Дисульфидная связь в пептидах окисление

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

В настоящее время полностью расшифрована аминокислотная последовательность панкреатической рибонуклеазы (она состоит из 124 аминокислотных остатков). Субтилизин гидролизует пептидную связь между 20-м и 21-м аминокислотными остатками рибонуклеазы. Полученный пептид, состоящий из 20 аминокислотных остатков, способен обратимо отделяться от оставшейся части молекулы фермента. Удаление пептида сопровождается утратой активности, а его воссоединение с молекулой — за счет нековалентных связей — приводит к полному восстановлению активности фермента. Далее восстановление четырех дисульфидных связей молекулы рибонуклеазы вызывает полное разворачивание полипептидной цепи фермента. Когда при окислении кислородом дисульфидные связи снова образуются, происходит почти полное восстановление активности фермента. Таким образом, характер складывания полипептидной цепи должен опреде- [c.108]

Окисление надмуравьиной кислотой разрывает дисульфидную связь с образованием пептидов, содержащих остатки цистеиновой кислоты. [c.591]

Дисульфидная связь содержится в очень многих пептидах и белках (окситоцин, вазопрессин, инсулин, лизоцим и др.). Кератин (белок волос и шерсти) содержит особенно много цистеиновых звеньев, способных при окислении образовывать дисульфидные связи [c.370]

Таким образом, результаты этих опытов показывают, что конформация молекулы, обусловливающая ее ферментативную активность, полностью определяется последовательностью аминокислот в полипептидной цепи. Для того чтобы остатки цистеина соединились правильно, пе нужно никакого специального фермента. Образование специфических дисульфидных связей требуется, по-видимому, лишь для стабилизации активной конформации, а не для ее возникновения. В результате восстановления и последующего окисления рибонуклеазы образуется продукт, имеющий ту же ферментативную активность, ультрафиолетовый спектр, характеристическую вязкость, дисперсию оптического вращения и те же иммунологические свойства, что и нативный фермент. Пептидные карты, получаемые после ферментативного расщепления этих двух веществ, также идентичны. Если 6l.i расположение дисульфидных связей в нативной и реконструированной рибонуклеазе было различным, пептиды, содержащие такие связи, не могли бы попасть, на одинаковые места карты. [c.279]

В определенных условиях молекулу рибонуклеазы можно расщепить с помощью фермента субтилизина. При этом разрывается связь между 20-м (аланин) и 21-м (серии) остатками и образуется два пептида — короткий (называемый 5-пептидом), содержащий 20 остатков, и более длинный (называемый 5-белком) из 104 остатков. Поскольку первый остаток цистеина находится в молекуле на 26-м месте, отщепление 5-пептида, состоящего из 20 первых аминокислотных остатков, равнозначно отщеплению хвоста фермента. По отдельности ни хвост , ни 5-белок не проявляют ферментативной активности, но их экви-молярная смесь активна. Очевидно, несмотря на разрыв связи между 20-м и 21-м остатками, благодаря взаимодействию боковых цепей образуется активная третичная структура. Если, так же как это делалось в случае нативного фермента, восстановить, а затем вновь окислить 5-белок, то получающийся продукт ничем не отличается от первоначального 5-белка. После добавления к реконструированному 5-белку 8-пептида активность в большой степени восстанавливается. По-видимому, правильное образование дисульфидных связей происходит и в отсутствие 5-пептида. Однако он все же несет какую-то определенную функцию, так как в его присутствии уменьшается количество осадка, состоящего, как предполагают, из молекул, связанных поперечными связями. Если опыт по восстановлению и последующему окислению производится с раствором, содержащим как 5-пептид, так и 5-белок, процент растворимого активного материала оказывается более высоким. [c.280]

Обычно синтез пептидов, содержащих цистин, проводят так, что дисульфидная связь образуется па последнем этапе синтеза при окислении свободных ЗН-групп (путь а). При этом традиционном способе требуется защита ЗН-группировок цистеина. В последнее время обсуждаются практические достоинства другой принципиальной возможности синтеза (путь б), исключающей необходимость таких защит поскольку установлено, [c.103]

Механизм формирования нативных молекул из денатурированных можно исследовать при помощи белков с восстановленными дисульфидными связями. Реокисление таких белков сопровождается их ренатурацией, и на стадиях, соответствующих частичному окислению, могут быть обнаружены промежуточные формы. Для этого останавливают реакцию в соответствующий момент времени, когда успевает образоваться какая-то часть дисульфидных связей, и обрабатывают белок одной или несколькими протеазами, с тем чтобы выделить фрагменты, содержащие S—S-связи. Полученные пептиды можно сравнить с пептидами, выделенными подобным же образом из нативного белка. [c.234]

Стадии гидролиза обычно предшествует денатурация, приводящая к разворачиванию белковой глобулы Во избежание получения дополнительных артефактных пептидов за счет наличия или образования в процессе расщепления дисульфидных связей 5Н-группы в белке до гидролиза модифицируют различными способами (окисление надмуравьиной кислотой — с. 124, карбоксиметилирование, обработка тиосо-единениями и др.). [c.139]

Параллельно с определением последовательности аминокислотных остатков в рибонуклеазе проводилось и определение положения дисульфидных мостиков. Спакман, Мур и Штейн нашли, что рибонуклеазу можно гидролизовать трипсином и химотрипсином без предварительного окисления дисульфидной связи, если проводить гидролиз в 2-мо-лярном растворе хлоргидрата гуанидина. Ими было получено-6 пептидов, которые затем подвергались окислению надмуравьиной кислотой и исследовались. Таким образом было установлено, что 5—8 мостики расположены в положениях 1—б, 2—7, 3—8 и 4—5. [c.524]

Внутримолекулярные дисульфидные связи имеются, например, в окситоцине, вазо-прессиие, в А-цепи инсулина и в рибоиуклеазе. Межмолекулярные дисульфидные связи соединяют между собой цепи пептидов, причем ковалентно связанными могут быть как идентичные цепи, как в окисленной форме глутатиоиа, так и различные цепи, как в инсулине. Дисульфидные связи имеют большое значение для образования и стабилизации определенных пептидных и белковых структур. [c.87]

SH-группы остатков цистеина и существующие исходно или возникающие в ходе реакции дисульфидные связи могут стать источником артефактов при полном или частичном гидролизе исследуемых белков и пептидов. Дисульфидные мостики, возникающие в результате окисления SH-rpynn, могут а) неспецифически расщепиться в ходе гидролиза или б) при ферментативном гидролизе обусловливать обрг зование фрагментов сложной структуры. [c.165]

Рис. 4.10. Две соседние полилептидные цепи соединены дисульфидной связью (затенена). Расщепление этой связи путем окисления надмуравьиной кислотой слева) или путем восстановления Р-меркаптоэтанолом справа) приводит к образованию двух пептидов, содержащих остатки цистеи-новой кислоты или цистеина соответственно.

При расшифровке последовательности остатков аминокислот в Б частично гидролизуют полипептидную цепь, разделяют получающиеся фрагменты, определяют их аминокислотный состав и выясняют т. наз. N- и С-концевыми методами чередование в них аминокислотных остатков Применяя различные способы частичного гидролиза, устанавливают строение большого числа различных пептидных фрагментов, затем находят тождественные (перекрывающиеся) участки этих пептидов, по этим данным устанавливают последовательность расположения остатков в исходной цепи. Если молекула Б. состоит из нескольких полипептидных цепей, то их предварительно разделяют. Полипептидную цепь, состоящую из большого числа (ботее 150—200) остатков, предварительно подвергают Селективному гидролизу на несколько частей (напр., обработкой бромцианом, обычно разрывающим пептидные связи около немногочисленных остатков метионина). Локализацию дисуль-фидных связей устанавливают частичным (обычно ферментативным) гидролизом, выделением пептидов с дисульфидными связями и разрывом этих связей окислением (напр, надмуравьиной к-той), каждую образующуюся пару пептидов с сульфогруппами цистеиновой к-ты разделяют, устанавливают строение пептидов и находят их места в уже расшифрованной полипептидной цепи. [c.121]

В реакции окислительного расщепления пептидной связи тирозина N-иодосукцинимид столь же эффективен, как и N-бромо-сукцинимид. Реакцию проводят при pH 4,5, выход на модельных соединениях и простых тирозинсодержащих пептидах составляет 25—95%. Механизм реакции идентичен расщеплению с помощью N-бромосукцинимидом [100]. Показано, что пептидная связь тирозина расщепляется с умеренным выходом при электролитическом окислении на платиновом электроде. При этом в отличие от реакции с N-бромосукцинимидом не наблюдается расщепления по триптофану и гистидину однако идет окисление других функциональных групп (имидазоль-иых, тиоэфирных, дисульфидных и аминогрупп), правда с меньшей скоростью, чем фенольных групп тирозина. С помощью этого метода были специфически фрагментированы по остатку тирозина ангиотензин, инсулин и рибонуклеаза [30]. [c.118]

Данных по аминокислотной последовательности каждой полипептидной цепи белка еще не достаточно для установления его первичной структуры. Необходимо определить число и местоположение дисульфидных мостиков, связывающих эти цепи в единое целое. Разрешение этой задачи требует очень мягких условий гидролиза, ибо воздействие таких реагентов, как концентрированная соляная кислота приводит к окислению цистина до цистеиновой кислоты и ряда других продуктов. Поэтому белок подвергают энзиматическому гидролизу в возможно более мягких условиях и в присутствии тиоловых ингибиторов (например, Ы-этилмалеинимида). Часто для этой цели используют пепсин и химотрипсин, и расщепление ведут при pH 1,9 и 8,0 соответственно. Полученную смесь пептидов подвергают разделению с помощью одного или нескольких перечисленных выше приемов, п фрагменты, содержащие дисульфидную связь, выделяют в чи- [c.86]

Изучение последовательности аминокислотных остатков в рибонуклеазе практически началось с работ К. Анфинсена и его сотрудников, которые в 1954 г. при помощи метода динитрофенилирования установили, что ее молекула представляет собой одиночную пептидную цепь, на М-конце которой имеется следующая последовательность аминокислотных остатков лиз.глу.-тре.ала. [1]. Немного позже к изучению химической природы рибонуклеазы приступила группа исследователей Рокфеллеровского института в США, во главе которой стояли Мур, Стейн и Хирс. Группа этих ученых провела определение химического состава рибонуклеазы и установила, что составляющая ее полипептидная цепь содержит 124—126 аминокислотных остатков, которые были определены количественно [413]. Следующим этапом изучения химического строения рибонуклеазы явилось окисление ее надмуравьиной кислотой при низкой температуре, что исключало возможность модификации тирозина. При этом происходил разрыв дисульфидных связей с образованием восьми сульфоновых групп и переход четырех остатков метионина в соответствующее сульфоновое производное. После гидролиза трипсином изучали тринадцать наиболее крупных пептидов, содержавших все 124 аминокислотных остатка, входивших в состав рибонуклеазы [255]. Для выяснения порядка соединения этих пептидов друг с другом было проведено параллельное исследование пептидов пептического и химотриптического гидролизатов, что позволило построить неполную формулу окисленной рибонуклеазы, которая была дополнена сведениями о расположении амидных групп глютаминовой и аспарагиновой кислот [39]. [c.136]

В цикле работ по определению структуры инсулина Сенгер и др. [35—37] впервые наблюдали дисульфидный обмен при частичном гидролизе белка в конц. НС1 на холоду. При более детальном исследовании на модельных системах, включающих бис-2,4-динитрофенил-ь-цистин (бис-ДНФ-цистин) и цистилбис-глицин или окисленный глутатион, установлено, что реакция дисульфидного обмена протекает как в концентрированных минеральных кислотах, так и в слабоосновной среде, правда, по различному механизму. В кислой среде обмен ингибируется тиолами, в основной среде тиолы служат катализаторами, а SH-реагенты ингибиторами [35]. В этой же работе найдены условия частичного гидролиза инсулина с сохранением положения дисульфидных мостиков, благодаря чему было определено их положение в молекуле гормона. В работе [41] на примере взаимодействия цистина с окисленным глутатионом изучена стабильность дисульфидных связей в различных условиях при этом показано, что дисульфидный обмен минимален при pH 2—6,5. Кроме того, при протеолизе рибонуклеазы в условиях, способствующих дисульфидному обмену, получены ци-стинсодержащие пептиды, включающие лишь две из четырех [c.165]

Проинсулин представляет собой единую полипептидную цепь, в которой есть последовательность примерно из 30 аминокислот, отсутствующая в инсулине (рис. 35.11). Это связуюш,ий пептид [С-пептид от англ. onne ting-связующий) он расположен между карбоксильным концом В-цепи и ами-ноконцом А-цепи будущего инсулина. Как и предполагалось, проинсулин обладает способностью к формированию правильно расположенных дисульфидных связей после обработки восстанавливающими агентами и последующего повторного окисления. [c.291]

На этой схеме указаны связи, расщепляемые протеиназой. Две дополнительные амидные группы находятся у карбоксильных групп двухосновных кислот, не участвующих в образовании пептидной связи. Два цистеиновых звена в окисленном пептиде образовались при расщеплении образующей цикл дисульфидной группы цистина. [c.695]

Согласно термодинамической гипотезе К. Анфинсена [73], предпосылки для окисления атомов серы цистеинов, образующих в пептидах дисульфидные мостики, обусловлены стерической предрасположенностью соответствующих участков аминокислотной последовательности к таким конформационным состояниям, в которых остатки ys оказьшаются сближенными, а их боковые цепи имеют необходимую для создания S-S-связи взаимную ориентацию. В процессе свертывания пептидной цепи сближенность цистеинов в самых низкоэнергетических конформациях линейной последовательности достигается за счет стабилизирующих невалентных взаимодействий между всеми остатками цепи. Таким образом, предполагается, что механизм спонтанной самоорганизации нативной структуры пептида является не чисто статистическим, а статистико-детерминирован-ным, причем стерически разрешенными или самыми предпочтительными становятся только взаимодействия между определенными парами остат- [c.290]

Зервас [2658] предложил принципиально иной метод синтеза несимметричных пептидов цистина. Исходными соединениями в этом методе служат два 5-замещенных производных цистеина, имеющих различные карбоксилзащитиые группировки эти эфиры цистеина ацилируют по аминогруппе таким образом, что образуется производное нитробензилового эфира фосфорной кислоты (116). Удаление 5-защитных групп и последующее окисление приводят к несимметричному производному цистина (117), дисульфидный обмен у которого невозможен, поскольку связь 5—5 участвует в образовании циклической фосфорсодержащей системы. Селективное отщепление той или иной С-за-щитной группы открывает путь к получению несимметричных пептидов. [c.309]

Успехи в разработке методов изучения белков, в особенности хроматографического метода, позволили Сэнгеру установить строение инсулина. Этому способствовала также обнаруженная им реакция, о которой говорилось выше динитрофе-нильная группа (ДНФ) способна присоединяться к свободным аминогруппам с образованием желтого соединения. ДНФ-группа остается присоединенной к аминокислотному остатку даже после гидролиза, который проводят с целью расш епления пептидов это дает возможность идентифицировать концевой остаток аминокислоты. Применив ДНФ-ме-тод, Сэнгер первым показал, что молекула инсулина состоит из двух цепочек, которые удерживаются одна около другой дисульфидными (3 — 8) связями остатков цистина. Эти связи можно разрушить мягким окислением. Таким способом были получены обе ненарушенные цепочки было доказано, что в одной из них содержится 21 аминокислота, а в другой — 30. Каждая цепочка была подвергнута кислотному гидролизу с образованием небольших фрагментов, аминокислоты которых были определены хроматографичрски. Концевые аминокислоты каждого фрагмента были идентифицированы ДНФ-методом. Постепенно расщепляя цепочки на множество мелких пептидов и определяя содержащиеся в них аминокислоты и последовательность их расположения, Сэнгеру ну- [c.319]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология