Эдмана расщепление

ЭДМАНА РЕАКЦИЯ (Эдмана расщепление), превращение пептида под действием фенилизотиоцианата в фенилтио- [c.692]

Для определения аминокислотной последовательности рибосомальный белок L32 был расщеплен на фрагменты двумя различными методами (А, Б) и для полученных фрагментов методом Эдмана была определена первичная структура. Для метода, А получены 12 фрагментов [c.337]

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Разработаны химические методы специфического расщепления пептидных связей и по остаткам других аминокислот, однако они не нащли столь широкого применения. В настоящее время, когда по методу Эдмана можно анализировать крупные белковые фрагменты, наиболее целесообразными представляются методы расщепления по относительно редко встречающимся аминокислотным остаткам, таким как Тгр и Met. [c.273]

Совершенно ясно, что требованиями, предъявляемыми к любому методу ступенчатого отщепления концевых групп, являются высокий выход продукта отщепления на каждой стадии и отсутствие одновременного расщепления других пептидных связей. Рассмотрение наиболее удачного метода отщепления концевых групп — метода Эдмана — приводит к выводу, что оптимальные условия расщепления еще оконча- [c.238]

При успешном применении метода Эдмана удавалось отщепить последовательно 5—7 остатков при незначительном неспецифическом расщеплении. В некоторых случаях последовательное расщепление пептида осуществлялось удивительно легко. Заслужи- [c.172]

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокислоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе-секвенаторе (от англ. sequen e - последовательность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50-60 аминокислотных остатков. [c.54]

ЭДМАНА ДЕГРАДАЦИЯ, определение первичной структуры белков и пегп идов путем последоват. (ступенчатого) расщепления их пегггидных связей (начиная с К-конца молекулы) действием фенилизотиоцианата [c.404]

Получающиеся дипептиды можно разделить с помощью ионообменной хроматографии подобно тому, как это делают при аминокислотном анализе, одиако при поточном расщеплении необходимо собирать фракции для дальнейшего анализа. Другой набор дипептидов можно получить, если перед обработкой дипептидиламино-пептидазой провести удаление iV-концевого остатка по методу Эдмана (один цикл). Так, если удалить iV-концевой Ser в -кортико-тропине, то должны образоваться другие дипептиды схема (21) . [c.272]

Хотя описан ряд методов селективного расщепления определенных пептидных связей белковой цепи на такие фрагменты, которые можно анализировать по методу Эдмана, щирокое использование нащли всего несколько из них. Наиболее популярным методом является использование бромциана для расщепления пептидных связей по остаткам метионина схема (22) . Остаток метионина превращается в гомосерин и его лактон, которые становятся С-концевыми остатками всех фрагментов, за исключением С-концевого фрагмента исходного белка. Так как Met встречается относительно редко, фрагменты, получающиеся после подобного расщепления, довольно крупны, но с помощью современных вариантов анализа по Эдману можно проводить анализ их последовательности. Более того, лактон гомосерина на С-конце является подходящим участком для ковалентного связывания таких фрагментов с нерастворимым носителем при твердофазном секвентном анализе см. схему (17) . [c.273]

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с Ж-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого Ж-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, [c.41]

Существенным недостатком метода является то, что полученные прн расщеплении фрагменты, за исключением N Koнцeвoгo, не содержат свободной а-амино-группы и поэтому не могут подвергаться деградации по методу Эдмана. С помощью восстановительного десульфирования на никелевом катализаторе удается превращать иминотиазолидинкарбоновую кислоту в аланин. Однако при этом наблюдается частичное расщепление некоторых пептидных свизей. [c.52]

В к лассических работах 60-х — начала 70-х годов для расщепления белка использовались главным образом такие методы, которые позволяли получать большое число фрагментов небольшого размера. Структура их изучалась классическими методами анализа (ручной метод Эдмана. ДНС-Эдман, расщепление карбоксипепти-дазами и амииопептидазами). При этом для основного гидролиза применялся главным образом трипсин, а для получения перекрывающихся пептидов также использовались ферментативные методы гидролиза (химотрипсин, термолизин и пепсин). [c.76]

Другим химическим методом определения К-концевых групп является метод Эдмана — реакция с фенилизотиоцианатом. При этом происходит перегруппировка и расщепление с образованием фенилтиогидантоина К-концевой аминокислоты [50]. Для данного способа была разработана стандартная методика [57] и выяснен механизм реакции [51]. Фенилтиокарбамильный пептид, полз ча-ющийся при этой реакции, быстро расщепляется в кислой среде с образованием 5-тиазолинона N-кoнцeвoй аминокислоты и остатка пептида. 5-Тиазолинон затем быстро гидролизуется до фенилтио- [c.403]

Исследуя реакцию взаимодействия метилизотиоцианата с белками, авторы показали, что при большом избытке реагента (60 мкл) образуется продукт, затрудняюпщй газохроматографическое определение. При анализе бычьего инсулина после первого цикла его расщепления по методу Эдмана на хроматограмме были идентифицированы пики производных глицина и фенилаланина, после второго цикла — пики производных второй пары аминокислот изолейцина и валина. Пик производного глицина может быть экранирован пиком производного валина. [c.34]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

С. Мур и У. Стейн в результате длительной кропотливой работы по усовершенствованию методов аналитической химии аминокислот сконструировали первый так называемый автоматический анализатор аминокислот — очень совершенный прибор, выполняющий в течение считанных часов работу по определению содержания аминокислот в гидролизате белка. Усовершенствование одного из автоматических регистрирующих устройств, созданных С. Муром, У. Стейном и Д. Спекманом, позволило автоматизировать не только процесс анализа аминокислот гидролизата, но и процедуру расщепления пептидов по методу К- Эдмана. Это разрешило основные трудности анализов белков, так как для проведения этих анализов, которые раньше могли выполнять только химики-аналитики высшей квалификации, затрачивая при этом огромный труд и годы работы, теперь могли привлекаться лаборанты, специализирующиеся на обслуживании автоматических устройств, причем стандартизация определений значительно уменьшила вероятность ошибок [412]. [c.137]

Существуют различные методы выделения брадикинина из продуктов расщепления белков плазмы трипсином или змеиным ядом и его очистки, разработанные в различных лабораториях. Методика, применявшаяся Эллиоттом и сотр. [661, 666, 668, 669], заключалась в обработке фракционированной смеси белков из сыворотки быка 0,1 и. соляной кислотой при 37° (для инактивации ферментов, разрушающих брадикинин) и в последующей их инкубации с трипсином в течение 6 час. Полученную смесь осаждали спиртом, а из фракции, растворимой в 74%-ном спирте, чистый брадикинин удалось выделить с помощью противоточного распределения, хроматографии на, карбоксиметилцеллюлозе (ацетатно-аммониевый буферный раствор pH 6,5 и 5) и электрофореза. Сначала на основании неточных данных аминокислотного анализа считали, что брадикинин имеет следующий аминокислотный состав Ser Gly Pro Phe Arg= 1 1 2 2 2. Результаты кислотного гидролиза, расщепления химотрипсином и разложения по методу Эдмана позволили приписать бради-кинину следующую структуру [c.105]

Аминокислотная последователыность небольших пептидов определялась химическими методами — динитрофенильным, деградацией по Эдма у и гидразинолизом, а также расщеплением карбокоипептидазой. Триптические пептиды большой длины подвергались дальнейшему расщеплению другими протеолитическими ферментами — химотрипсином, пепсином или папаином аминокислотная последовательность полученных меньших пептидов определялась обычными химическими методами (см. кн. L стр. 83). [c.129]

После аминокислотного анализа пептидов часто проводят их концево анализ, что в случае ди- итрипептидов дает возможность сразу определить последовательность аминокислот. Для изучения аминокислотной последовательности часто пользуются методом Эдмана — ступен чатым расщепление.м пептида с его аминного конца с помощью фенилизотиоцианата (фиг. 7). Этот метод применим и для негидролизованных вирусных белков, если К-конец у них свободен. В настоящее время в продаже появились автоматические секвенаторы аминокислот, работающие на том же принципе. [c.73]

Выходы па стадиях классического ( ручного ) метода Эдмана обычно ниже, чем при использовании автоматических приборов, главным образом вследствие невозможности полного исключения кислорода из реакционной среды и менее эффектив-]плх промывок водной фазы. Поскольку реакция расщепления 1 рифтороуксусной кислотой обратима [21] (рис. 10.1), присутствие тиазолинонов, неполностью экстрагированных на преды- [c.343]

Для успешного протекания реакции Эдмана (рис. 10.1) необходимо использование чистых реагентов, исключение кислорода из реакционной среды, полное высушивание пептидов после стадий конденсации и расщепления. Реагенты яолжиы быть свеже-перегнанными [2], а реакционная смесь для конденсации — насыщена азотом. Образцы пептидов предварительно тщательно высушивают в нагреваемых в металлических блоках вакуумных эксикаторах. [c.370]

С-концевое отщепление. Предложен ряд методов последовательного химического расщепления по карбоксильному концу молекулы пептида (гл. 18). Первые попытки в этом направлении были предприняты еще до описания реакции Эдмана, но они не смогли составить конкуренцию последней. В перспективном, тщательно изученном методе [98] С-концевой карбоксил пептида реагирует с тиоцианатом аммония в уксусном ангидриде полученный при этом циклический пептидилтиоги-дантоин обрабатывается кислотой (или ацетогидроксаматом) продуктами последней реакции являются тиогидантоин С-концевого остатка и пептид, укороченный на одну С-концевую аминокислоту. В исходной методике каждый цикл отщепления включал длительные и трудоемкие стадии разделения и сушки. Удавалось отщепить только 2—6 остатков. Однако в связи с развитием ТФ-метода с этим подходом связаны новые надеж- [c.454]

Два главных препятствия до сих пор ограничивают пределы возможностей автоматического ЖФ-метода Эдмана [32]. Первой проблемой является перенос остаточных аминокислот на каждый последующий цикл. Это явление происходит как из-за неполного присоединения реагента к белку, так и из-за неполного отщепления модифицированной N-концевой аминокислоты в виде 2-анилинотиазолинона другая проблема заключается в том, что па стадии кислотной обработки карбамоилпеп-тида (белка) происходит расщепление внутренних неустойчивых пептидных связей, приводящее к появлению новых полипептидных цепей, т. е. новых последовательностей. В результате этих двух процессов накопление фона ФТГ-аминокислот достигает такого уровня, что однозначная идентификация последовательности аминокислот основной цепи становится невозможной, Для снижения уровня остаточных пиков было предложено проводить и конденсацию, и отщепление АТЗ дважды в каждом цикле [31]. Однако такое изменение стандартной методики приводит к большим потерям пептида (вымывание из реактора). Для снижения этих потерь в реактор добавляют носители-белки или органические полимеры [78, 92], но, к сожалению, белки подвержены ацидолизу, в результате чего возникают ложные последовательности. Для снижения уровня остаточных аминокислот, появляющихся в результате неполного взаимодействия ФИТЦ с полипептидами (особенно если Pro—N-концевой остаток), повышают температуру реактора до 55°С [94]. [c.456]

Пептиды, полученные при специфическом химическом или ферментативном расщеплении белка, разделяют методами хроматографии. Далее последовательность аминокислот в каждом из пептидов определяют методом Эдмана. Таким образом, достигается этап, когда последовательность аминокислот в отдельных пептидах (фрагментах белка) известна, но остается невыясненной последовательность самих пептидов. Последнюю устанавливают с помопшю так называемых перекрывающихся пептидов (рис. 231). При этом используют уже не трипсин, а какой-либо фермент, расщепляющий по шпептидную цепь в других участках, например химотрипсин, который расщепляет пептидные связи главным образом по [c.30]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология