Определение молекулярной массы белков

Ультрацентрифугирование растворов полимеров. Ультрацентрифуги, в которых развиваются центробежные ускорения, превышающие ускорение силы тяжести в десятки тысяч раз, широко применяются для изучения свойств макромолекул в растворах. Впервые этот метод был использован Т. Сведбергом для определения молекулярных масс белков. [c.153]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА [c.344]

Рис. 12.30. Графическое определение молекулярной массы белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в среде додецилсульфата (по данным Вебера с сотр. [105]).

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9. [c.45]

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения [c.44]

Для определения молекулярной массы белка практически невозможно использовать метод [c.531]

Такая методика исследования применялась для определения молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот и для изучения их строения в адсорбционном слое. Этот метод позволяет получить ценные сведения о конформации молекул в поверхностном слое, поскольку эта последняя определяет величину площади, занимаемую ими в двухмерной пленке. Чтобы не вводить поправку на взаимное притяжение молекул в адсорбционном слое, эти измерения проводят в той области значений pH, в которой молекулы заряжены вследствие ионизации. Конформация белка зависит от pH среды, которое определяет диссоциацию ионогенных групп и их гидратацию. При изменении pH изменяется и наклон прямых т. е. величина (рис. П-19). [c.80]

П. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ [c.116]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

Молекулярную массу затем рассчитывают, подставляя целую часть вычисленного значения zi в уравнение 9.4-26. Существуют более точные компьютерные алгоритмы, которые преобразовывают полученный масс-спектр в спектр, состоящий из одного пика, соответствующего молекулярной массе белка. Определение молекулярной массы белка важно само по себе, например вследствие того, что молекулярная масса может легко указать на природу рекомбинантного продукта. [c.308]

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка. [c.46]

Капиллярный гель-электрофорез Олигонуклеотиды, ДНК, полисахариды, определение молекулярных масс белков [c.364]

Определение молекулярной массы белков [c.44]

Определение молекулярной массы белков возможно только в случае их хорошей растворимости. Одним из приемлемых методов является определение молекулярной массы по осмотическому давлению белковых растворов. Другой метод определения молекулярной массы основан на определении специфических фупп, связанных известным соотношением с молем белка. Например, по содержанию железа в гемоглобине можно определить молекулярную массу последнего. Известно, что гемоглобин содержит 0,335% Fe, что соответствует молекулярной массе 16,5 kDa на атом железа. Так как известно, что 1 моль гемоглобина содержит 4 атома железа, его молекулярная масса составляет 66,8 kDa. Метод, разработанный Т. Сведбергом и основанный на ультрацентрифугировании белковых растворов, является наиболее точным для определения молекулярной массы большинства водорастворимых белков. [c.44]

При определении молекулярной массы неизвестного соединения (по методу, пригодному для определения молекулярной массы белков) лучще всего тщательно измерить расстояние от центра пятна этого соединения до стартовой линии и от центра пятна известного соединения, используемого как стандарт, до стартовой линии. Результат измерений выражают величиной Rm, определяемой как соотнощение длины пути исследуемого соединения (d ) и стандарта (ds), т. е. RM = di ds. Далее молекулярную массу определяют по кривой зависимости величин Rm, рассчитанных по этой формуле, от молекулярной массы. [c.132]

Исходя из общих принципов термодинамики необратимых процессов, можно вывести уравнения, по форме очень близкие к полученным выше. В эти уравнения входят такие величины, как 5, О, коэффициенты активности и т. п. Чтобы приложить эти уравнения, скажем, к определению молекулярной массы белка в солевом растворе, необходимо сделать некоторые допущения. Достоинство термодинамического вывода состоит в том, что он позволил выяснить целесообразность этих допущений. К примеру, оказывается, что считавшееся нами раньше необходимым допущение о равенстве к оэффициентов трения в случае седиментации и диффузии (при выводе уравнения Сведберга) является в действительности излишним. [c.90]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БЕЛКОВ И ВЫДЕЛЕНИЕ ФРАКЦИИ ИЗ РАСТВОРОВ [c.362]

Для определения молекулярных масс белков (и других высокомолекулярных соединений) существует ряд методов. Особенно большое значение среди них имеет метод ультрацентрифугирования. [c.304]

Опишите принцип определения молекулярной массы белков методом гель-фильтрации. [c.53]

Для определения молекулярной массы белков применяются различные химические и физико-химические методы. [c.78]

Физико-химические методы определения молекулярных масс белков основаны на молекулярно-кинетической теории и могут быть разделены на две группы [c.79]

Для определения молекулярных масс белков используется только одно коллигативное свойство их растворов — осмотическое давление. При определении осмотического давления можно путем подбора подходящих условий избежать эффекта влияния примесей небольших молекул и ионов, ассоциированных с белком, и получить достоверные результаты в тех случаях, когда изменение температуры замерзания раствора нельзя зафиксировать с помощью даже самых чувствительных приборов (из-за низкой концентрации растворов), а определение температуры кипения невозможно из-за деструкции биологических молекул. [c.79]

Остановимся на определении молекулярных масс белков по данным седиментационного анализа. Если раствор макромолекул находится под действием очень сильного центробежного поля — при ультрацентрифугировании ускорение достигает (100 ООО... 500 000)g, то вследствие большой массы происходит седиментация молекул, т. е. их концентрация увеличивается от центра центрифуги к периферии. Одновременно с седиментацией происходит противоположный по тенденции процесс — диффузия макромолекул из области с большей концентрацией (на периферии) в центральную область с меньшей концентрацией. [c.81]

Какие методы применяются для определения молекулярной массы белков [c.92]

С другой стороны, в результате денатурации белки часто приобретают свойства, значительно улучшающие их электрофоретическое разделение. Этот факт используется в тех методах электрофореза, в которых проводят предварительное восстановление белков и комплексирование их с ДСН. Электрофоретическая миграция таких комплексов зависит от эффекта молекулярного сита, свойственного полиакриламидному гелю, и размеров молекул, что создает основу для весьма простого и эффективного метода определения молекулярной массы белков (подробное описание метода см. в гл. И.2). [c.215]

Применили полиакриламидный гель в концентрациях 5, 10 и 15% для определения молекулярных масс белков, равных соответственно 20 000—350 ООО, 10 000—100 ООО и 10 000—60 ООО (рис. 77). В указанных пределах калибровочные кривые представляют собой прямые линии, за исключением кривой для белков с мол. массой ниже 20 000, которые мигрируют медленнее чем можно было бы ожидать, исходя только из их молекулярной массы (рис. 77, Л). Интересно отметить, что точки, соответствующие подвижности инсулина (мол. масса 57 00), при всех концентрациях геля лежат ниже соответствующих калибровочных кривых. [c.220]

Наиболее часто тонкослойную хроматографию используют для определения молекулярной массы белков и белковых соединений. Показано [193, 194], что при помощи тонкослойной гель-фильтрации можно проводить приблизительную оценку молекулярной массы белков, используя сефадексы 0-75 и 0-200. Объем элюирующего буферного раствора находится в линейной зависимости от логарифма молекулярной массы белка [195]. [c.117]

Точность определения молекулярной массы белков выше 10000 описанным методом составляет около 5%, причем полученные величины довольно хорошо согласуются с результатами, которые дают другие методы [291]. Данный метод имеет особенно большое преимущество в тех случаях, когда по каким-либо причинам нельзя применять иные способы определения молекулярной массы, например при образовании белковых агрегатов [263]. [c.222]

Гель-хроматография применяется, как уже указывалось, при обессиливании растворов (малые по размеру ионы солей проникаю в поры ге я и удерживаются там), для группового разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных органических соединений (например, глицериде в жирных кислот с молекулярной массой около 200—500), в анализе биологических объектов (часто с использованием буферных систем с целью предотвратить разрушение ферментоп), для определения молекулярной массы белков (в том числе содержащихся в сыворотке К]ювп, в спинн( -мозговой жидкости), углеводородов и др)гих вещеста. [c.285]

Такая методика исследования применялась для определения молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот и для изучения их строения в адсорбционном слое этот метод позволяет получить ценные сведения о конформации молекул в поверхностном слое, поскольку эта последняя олределяет величину площади, занимаемую ими в двухмерной пленке. Чтобы преодолеть вазимное шритяжение молекул в адсорбционном слое, эти измерения проводят в той области значений pH, в которой молекулы заряжены вследствие ионизации. Электростатическое отталкивание несколько увеличивает эффективный размер молекул, но это влияние, как правило, невелико, и им пренебрегают. Более существенно заряд молекулы влияет на конформацию молекулы белка и площадь, занимаемую ею на поверхности. Соответственно конформация белка зависит от pH среды, так как величина pH определяет диссоциацию ионогенных групп и их гидратацию. При изменении pH изменяется и наклон прямых л5м(л) (см. рис. II—19), т. е. величина 51. [c.66]

К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков наряду с седиментационными относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала. Получаемые результаты хорошо воспроизводятся и, как правило, коррелируют с данными, полученными другими методами. [c.116]

Предел эксклюзии геля определяют по графику зависимости элюируемого объема от молекулярной массы, он соответствует элюируемому объему, который на 10% отличается от свободного объема Уд1,т. е. объема растворителя вне зерен геля (Vм определяют по выходу высокомолекулярного вещества, заведомо не проникающего в гель). Предел эксклюзии в некоторой мере зависит и от формы молекул для линейных полисахаридных молекул предел эксклюзии ниже, чем для глобулярных белков. Точность определения молекулярной массы белков методом ГПХ возрастает, если добавлением карбамида, гуанидина или SDS (додецилсульфата натрия) глобулярные молекулы белков перевести в вытянутую 4юрму. [c.56]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ЛИНЕИНОМ ГРАДИЕНТЕ КОНЦЕНТРАЦИИ Г901 [c.347]

Электрофорез в градиенте концентрации полиакриламидного геля применяется не только для фракционирования белков, РНК [199] и нуклеопротеидных частиц [295, 876], но также и для определения молекулярной массы белков [39, 706, 1290] и РНК [876]. [c.105]

Построение калибровочных кривых. Калибровочную кривую, необходимую для определения молекулярной массы белков, можно получить путем электрофореза нескольких чистых белков с известной молекулярной массой. Однако далеко не в каждой лаборатории имеется набор таких белков. В этом случае калибровочную кривую можно построить с помощью одного единственного белка, если получить его полимеры, используя Сшивающие агенты, подобные диэтилпирокарбонату [760, 1440, 1441] или диметилсуберимидату [195, 781]. Образованные таким способом полимеры, содержащие 5—10 мономеров, позво- ляют проводить определение молекулярных масс в широком диапазоне (рис. 79). Наличие полимеров высокомолекулярного белка дает возможность построить калибровочную кривую для белков с мол. массой до 600 ООО (рис. 80). [c.222]

Рис, 79. Калибровочные кривые для определения молекулярных масс белков методом электрофореза в Ю7о-ном (/) и 12,5%-ном (//) полиакриламидном геле, содержащем ДСН [414]. Полимер РНКазы был получен при помощи диэтилпирокарбоната по методу Вольфа и др. [1441]. [c.223]

Как уже отмечалось, определение молекулярной массы белков, обладающих чрезвычайно большим зарядом или находящихся в необычной конформации, также дает ошибочные результаты. Однако подобные ошибки можно исправить с помощью калибровочных кривых для белков с известной молекулярной массой, имеющих такие же конформационные характеристики или заряды, как и изучаемые белки [413, 964]. Для определения молекулярной массы сильно кислых белков (например, ферредоксинов) вместо ДСН используют катионные детергенты (бромистый [1425] или хлористый цетилпиридиний [ИЗО]). [c.223]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология