Методика анализа физиологических жидкостей

Сокращение времени анализа стало возможным главным образом благодаря улучшению конструкции и надежности анализаторов аминокислот. Этому способствовало также совершенствование и создание сферических ионообменных смол, которые используются в специальных хроматографических системах. Улучшенные смолы дают возможность использовать более короткие колонки при сохранении достаточного числа теоретических тарелок, которое позволяет разделять большое количество различных аминокислот, хроматографируемых обычно по более сложной методике анализа физиологических жидкостей. Так, реальностью стал анализ кислых и нейтральных аминокислот более сложных физиологических жидкостей, приблизившийся по времени к анализу простых белковых гидролизатов. [c.36]

Сравнительно недавно синтезирована смола типа UR-40, которая позволяет определять кислые и нейтральные аминокислоты по методике анализа физиологических жидкостей за 170 мин на колонке высотой 26 см. Основные аминокислоты физиологических жидкостей также могут быть определены на этой же колонке за 210 мин. Одноколоночный метод анализа белковых гидролизатов на этой смоле описан в разд. 1.6. Использование более коротких колонок и улучшение разделения пиков аминокислот стало возможным благодаря устранению специфических перемешивающих узлов (таких, как реактор, подводящие трубки, краны и кюветы), имеющихся в большинстве приборов. [c.36]

Методика анализа физиологических жидкостей [c.61]

Рис. 4. Анализ калибровочной смеси аминокислот и родственных соединений по методике анализа физиологических жидкостей на колонке высотой 26 см со сферической смолой иЯ-40. (Концентрации аминокислот те же, что

По этой методике анализируют аминокислоты и родственные им соединения, реагирующие с нингидрином, которые обычно присутствуют в физиологических жидкостях. Перечень этих соединений приведен в разд. 1.3.1.2. Ниже подробно описаны процедуры анализа физиологических жидкостей на смолах иК-ЗО и иК-40. [c.61]

Программирование. Программирование анализа, т. е. выбор соответствующего аналитического метода, зависит от конкретной задачи. Если в лаборатории определенного профиля обычно проводят однотипные исследования, например анализы гидролизатов или физиологических жидкостей, рекомендуется ограничиться использованием какого-либо одного оптимального метода. Литература по автоматическому аминокислотному анализу очень обширна, к настоящему времени описано значительное число различных методик. Не имеет смысла перечислять все эти методики, поэтому ниже будут приведены лишь те, которые по нашему мнению наиболее удобны (фиг. 36 и 37). [c.179]

Обсуждение. По этой простой методике анализа белковых гидролизатов можно определять 23 соединения, включая обычные аминокислоты. Однако если эти аминокислоты содержатся в физиологических жидкостях, таких, как плазма крови, моча, гомогенаты тканей, то для полного анализа требуется более сложная методика. При одноколоночном методе анализа отпадает необходимость регенерации колонки и уравновешивания смолы буфером. [c.70]

Одновременно разрабатывалась методика анализа аминокислот и других чувствительных к нингидрину соединений в физиологических жидкостях. Гамильтон [8] разработал систему высокого разрешения для таких жидкостей и получил более 175 хроматографических пиков чувствительных к нингидрину компонентов в одном образце мочи хроматографирование длилось около двух дней. [c.233]

В пятидесятых годах, в период бурного развития БХ, был опубликован ряд статей с описанием методик и систем растворителей, предназначенных для разделения белковых гидролизатов или аминокислот, полученных из различных физиологических жидкостей (см. [51, 77]). Эти системы использовались для разделения сложных смесей аминокислот и пептидов и смесей аминокислот, с трудом поддающихся идентификации, например лейцин, изолейцин. С появлением автоматических аминокислотных анализаторов [120], а также новых ионообменников (см. гл. 5) БХ все реже и реже используют для анализа аминокислот и пептидов. В настоящее время в лабораториях, ведущих исследование белков, методом БХ проводят главным образом окончательную очистку простых смесей пептидов, полученных с помощью других методов разделения, кроме того, БХ служит одним из критериев однородности вещества (часто в сочетании с электрофорезом на бумаге), и только в считанных случаях ее применяют для идентификации отдельных аминокислот. [c.121]

Спакман, Стейн и Мур [12] предложили метод анализа кислых и нейтральных аминокислот на колонке размером 150 X X 0,9 см при использовании двух буферов, заменяемых один на другой в середине анализа. Согласно их методу, основные аминокислоты анализируются на второй колонке с использованием третьего буфера более высокой ионной силы и pH. Для анализа основных аминокислот, обычно встречающихся в пептидных и белковых гидролизатах, применяется колонка размером 15 X Х0,9 см. По этой методике для каждой колонки требуется отдельная проба однако методика име1Ет большие возможности. Гак, если необходимы сведения только о нескольких основных аминокислотах, например, в случае анализа физиологических жидкостей, то они могут быть получены без предварительного элюирования кислых и нейтральных аминокислот, которые при одноколоночном методе элюируются в первую очередь. [c.17]

Для одноколоночного хроматографического анализа кислых, нейтральных и основных аминокислот белковых гидролизатов используется такая же колонка высотой 26 см, которая была описана применительно к более сложному анализу физиологических жидкостей (см. разд. 1.6.5). При использовании трех натрийцитратных буферов весь анализ занимает 170 мин. Описанный ниже метод с применением трех буферов позволяет проводить весь анализ при одной температуре. Однако можно осуществить анализ белковых гидролизатов, используя вначале методику анализа для кислых и нейтральных аминокислот физиологических жидкостей (см. разд. 1.6.5.2) и вводя затем третий буфер (сходный с тем, который описан ниже) для элюирования основных аминокислот. Эта методика дает возможность определять не только обычные аминокислоты, содержащиеся в белковых гидролизатах, но также и необычные или неизвестные аминокислоты при минимальном перекрывании пиков. [c.72]

В настоящее время интенсивно развиваются методы автоматического анализа аминокислот. Основы этих методик заложены Спакманом и сотр. [186], которые использовали в своей работе метод ионообменной хроматографии на сильнокислотных катионитах, разработанный Муром и 111тейном [126]. В настоящее время ведутся поиски способов ускорения анализов и совершенствуются анализаторы (см. гл. 8). Разрабатывается техника анализа белков и продуктов гидролиза пептидов, а также физиологических жидкостей. Анализ соединений первой группы проще, поскольку он предусматривает разделение лишь тех 18—20 аминокислот, которые обычно встречаются в продуктах гидролиза пептидов. Анализ физиологических жидкостей слож- [c.305]

При анализе содержания в физиологических жидкостях свободных аминокислот встает задача предварительной полной очистки их от белков. Для малых объемов плазмы (5—25 мкл) была описана элегантная методика осаждения белка холодным (—30°) ацетоном в капилляре (100 X 0,6 мм) с последующим центрифугированием в нем же, после чего кончик капилляра с осадком белка просто обламывали [Arola et al., 1977]. [c.483]

Для измерения pH, рСОг и рОг при помощи электродов различных типов [16, 17] разработан ряд методик [18, 19, 20, 121]. Особенно большое значение в этом случае имеет метод отбора и хранения проб, поскольку парциальное давление кислорода и диоксида углерода в пробах цельной крови и плазмы, если не принять специальных мер предосторожности, сравняется с их парциальным давлением в воздухе. Кроме того, так как показания электродов зависят от правильности их градуировки и эксплуатации, их следует периодически (через каждые несколько часов) проверять, используя градуировочную смесь газов соответствующей концентрации. При помощи специальной компьютерной системы операцию градуировки можно автоматизировать. Физиологические жидкости удобно анализировать методом атомно-абсорбционной [22] и эмиссионной спектроскопии [23]. После соответствующей предварительной обработки исследуемый образец вводят в виде раствора в пламя, где происходит его атомизация. В эмиссионном спектральном анализе энергия пламени используется для возбуждения атомов. В результате перехода из возбужденного состояния в основное они испускают излучение с характеристическими длинами волн, интенсивность которого пропорциональна концентрации определяемых атомов в пламени. В атомно-абсорбционном анализе через атомный пар пробы пропускают излучение и регистрируют его. При этом интенсивность излучения снижается в соответствии с I) показателем поглощения элемента при той длине волны, при которой проводятся измерения, 2) длиной пути, пройденного излучением в образце, и 3) концентрацией определяемого элемента. Если первые две величины поддерживаются постоянными, то, измерив поглощение, можно установить концентрацию элемента. Эти два метода дополняют друг друга, и в каждом конкретном случае аналитик выбирает тот из них, который в данной ситуации более чувствителен и более точен. Эмиссионный спектральный анализ может быть менее селективен, чем атомно-абсорбцион-ный, и более подвержен спектральным помехам. Одни элементы можно определять и тем и другим методом (А1, Ва, Са), другие лучше анализировать методом атомно-абсорбционной спектроскопии (например, Ве, В1, Ли, 2п), третьи же целесообразнее определять атомно-эмиссионным методом (и, Ки, N. ТЬ и т. д.). [c.29]

Методика ВР. Эта методика ускоренного анализа позволяет определять все основные аминокислоты, обычно обнаруживаемые в физиологических жидкостях. Ее рекомендуется использовать для количественного определения аминокислот при таких патологических состояниях, как болезнь Вильсона, цитруллине-мия, псориаз, а также для определения алиментарных колебаний уровня аминокислот. Анализ проводят по следующему режиму. Буфер и нингидриновый реагент подают со скоростью соответственно 90 и 45 мл/ч. Анализ начинают с 0,38 н. натрийцитратным буфером pH 4,263 при температуре колонки 33,0 °С. Через 125 мин температуру повышают до 55,0 °С и заменяют буфер — на 0,35 н. натрийцитратный с pH 5,360. Продолжительность анализа 240 мин. [c.76]

Метод определения азота, предложенный Дюма, особенно в модификации Кирстена [342], имеет самое широкое применение. Однако этот метод непригоден для определения азота в водных растворах (например, в моче, крови и других физиологических жидкостях). В этих случаях более удобен метод Кьельдаля, отличающийся простотой аппаратуры и скоростью выполнения анализа. Особенна удобен этот метод при серийных определениях азота. Метод Кьельдаля в таком виде, в каком его впервые предложил автор, имел ограниченное, применение. Дополнения, введенные в методику на протяжении нескольких десятков лет, сделали ее одной из наиболее точных и простых в ися олнении, хотя область ее применеиия уже, чем область применения усовершенствованного метода Дюма. Метод неприменим без дополнительных операций для определения азота в нитросоединениях, некоторых гетероциклических соединениях и легколетучих веществах. [c.85]

Бенсон и Паттерсон [15] описали методику быстрого хроматографического анализа аминокислот, входящих в состав физиологических жидкостей. Они использовали гранулированные иониты и иониты со сферическими зернами и вели анализ по слегка модифицированному варианту двухколоночной методики Спакмана и сотр. [186] с применением аминокислотного анализатора Be kman Spin o Model 120 С (см. гл. 8). Позднее Бенсон и сотр. [14] приспособили эту методику для анализа соединений нейтрального и кислотного характера в присутствии литиевых буферных растворов, которые обеспечивают хорошее разделение глутамина и аспарагина. Авторы работы [15] применили эту методику для разделения соединений основного характера, а авторы [14]—для разделения соединений с нейтральными и кислотными свойствами. В обоих случаях применялись иониты со сферическими частицами и нингидриновый реагент [186]. [c.306]

Методика определения лекарственных препаратов в выделениях человека и физиологических жидкостях [182] позволяет проследить за процессом лечения. С другой стороны, анализ выделений важен при определении критической дозы лекарственных препаратов при терапии, поскольку может существовать узкая граница между терапевтическими и токсическими дозами лекарств, назначаемых пациенту. Метод ПГХ можно применить в этом случае как для контроля содержания лекарственных компонентов в физиологических жидкостях, так и в исходных лекарственных препаратах. В этом отношении представляет интерес применение метода для прямого дифференцирования и определения карденолидов в лекарственных препаратах и биологических жидкостях [193]. Особый интерес среди стероидных препаратов, провоцирующих сердечно-сосу-дистые заболевания, представляют препараты, содержащие ди-гоксин. Особенности лечения этими препаратами как раз связаны с узкими концентрационными пределами применения (от 0,8 до 1,6 нг/мл, концентрация 2,4 нг/мл является уже вредной для здоровья). Изучали возможность применения ПГХ для идентификации дигоксинов (дигитоксигенина и дигоксигенина), различающихся лишь содержанием еще одной гидроксильной группы в дигоксигенине. На пирограммах этих стероидов обнаружены пики соединений, содержащихся в тяжелой фракции продуктов пиролиза в разном количественном отношении. [c.225]

Перфузия органа. Используя метод перфузии изолированного органа in vitro, можно вводить то или иное вещество и выяснить путь его превращения с помощью анализа выходящей из органа жидкости. Орган помещают в замкнутую систему, в которой циркулирует соответствующая обогащенная кислородом жидкость под повышенным давлением. В состав циркулирующей среды может входить дефибринированная или цельная кровь, содержащая соответствующий антикоагулянт (гл. 29) или эритроциты, суспендированные в растворах физиологически изотонических солевых смесей, которые должны имитировать нормальную плазму по pH, ионной силе и ионному составу. Этот подход используют при исследовании печени, сердца, почек и тонкого кишечника такие опыты способствуют пониманию роли этих органов в метаболизме. Результативность перфузии органов в изучении метаболизма сильно возросла после разработки методик, в которых изотопно меченный метаболит перфузируется в течение очень короткого периода, и метаболизм резко останавливают быстрым замораживанием ткаии ( ледяные тиски ) таким образом удается выяснить распределение изотопа среди множества родственных метаболитов в течение нескольких секунд после его введения и через последующие фиксированные интервалы времени. [c.388]