Агароза, гель-электрофорез

Гель-электрофорез. Электрофорез на геле и крахмале применяют для аналитических целей. Наиболее важным применением гель-электрофореза является иммуноэлектрофорез. Для этого вида анализа используют макропористые гели, в частности гели агара и агарозы. Метод иммуноэлектрофореза основан на том, что после разделения электрофорезом происходит диффузия разделенных веществ — антигенов — в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Навстречу этим соединениям диффундируют антитела. При соединении антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Метод иммуноэлектрофореза очень чувствителен при обнаружении антигенов, специфических для данных антител. В настоящее время применяют метод введения радиоактивной метки в антигены, благодаря чему радиоиммуноэлектрофорез является одним из самых чувствительных методов анализа биополимеров. [c.364]

АГАРОЗА ж. Полисахарид, нейтральный компонент агара используется как носитель для гель-хроматографии и гель-электрофореза биополимеров. [c.9]

Нуклеиновые кислоты характеризуются отчетливым отрицательным зарядом и очень высокой молекулярной массой. Поэтому нейтральные гомогенные гели с достаточно большими порами обеспечивают хорошее разделение этих соединений. Размер пор, требуемый для исследования нуклеиновых кислот и их субъединиц, можно определить методом гель-электрофореза при градиенте концентрации, как для белков (см. табл. 12.6). Если механические свойства неплотного полиакриламидного геля непригодны, можно использовать смешанный гель, содержащий 2,5% полиакриламида и 0,5% агарозы. При анализе субъединиц более низкой молекулярной массы концентрацию полиакриламида увеличивают до 3% при 0,5%-ной концентрации агарозы в [c.350]

Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500000 фрагментов длиной от 10 до 10 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза в агарозе, после чего ДНК денатурируют щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочечные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 80°С. В результате получается отпечаток (реплика) картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определенных генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде темной полосы (рис. 4.60). [c.126]

Расщепите по 5 мкл каждой ДНК рестриктазой E o RI и нанесите на гель 0,7%-ной агарозы. Проведите электрофорез в течение 6 ч при 50 В. Остатки препаратов быстрых лизатов фага сохраните, чтобы получить потом на чашках большие количества фагов. [c.45]

Технические приемы, используемые в рассматриваемом методе, связаны с необходимостью формирования составного геля. Электрофорез в первом направлении должен проходить в геле без антител. Переход ко второму направлению—это переход молекул антигенов под действием поля в гель агарозы, смешанной с антисывороткой. Здесь, в частности, возникает проблема надежного контакта между двумя гелями. При этом второй гель приходится формировать после окончания фракционирования антигенов в первом геле во избежание диффузии антител в него во время электрофореза. [c.146]

Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются, современные методы электрофореза. В качестве носителей жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только он и будет подробно описан. [c.6]

Один весьма успешный способ преодоления этой трудности заключается в отделении нужного фермента от других белков с помощью гель-электрофореза [100]. Образец фермента наносят на довольно крупнопористый гель и электрофорез продолжают до тех пор, пока фермент четко не отделится от всех сопутствующих примесей. После локализации положения фермента в геле последний разрезают и слой, содержащий фермент, растирают до получения тонкой суспензии, состоящей из полиакриламидного геля и фермента. Эту суспензию и используют затем для первой инъекции нескольких сотен микрограммов белка оказывается вполне достаточно. Иммуноглобулины, полученные таким способом, содержат до 10% антител к нужному ферменту. Остальные 90% — это относительно неспецифические иммуноглобулины, присутствующие в организме животного к моменту иммунизации. К 1 см агарозы можно присоединить десятки миллиграммов иммуноглобулина, [101]. При этом на 1 смз геля будет приходиться до 1 мг специфических антител. Но, поскольку молекулы антител присоединяются к адсорбенту таким образом, что это приводит в большинстве случаев к потере их способности связывать антиген, концентрация активных антител будет составлять, вероятно, лишь около 0,1 мг/см Если каждая молекула этих антител связывает одну молекулу антигена с близким значением молекулярной массы, то емкость такой колонки будет порядка 0,1 мг/см , это небольшая, но вполне достаточная емкость для очистки малых [c.174]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

ИХ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ АГАРОЗЫ [c.175]

Приготовление геля. Взвешивают агарозу (250 мг) и добавляют к ней 25 мл электродного буфера. Суспензию нагревают на кипящей водяной бане до получения прозрачного раствора, не содержащего пузырьков воздуха. Охлаждают агарозу до 40°С и осторожно заливают в предварительно прогретую кассету прибора для электрофореза (с. 97). Оставляют при комнатной температуре на 1—2 ч для полимеризации. [c.175]

Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор. [c.96]

Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной 1—2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала, полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя нли ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на бумаге. [c.147]

Гель-электрофорез проводится в агарозном или полиакриламидном геле. Это исключительно гибкий метод разделения варьируя структуру геля и состав буферного раствора, можно проводить разделение на основе различия в молекулярных массах, изоэлектрических точках и биоспецифическом сродстве. Особенно высокого разрешения достигают при гель-электрофорезе в полиакриламиде [39], так как здесь дополняют друг друга электрофорез и молекулярноч итовой эффект. Сыворотка, например, расщепляется на 20 полос, в то время как при электрофорезе в агарозе появляется лишь 5 полос. [c.351]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Основное практическое значение имеет электрофорез в гелях гель-электрофорез). При использовании гелей практически исчезает опасность конвекции, резко уменьшается коэффициент диффузии и размывание зон незначительно. В результате на одном геле длиной около метра можно получить до сотни или даже более зон. Наиболее широко используется электрофорез в сшитых полиакриламидных и агарозных гелях. Агароза является компонентом агар-агара, содержащегося в красных морских водорослях. Она построена из чередующихся остатков В-галак-тозы и 3,6-ангидро-1/-галактозы, связанных попеременно 0 —> 4)- и а(1 3)-связями [c.242]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот с успехом применяются крахмальные, агаровые, агарозные и полиакриламидные гели, а также полиакриламидные гели, содержащие агарозу. По электрофорезу РНК [105] и ДНК [387] в крахмальном геле имеется сравнительно мало работ. Электрофорез в других поддерживающих средах дает более высокое разрешение. Ричардс и Леканиду [1086] пришли к заключению, что методом электрофореза в полиакриламидном геле можно разделить смесь полинуклеотидов, имеющих мол. массу менее 10 000 и различающихся по длине всего на один нуклеотидный остаток. Рубину [1117] удалось разделить 4S-, 5S- и 5.8S-PHK. Филлипс и Тимко [1004] описали разделение 5S-PHK на два компонента. Определяя степень разрешения, которую можно достигнуть при электрофоретическом разделении РНК, они сделали вывод, что для молекул РНК, имеющих константы седиментации между 22 и 45S, степень разрешения составляет две единицы S в случае двух параллельных проб ошибка определения будет равна 5%. При шести повторных определениях степень разрешения составляет одну единицу S даже для более мелких молекул. Эти примеры свидетельствуют о том, что методы электрофореза в гелях дают превосходное разрешение при фракционировании нуклеиновых кислот. [c.369]

Двумерный электрофорез. Проводят электрофорез в первом направлении при рП 8,9 (или ином pH) в присутствии 8 М мочевины, а затем во втором направлении в присутствии ДСН. С целью сужения зон иа границе геля электрофорез во втором направлении проводят в ступенчатой буферной системе. Гель из трубки помещают па слой формирующего геля в торец пластины и фиксируют с помощью агарозы (ко1щентрация ДСН и буфере для образца 17о (масс./об.), см. разд. 1.3Л) [115]. Электрофорез во втором направлении можно вести в непрерывной буферной системе на градие1ггиом геле, тогда сужение зон будет идти вблизи стационарного положения. В этом случае гель из трубки (диаметр 3,5 мм) уравновешивают в течение 30 мин с 100 ил электродного буфера (0,025 М фосфат, pH 7 + + 0,15% ДСН) и помещают на верхний торец готовой (фирменной) пластины градиентного геля (4—27%) (разд. 1.3.1.1), которую предварительно пропитывают ДСН с помощью электрофореза при 50 мА в течение 3 ч. Разделение проводят при 30 мА в течение 15 мин и 50 мА в течение 3,5 ч [114]. [c.45]

Расщепите по 5 мкл каждой ДНК рестриктазами oRI и Hind III и нанесите на гель 0,7%-ной агарозы. Проводите электрофорез в течение 6 ч при 50 В. Остатки тех препаратов фага, из которых быстрым методом были выделены ДНК, сохраните, чтобы вырастить фаг на чашках в большом количестве. [c.49]

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-филизированного порошка. Для приготовления геля выбр-анной концентрации навеску порошка растйоряют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термостате при 90—95 около 2 ч для образования истинного раствора полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обратным холодильником. [c.19]

ДНК-зонды, а в некоторых случаях и очень короткие фрагменты ДНК. Такие фрагменты получают расщеплением геномной плазмиды рестриктазами и выделением необходимых фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза и электроэлюирования из агарозы. [c.68]

Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование (рис. 2.7) [Stahl et al., 1988]. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом. Справедливости ради следует отметить, что авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что [c.56]

Суммарную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500 ООО фрагментов длиной от 10 до 10 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза иа пластинках в агарозе. Следующий этан - получение одноценочеч-ных фрагментов ДНК денатурацией щелочью прямо в геле. С агарозной пластинки получают реплику- отпечаток на питроцеллюлозном фильтре. Перенесенные на фильтр одноцепочечные фрагменты ДНК можно идентифицировать путем гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами. Любой фрагмент, содержащий последовательность зондируемого гена, выявляется в виде темной полосы на радиоавтографе (фильтре, покрытом фотоэмульсией и проявленном после взаимодействия с радиоактивным зондом). [c.67]

Первый этап анализа связан с идентификацией этого гена в суммарной человеческой ДНК. Для этого ДНК выделяют из клеток, с помощью эндонуклеаз получают фрагменты, раздечяют их в агарозе с помощью гель-электрофореза, денатурируют на две отдельные цепи и создают реплику с препарата на питроцеллюлозном фильтре. Следующий шаг состоит в том, чтобы найти среди всех фрагментов р-глобиновый ген. Для этого необходим радиоактивный ДНК-зонд. Его синтезируют на р-глобиновой РНК с помощью обратной транскриптазы. Далее этот к-ДНК зонд используют для двух задач. Первое — идентифицировать фрагменты [c.70]

Свойства агарозы были рассмотрены в первой книге >той серии, посвященной электрофорезу [Остерман, 19811. Однако ввпду центральной роли, которую играют агарозные матрицы в иекотор .г хроматографических методах (гель-фнльтрация, аффинная хроматография), имеет смысл привести здесь некоторые данные еще раз. Как и [c.53]

Рассмотрим теперь совсем недавний пример разделения ДНК и РНК. Здесь решалась более тонкая задача разделения НК, соизмеримых по своим размерам, а именно очистки ДНК плазмиды pBR 322 от примеси РНК. Присутствие РНК в препаратах плазмидной ДНК мешает протеканию некоторых ферментативных реакций и затемняет результаты введения концевой радиоактивной метки. Оказалось, что даже интенсивная обработка РНКазой (50 мкг/мл, 37°, 1 ч) не расщепляет РНК полностью, а лишь дробит ее на фрагменты, не обнаруживаемые электрофорезом в 1%-ном геле агарозы (они уходят вперед), но переосаждающиеся этанолом вместе с плаз-мидной ДНК. Кроме того, обработка РНКазой вообще нежелательна. Несмотря на предварительный прогрев, в ней остается небольшая [c.143]

При полном расщеплении ДНК фага X рестриктазой Hind П1 образуются фрагменты, содержащие 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 и 165 пар оснований они могут быть разделены с помощью электрофореза в геле агарозы. [c.175]

А. используют при приготовлении плотных бактериальных сред, применяемых для культивирования и диагностики бактерий, а также как желнрующее в-во в пищевой (особенно в кондитерской) пром-сти. Агароза-носитель в гель-хроматографии, аффинной хроматографии, гелевом электрофорезе, иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезе. [c.28]

Б. В Иммуноэлектродиффузия или ракетный иммуноэлектрофорез [66], Гель агарозы содержит равномерно распределенную иммунную сыворотку. В лунки внесены антигенные растворы разных концентрации. Электрофоре. проводится при pH, при котооом антитела не мигрируют либо мигрируют очень мало. Антигены под действием электрического поля мигрируют в геле, содержащем антитела. Комплексы при избытке антигенов вначале растворимы, продолжают мигрировать в ходе электрофореза, а также посредством диффузии, обогащаются антителами, н, когда соотношение антигенов и антител достигает точки эквивалентности, они осаждаются в форме ииков. [c.102]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели. Агароза — это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделять молекулы ДНК размером от 600 до 20 ООО п. н. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. [c.54]

Если электроэндоосмос в агаровом геле при электрофорезе является серьезной помехой иммуноэлектрофоретического анализа, рекомендуется заменить агаровый гель гелем агарозы. [c.148]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология