агглютинацию, в то время как более высокие разведения не дают агглютинации. Конечной точкой считают такое разведение вируса, которое содержит 1 гемагглютини-рующую единицу (ГАЕ), т. е. количество вируса, необходимое для агглютинации стандартного объема 1%-ной суспензии эритроцитов. В ряду 1 (а) конечная точка лежит посередине между 1/16 и 1/32, т. е. составляет 1/24. Аналогично конечные точки для 2-го, 3-го и 4-го рядов составляют 1/768, 1/192,

Если в материале содержится специфический антиген, он соединяется с сывороткой, адсорбированной на поверхности лунок, и, в свою очередь, связывает иммуноглобулины на поверхности эритроцитов. В результате происходит агрегация эритроцитов (гемагглютинация). В описанной модификации реакция применяется для выявления антигенов ротавирусов и других вирусов в фекалиях больных. [c.279]

Для титрования вируса в реакции гемагглютинации берут 1Уо взвесь эритроцитов. Титром вируса считается то наибольшее разведение, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов не менее чем на -1-+ (1 АЕ — одна агглютинирующая единица). [c.235]

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с клеточными культурами и подопытными животными значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют куриные эмбрионы возрасте от 8 до 12 дней. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, которые обнаруживают после вскрытия эмбриона на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами. [c.60]

Как и для остальных вирусов, агглютинирующих эритроциты, в реакции гемагглютинации определяют число физических частиц тогавирусов, а не инфекционный титр вируса. Тем не менее во многих случаях это хороший способ оценки качества вирусного препарата. [c.91]

Вопрос о свойствах ГТХ как ингибитора реакции гемагглютинации и о его отношении к нейраминидазе будет подробно рассмотрен в части IX. Способность ГТХ в значительной степени снижать инфекционность вируса гриппа свиньи и эпидемического паротита для куриных эмбрионов [2] объясняется, очевидно, тем, что эти вирусы не способны инактивировать ГТХ. На инфекционность вируса Ли ГТХ почти не действует [2J. Как уже было сказано выше [19, 20], электрофоретическая подвижность ГТХ из мочи здорового человека варьирует от препарата к препарату, несмотря на то что в опытах используют препараты, гомогенные при ультрацентрифугировании. Содержание сиаловой кислоты также изменяется от препарата к препарату [44]. Возможно, что причиной этого является бактериальная нейраминидаза, присутствующая в различных количествах в таких препаратах. [c.163]

ГТХ представляет собой очень большую нитевидную молекулу с молекулярным весом около 7 -10 . Молекула ГТХ, вероятно, построена из ряда глобулярных гликопротеиновых субъединиц с молекулярным весом около 28 ООО. Она представляет собой компактную жестко связанную молекулу, устойчивую к влиянию внешней среды, нагреванию, изменению pH и ионной силы, к действию неводных растворителей и протеолитических ферментов. Весьма возможно, что молекулы ГТХ составляют значительную часть наружного гликопротеинового слоя клеточных мембран и определяют их свойства. Показано изменение свойств ГТХ при различных заболеваниях, включая кистозный фиброз и болезни почек. Хорошо известно, что ГТХ угнетает реакцию гемагглютинации под влиянием вируса гриппа и даже является ингибитором действия вирусов при эпидемическом паротите и гриппе свиньи. Его способность тормозить гемагглютинацию под действием вирусов связана с тем, что он сам является субстратом для нейраминидазы. Однако действие нейраминидазы на ГТХ выражено слабее, чем ее действие на многие другие субстраты. [c.164]

При постановке реакции гемагглютинации (FPV) с культуральной жидкостью из зараженной камеры гемагглютинины обнаружены в титре 1 40, 1 80, 1 160. Культуральная жидкость из незараженных зеркальных камер положительной реакции гемагглютинации не давала, что свидетельствует об отсутствии вируса. [c.72]

Рис. 8.5. Идентификация вируса полиомы в реакции гемагглютинации. Титруют три вирусных препарата, разведенных в 100 раз. Препараты D и F имеют титр 4-10 ГАЕ/мл (максимальное разведение, при котором еще наблюдается гемагглютинация, составляет 1 4096 ряды D и F, лунки 11). Препарат Е имеет титр 5-10 ГАЕ/мл (максимальное разведение, при котором еще наблюдается гемагглютинация, составляет 1 512 ряд Е, лунка 8)

Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации [c.169]

Лабораторная диагностика. Материалом для обнаружения вируса или вирусного антигена служат мазки-отпечатки со слизистой оболочки носовой полости, отделяемое носоглотки, при летальных исходах — кусочки легочной ткани или мозга. Экспресс-диагностика основана на выявлении вирусного антигена с помощью РИФ разработана тест-система для ИФА. Для вьщеления вирусов используют куриные эмбрионы. Индикацию вирусов гриппа осуществляют при постановке реакции гемагглютинации. Идентифицируют выделенные вирусы поэтапно типовую принадлежность определяют с помощью РСК, подтип — РТГА. Серодиагностику проводят с помощью РСК, РТГА, PH в культуре клеток, реакции преципитации в геле, ИФА. [c.251]

Результаты РГА зависят от ряда факторов видовой и индивидуальной чувствительности эритроцитов, температуры, pH среды и т.д. Гемагглютинацию эритроцитов могут вызывать и некоторые микроорганизмы — стафилококки, эшерихии, а также сальмонеллы, шигеллы, холерный вибрион Эль-Тор. Поэтому при выявлении вирусов в материале, загрязненном бактериями, нужно с осторожностью подходить к оценке результатов реакции. [c.269]

Антигенные варианты, селекционированные с моноклональными антителами, очевидно, утратили антигенный сайт на НА, так как в каждом случае моноклональное антитело (которое связывается очень эффективно с НА дикого типа) совершенно неспособно связываться с антигенным вариантом. Были проведены эксперименты для ответа на вопрос, появляется ли новый антигенный сайт на молекуле НА вариантов при потере первоначального сайта. Гипериммунные антисыворотки к молекулам вариантов абсорбировали с очищенным концентрированным вирусом дикого типа до тех пор, цока титры антисывороток для вируса дикого типа в реакции ингибиции гемагглютинации не обнаруживались. Абсорбированные сыворотки затем испытывали с вариантами вирусов. Когда сыворотки против вариантов, отобранных с моноклональными антителами Н14/А2 и Н14/А21, для которых изменения последовательности заключались в замене аспарагина 53 на лизин и серина 205 на тирозин соответственно [62], абсорбировали с вирусом Меш/71 дикого типа, не оставалось активности ингибиции [c.138]

Пуэ [20] и Перлманн с сотр. [19] показали, что после обработки препаратов ГТХ человека нейраминидазой их электрофоретическая подвижность изменяется приблизительно от —8,4-10" до —6,7-10 см сек в при pH 7. Это может происходить в результате уменьшения отрицательного или (по данным титрования) увеличения положительного заряда ГТХ. При pH 7 гидроксильная группа тирозина не заряжена и не может обусловливать такое изменение в подвижности. Пейп и Максфилд [45] нашли, что молярное количество аргинина в ГТХ, определенное по методу Сакагучи, увеличивается после действия нейраминидазы пропорционально количеству отщепленной NANA. Благодаря этому факту становится понятным обнаруженное увеличение положительного заряда, о котором было сказано ранее. В противоположность необычному поведению тирозина в ГТХ человека увеличение количества аргинина наблюдается в каждом из четырех исследованных гликопротеинов, оказывающих тормозящее действие на реакцию гемагглютинации под действием вирусов. В гликопротеипе, не оказывающем тормозящего действия (например, в фетуине), никаких изменений количества аргинина не обнаружено. [c.161]

ГТХ не только угнетает реакцию гемагглютинации под влиянием миксо-Бирусов, но сам способен вызывать гемагглютинацию. Барнет [50] показал, что эта способность ГТХ ноБЫшается после воздействия на него вируса и уменьшается при обработке мочевиной. Результатом разрушающего действия мочевины на ГТХ [14] является уменьшение его вязкости, потеря гемагглютинирующих свойств и способности угнетать реакцию гемагглютинации и, наконец, исчезнование антигенных свойств. ГТХ обладает относительно невысокой антигенной активностью. [c.163]

Таким образом, эффекты ультрамалых доз отнюдь не являются парадоксальными в кооперативных системах. В традиционной фармакологии эти закономерности описываются функцией насыщения доза—отклик . Однако биохимическая интерпретация такой зависимости в области ультрамалых концентраций требует определенной осторожности, так как концентрация рецепторов, взаимодействующих с лигандом, не учитывается в уравнении, приведенном на с. 130. Традиционно предполагается, что концентрация рецепторов значительно меньше концентрации специфических лигандов и соответственно реакцию можно описать уравнением первого порядка. В тех системах, где концентрация или активность лигандов может быть измерена независимым биохимическим и одновременно биологическим методами, линейной корреляции между ними, как правило, не наблюдается. В частности, при сравнении активности нейраминидазы по гидролизу олигомерного субстрата с ее активностью по гидролизу рецепторов эритроцитов между ними наблюдается нелинейная зависимость. В этом случае, как и в реакции гемагглютинации эритроцитов вирусами гриппа и при многих других биологических взаимодействиях, измеряемых на определенном отрезке времени, титр реакции (отклик) связан с аналитической концентрацией реагента логарифмическим законом (Шатаева и др., 1978), Это свидетельствует о том, что реакции, возбуждаемые реагентом при воздействии на клетку, могут иметь не кооперативный, а каскадный (цепной) характер. [c.133]

Другой метод — реакция гемагглютинации. Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости клеточной культуры либо хорион-аллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглютинацию— скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок — вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин. [c.58]

Определить репродукцию вируса в клеточной культуре и курином эмбрионе а) по ЦПД,- б) с помощью реакции гемагглютинации с куриными ч>ит-роцитами. [c.61]

В образцах аллантоисной жидкости перед их объединением и инактивацией титруют содержание вируса, используя реакцию гемагглютинации. [c.399]

Учет результатов реакции не следует откладывать надолго. Помимо гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа локализован фермент нейраминидаза (НА), отщепляющий от олигосахаридов концевые остатки сиаловой кислоты. Поскольку гемагглютинин присоединяется к поверхности эритроцитов именно через остатки сиаловой кислоты, действие нейраминидазы нарушает связи между вирионами и клетками. Поэтому через некоторое время слой агглютинированных эритроцитов начинает разрушаться ( коллапсировать ). Некоторые штаммы вируса гриппа имеют столь высокую нейраминидазную активность, что быстрое удаление клеточных рецепторов препятствует агглютинации при комнатной температуре. В этом случае рекомендуется ставить реакцию гемагглютинации при 4°С. [c.173]

Из каждого яйца отбирают аллантоисную жидкость и проводят реакцию гемагглютинации. При этом нет необходимости для каждого образца аллантоисной жидкости готовить последовательные разведения. В этом случае достаточно определить, размножался ли вирус в данном эмбрионе или нет. Для этого 25 мкл исследуемого образца разводят в 0,25 мл физиологического раствора в лунке планшета или в пробирке и добавляют [c.175]

Вирус можно сконцентрировать из осветленной аллантоисной жидкости или культуральной среды, добавляя формалинизиро-ванные эритроциты до конечной концентрации 5% (объем на объем). Суспензию, содержащую эритроциты и вирус, инкубируют 1 ч при 4 °С при осторожном перемешивании. После этого эритроциты с адсорбированным на них вирусом осаждают центрифугированием 10 мин при 2000 g и 2 раза промывают осадок охлажденным до 0°С физиологическим раствором. Эффективность адсорбции можно проконтролировать в реакции гемагглютинации с содержащей вирус жидкостью до и после адсорбции иа эритроцитах. Если эффективность адсорбции ниже 90%, процедуру можно повторить с новой порцией эритроцитов. Адсорбированный вирус элюируют с эритроцитов, перемешивая суспензию в 10 мл физиологического раствора 30 мин при 37 °С. Затем эритроциты удаляют центрифугированием 10 мин при 2000 g и собирают супернатант, содержащий вирус. Эффективность элюции зависит от активности вирусной нейраминидазы, отщепляющей остатки сиаловой кислоты от клеточных рецепторов, что приводит к высвобождению вируса. Супернатант разводят NTE по крайней мере в 6 раз, вирус осаждают центрифугированием 30 мин при 200 000 g и 4°С, а затем ресуспендируют в подходящем буфере для хранения. [c.187]

В этом разделе мы рассмотрим ряд методов определения концентрации вируса в различных препаратах. При необходимости определение инфекционного титра проводят методом бляшек (см. разд. 6.1), который позволяет наилучшим образом охарактеризовать вирусный препарат. Недостаток данного метода состоит в том, что он требует довольно много времени. Во многих случаях приблизительный титр определяют по проценту инфицированных клеток методом иммунофлуоресцентного окрашивания на Т-антиген (для этого сравнивают значения, полученные при инфицировании культур тестируемым препаратом и препаратом, титр которого известен). С помощью реакции гемагглютинации (см. разд. 6.2) так же, как и путем измерения оптической плотности или электронной микроскопии препаратов, можно определить общее количество вирусных частиц, в том числе пустых капсидов, псевдовирионов (содержащих вместо вирусной ДНК фрагментированную ДНК клетки-хозяина) и ДИЧ [12]. По соотношению между БОЕ и ГАЕ можно сделать вывод о наличии дефектных частиц в препаратах вируса. Для хороших заготовок вируса это соотношение составляет около 5-105—10 [13]. С большей точностью дефектные и другие нестандартные вирионы можно выявить, экстрагируя вирусную ДНК из небольшого объема заготовки (или лизата) и исследуя ее с помощью рестрикционного анализа или электрофореза (см. разд. 6.3). [c.235]

В качестве примера приводим схему концентрирования и очистки вируса Сендай из аллантоисной жидкости [48]. Аллантоисную вируссодержащую жидкость разводят вдвое ОД4 М раствором Na l, охлаждают до 2 и добавляют охлажденные формалинизированные эритроциты (6 мл 50%-ной суснензии на каждые 100 мл вируссодержащей жидкости). Смесь оставляют на один час нри температуре 3—4°, периодически поменгавая. После этого смесь центрифугируют при 1200 g в течение 10 минут в рефрижераторной центрифуге. К осадку эритроцитов добавляют 1/50 — 1/10 исходного объема теплого физиологического раствора перемешивают и инкубируют при 37 в течение одного часа. Эритроциты осаждают при 2000 g в течение 20 минут. Элюат, содержащий вирус, фильтруют для удаления обломков эритроцитов через бумажный или стеклянный фильтр. Процедуру повторяют, добавляя свежие формалинизированные эритроциты. Элюаты, содержащие вирус, объединяют. Ход очистки контролируют при помощи реакции гемагглютинации. [c.106]

При другом типе реакции гемагглютинации используется способность комплекса вируса с антителами связывать комплемент. Затем этот комплекс добавляют к суспензии эритроцитов, что приводит к их агглютинации. Этот метод был использовахг Нелсоном и Деем [1265] при работе с вирусом мозаики цветной капусты. [c.369]

Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации — склеиванию эритроцитов. Явление гемагглютинации впервые было обнаружено в 1941 г. при культивировании в куриных эмбрионах вирусов гриппа. Позднее было установлено, что гемаггл юти пирующими свойствами обладают многие вирусы. На основе этого феномена была разработана техника реакции гемагглютинации (РГА) вне организма (in vitro), которая широко применяется для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Куриные эмбрионы не являются универсальной биологической моделью для вирусов. Почти неограниченные возможности появились у вирусологов после открытия метода выращивания культур клеток. [c.56]

Реакция торможения гемагглютинации РТГА). Эта реакция основана на блокировании вирусных гемагглютининов специфическими антителами. Ее можно рассматривать как частный случай реакции нейтрализации. РТГА может быть использована как для серологической диагностики, так и для идентификации гемагглютинирующих вирусов. Феномен РТГА проявляется в образовании компактного осадка эритроцитов вместо зонтика гемагглютинации. Реакцию проводят на полистироловых пластинах и оценивают по отсутствию склеивания эритроцитов, добавленных к смеси вируса и специфической сыворотки. Для удаления или разрушения неспецифических ингибиторов гемагглютинации сыворотки, используемые для РТГА, предварительно обрабатывают перйодатом калия, каолином, бентонитом, ацетоном или другими веществами. Затем готовят двукратные разведения сыворотки в ИХН и к каждому разведению добавляют равное количество вирусосодержащей жидкости с активностью 4 ГЕ. Смесь инкубируют 30 — 60 мин при необходимой для данного типа вирусов температуре (0,4, 20, 37 °С), а затем добавляют равный объем 0,5 — [c.271]

Вероятно, изучение диссоциации ГТХ под действием мочевины [14], рассмотренное выше, необходимо проводить параллельно с измерением отношения осей по вязкости. Такой подход позволил прийти к важному выводу о том, что угнетающее действие на гемагглютинацию, вызываемое вирусами, оказывают в равной степени основные молекулы ГТХ, половина и четверть молекулы (ГТХ 2 , ГТХ 2" и ГТХ 2" ). Более мелкие фрагменты не оказывают угнетающего действия на гемагглютинацию. Другими словами, существует определенный минимальный размер субъединиц ГТХ, необходимый для эффекта угнетения гемагглютинации под действием вирусов. Мягкая обработка, приводящая к диссоциации молекул ГТХ, не затрагивает углеводную часть молекулы и не оказывает влияния на активность той ее части, которая является субстратом для нейраминидазы. Действительно, все фрагменты ГТХ, обладающие ингибирующей активностью, дают положительную реакцию Шиффа (йодная кислота реактив Шиффа). Влияние размера молекулы гликопротеипа па его ингибирующие свойства было ранее подчеркнуто Готтшалком [32]. В дальнейшем этот вопрос специально изучали Фазекас де Санта Грос и Готтшалк [33]. [c.157]

Аденовирусы, насчитывающие по меньшей мере 31 антигенный тип, составляют отдельную группу микроорганизмов, вызывающих у человека инфекцию преим[уществеино дыхательных путей н глаз. Вирусы, входящие в группу, обладают общим группоспецифическим антигеном, обнаруживаемым реакцией связывания комплемента, и типоспецифическими антигенами, которые выявляются в реакциях нейтрализации и торможения гемагглютинации. К важным свойствам аденовирусов относятся устойчивость к эфиру, относительная устойчивость в широких границах pH и способность к размножению, сопровождающаяся цитопатиче-скими изменениями в различных культурах клеток человека и обезьян. [c.42]

Присутствие вируса может быть обнаружено методами стандартной нейтрализации (подавление гемадсорбции, бляшкооб-разования, гемагглютинации) 1и Зо с помощью реакции связывания комплемента. [c.137]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология