Завершение ферментативной реакции

Увеличение времени инкубации далеко не всегда приводит к повышению чувствительности определения. В каждом случае необходимо проверять, происходит ли при более длительной инкубации дальнейшее развитие окраски или ее ослабление, особенно в случае проведения реакции при повышенной температуре. Для уяснения вероятности ослабления окраски в ходе ферментативной реакции смесь стандартов с конъюгатом [пероксидаза — IgG] после завершения начальной фазы превращения субстрата длительно инкубировали при 25 и 37 °Q. Как видно на рис. 12-7, после 30 мин инкубации при 37 развитие окраски практически прекращается, в то время как при 25 С на этом же этапе окраска продолжает интенсивно нарастать. [c.181]

Пути возникновения пуриновых и пиримидиновых оснований различны. Но есть некоторые черты сходства в механизмах их синтеза. К их числу относятся 1) широкое использование гли, асн и глн в качестве источников азота гетероциклических колец 2) включение в состав пуриновых и пиримидиновых циклов атомов углерода из СО2 и формиата 3) построение пуринового основания и завершение синтеза пиримидинового основания на рибозо-5-фосфате, в результате чего конечными продуктами биосинтеза являются сразу нуклеозид-5 -фосфаты, а не свободные А, Г, У, Ц и Т 4) ферментативный характер всех реакций, осуществляющихся в процессе новообразования нуклеотидов 5) возникновение на определенном этапе биосинтеза предшественников, из которых потом формируются уже индивидуальные нуклеозид-5 -фосфаты. [c.235]

Нуклеофильное замещение является простой реакцией замещения, в которой нуклеофильный агент (основание) приближается к атому углерода или фосфора с дефицитом электронов (электрофильный центр) и образует с ним связь, замещая при этом какой-либо другой атом, например О, N или 5. Замещаемый атом уходит вместе с неподеленной парой электронов и с любой другой присоединенной к нему химической группировкой, причем все это вместе называется уходящей группой. Обычно для завершения реакции необходимо, чтобы одновременно с замещением или после него к атому О, N или 5 уходящей группы присоединился протон, происходящий из кислотной группы фермента или воды. Заметим, что основание В (которое может нести отрицательный заряд или быть электронейтральным) часто образуется путем ферментативного удаления протона от сопряженной кислоты ВН. [c.91]

Исследования по ферментативному гидроксилированию фенилаланина недавно были обобщены Кауфманом [38], в лаборатории которого проведены почти все эти работы. Среди ферментов нужно выделить группу, определяемую как оксидазы со смешанной функцией , которым для завершения гидроксилирования необходимы как кислород, так и внешний восстанавливающий агент. Первоначально предполагали, что физиологически активным восстанавливающим агентом является ТПН-Н, и в общем виде реакцию можно написать так [c.321]

После завершения ферментативной реакции в микроэмульсии фермент можно регенерировать для повторного использования, например, путем добавления в систему избытка ацетона. Фермент при этом выпадает в осадок в виде так называемого ацетонового порошка, сохраняя каталитическую активность, тогда как основная доля ПАВ вместе с продуктом реакции остается в растворе. Последнее обстоятельство является одним из основных недостатков микроэмульсий как среды для проведения ферментативных реакций, поскольку отделение продукта от примеси ПАВ нередко представляет собой весьма трудную задачу. [c.75]

Завершение ферментативной реакции [c.141]

Таким образом, для определения бимолекулярной константы скорости необратимого взаимодействия фермента с ингибитором необходимо в стандартных условиях определить активность фермента (скорость ферментативной реакции) в отсутствие ингибитора (оо). Далее нужно к раствору фермента (в той же концентрации) прибавить ингибитор в концентрации [I]. Величина [I] может быть выбрана на основании предварительного определения концентрации ингибитора, при которой активность фермента подавляется полностью (при завершении реакции). При измерении берется в 20—100 раз ббльшая концентрация [I]. Для определения величин необходимо через различные промежутки времени прекратить (или существенно замедлить) взаимодействие фермента с ингибитором и определить остаточную активность фермента в тех же условиях, при которых была определена Vo. Расчет констант производится по уравнению (УП1.28). Основную трудность в этом методе представляет прекращение реакции фермента с ингибитором (в особенности неконкурентным) в нужный момент времени. Наиболее простой способ — проведение реакции ингибирования при достаточно высокой концентрации реагирующих веществ с последующим сильным разбавлением раствора перед введением в систему субстрата и измерением скорости ферментативной реакции. Например, если исходная концентрации фермента (и, соответственно, ингибитора) в 30—40 раз выше, чем необходимо для последующего измерения активности фермента, то разбавление системы в 30—40 раз приведет к снижению скорости взаимодействия фермента с ингибитором в 900—1200 раз. Тогда при достаточно быстром измерении начальной скорости каталитического превращения субстрата скоростью последующего ингибирования можно пренебречь. [c.116]

Отличительная черта этого способа иммобилизации состоит в том, что ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается не за счет его взаимодействия с жестким носителем (адсорбентом, гелем или мембраной), а вследствие его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы. Что касается субстрата и продукта ферментативной реакции, то они распределены между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного цикла процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор. [c.72]

Из числа известных в настоящее время ферментов примерно 40%, проявляют свои каталитические функции в присутствии добавочных соединений небелковой природы—коферментов, или коэнзимов. К числу таких ферментов относятся большинство оксидоредуктаз и трансфераз, все лигазы, значительная часть лиаз и некоторые изомеразы. Лишь гидролазы не нуждаются в коферментах и осуществляют каталический процесс исключительно при посредстве активных центров, образованных аминокислотными радикалами полипептидной цепи фермента. В подавляющем большинстве случаев кофер-менты регенерируются в неизменном виде по завершении каталитического акта, и это отличает их от субстратов ферментативных реакций. Однако в многостадийных химических процессах, ускоряемых ферментами, на определенном этапе кофермент может выступать как субстрат и приходит в исходное состояние лишь по завершении всей цепи реакций или после химических преобразований, ведущих к восстановлению уровня его нормального содержания в клетке. Весьма существенно, что коферментами часто служат витамины. Поэтому обе эти группы биологически активных соединений рассматривают обычно совместно. [c.147]

ЧТО эквивалентно степени гидратации 0,22, соответствует последней стадии процесса гидратации согласно данным по измерению теплоемкости, т. е. завершению формирования монослоя в результате конденсации воды над наиболее слабо взаимодействующими участками поверхности. Ферментативная активность в конце первой стадии составляет 10% значения для разбавленного раствора. Увеличение активности в ходе первой стадии обнаруживает зависимость от активности воды в степени 1,5. Следовательно, скорость реакции не лимитируется водой, которая является реагентом в гидролитических процессах, когда кинетический порядок реакции по воде равен единице. Активность увеличивается до значения, характерного для разбавленного раствора, с увеличением степени гидратации выше 0,5 г воды/г белка. [c.130]

Липман [115], изучая ферментативное ацетилирование ароматических аминов, нашел, что для завершения реакции необходим некий термостабильный фактор, который, как оказалось впоследствии, [c.154]

Время ншсубации. Время является одной из важнейших переменных, определяющих эффективность процесса связывания. Как видно из данных, представленных на рис. 4.3, зависимость степени адсорбции антител на стенках лунок микропланшета от времени нелинейна. Для получения количественных характеристик процесса адсорбции через определенные промежутки времени в систему добавляли избыток антигена, меченного ферментом, далее микропланшет промывали, добавляли в лунки раствор субстрата и по завершении ферментативной реакции измеряли оптическую плотность раствора. Чем больше время инкубации, тем больше молекул реагента связывается с носителем этот процесс продолжается до тех пор, пока не настухшт насыщение твердой фазы или истощение раствора. [c.55]

Известно, что кинетику ферментативных реакций можно изучать с помощью регистрации либо начальных участков кинетической кривой, либо достаточно протяженных ее участков (практически до полного завершения реакции) [21]. В первом случае изучение преврапгений полимеров не отличается принципиально от изучения реакций любых других (простых) субстратов, поскольку в начальный период реакции ферментативной атаке могут подвергаться различные по реакционной способности участки полимера в зависимости от их относительного содержания и относительного сродства фермента к ним. Поэтому соответствующие эффективные кинетические параметры ферментативной реакции (константы Михаэлиса, каталитические константы) являются некоторыми средними величинами и не могут быть использованы для описания и теоретического предсказания временного хода ферментативного процесса на достаточно больших глубинах превращения полимеррюго субстрата. [c.29]

Итак, мы закончили описание одного оборота цикла лимонной кислоты. Одна ацетильная группа, содержащая два атома углерода, вступает в цикл, соединяясь с оксалоацетатом. Два атома углерода освобождаются по завершении цикла в виде двуокиси углерода. В конце цикла регенерирует одна молекула оксалоацетата. От четырех промежуточных продуктов цикла в ферментативных реакциях дегидрирования отделяются четыре пары атомов водорода. Из них три пары используются для восстановления трех молекул NAD" в NADH, а одна-для восстановления FAD сукцинатдегидрогеназы в FADH2. Четыре пары электронов от этих водородных атомов передаются в цепь переноса электронов и в конечном счете восстанавливают две молекулы Oj с образованием четырех молекул HjO. Отметим, что два углеродных атома, появляющиеся в виде С02,-это не те атомы, которые вступили в цикл в виде ацетильной группы. Для того чтобы углеродные атомы, вступившие в цикл в составе ацетильной группы, выделились, наконец, в виде СО2, требуются дополнительные обороты цикла, как это видно из рис. 16-12 и 16-13. [c.490]

Доскональное обсуждение механизмов переноса энергии в живых системах не входит в задачу данной главы. Мы отсылаем читателя к подробному изложению общих принципов этого вопроса, приведенному А. Л. Ленинджером [3], и к детальному обзору Г. А. Кребса и Г. Л. Корнберга [4]. Здесь же достаточно указать, что одним из продуктов ферментативных реакций, ведущих к высвобождению энергии, является аденозинтрифосфат (АТФ). Это — высокореакционноспособное, или богатое энергией , соединение, служащее источником свободной энергии, необходимой для полного завершения тех биохимических реакций, в которых это соединение принимает участие. Если сравнивать задачу, которая стоит перед клеткой и хнашком-органиком, то окажется следующее. Химик-органик при выборе реагентов, поставляющих необходимую для определенного синтеза энергию, может основываться на своем опыте, а не на теоретических рассуждениях. У клетки же выбор ограничен теми реагентами, которые образуются при распаде пищевых продуктов. Наиболее важ- [c.12]

Окисление — процесс экзергонический и в обычных условиях протекает в сторону завершения. Фосфорилирование —эндергоническая реакция— и в таких условиях практически идти не может. В суммарной же ферментативной реакции эндергонический процесс сопряжен с экзергоническим, и энергия, выделяемая при окислении, запасается 1,3-дифос-фоглицератом в форме химической энергии. Далее происходит перенос фосфатной группы с 1,3-дифосфоглицерата на АДФ [c.420]

В результате спонтанного соединения диацетила с диаминовым предшественником образуются 6,7-диметил-8-рибитиллумазин. Для завершения построения флавинового кольца требуются еще четыре атома углерода, которые доставляются второй молекулой диацетила. Это происходит не прямо, а путем переноса диацетильного остатка от второй молекулы 6,7-диметил-8-рибнтиллумазина, как показано на рис. 14-34. Реакция на первый взгляд кажется весьма примечательной, но впечатление оказывается менее разительным, если принять во внимание, что эта бимолекулярная реакция протекает спонтанно в мягких условиях. Однако ферментативный процесс, изученный Плаутом, может идти несколько иначе, чем неферментативная реакция. Были предложены детальные механизмы этого процесса, который сопровождается регенерацией предшественника (4-рибитиламин-5-амин-2,6-диоксиметилпирими-дина), содержащего две аминогруппы. [c.175]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Для ИФА дигоксина осуществляли связывание малеимидного производного дигоксигенин-З-О-сукцината с -галактозидазой. При этом с производным гаптена связывалось около 97% фермента. После завершения реакции конъюгации снижения ферментативной активности не наблюдалось. Результаты, полученные в случае ИФА дигоксина, сходны с результатами тестирования других гаптенов. Антисыворотку разводили в 5000 раз и 0,1 мл разведенного раствора использовали для стандартного анализа. При проведении ИФА с вытеснением [c.272]

Под непрерывными методами определения ферментативной актиБности подразумеваются такие методы, которые позволяют непрерывно следить за ходом реакции, начиная от нулевого времени и до ее завершения, причем обычно производится мгновенная регистрация данных. Есть довольно большая группа ферментов, у которых образование продукта реакции или убыль субстрата можно наблюдать непосредственно вследствие того, что существует различие в спектре поглощения между продуктом и субстратом. Кроме того, суммарным результатом реакции может быть образование кислоты или основания, изменение вязкости или даже выделение тепла. Эти явления также можно регистрировать непосредственно. К важнейшим ферментам этого типа относятся дегидрогеназы, использующие NAD или NADP, многие гидролазы, расщепляющие синтетические [c.294]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология