Равновесная седиментация в градиенте плотности

Метод равновесной седиментации в градиенте плотности основан на следующем. Если поместить в ячейку центрифуги смесь низкомолекулярных жидкостей (растворителей) различной плотности, то при сильном центробежном ускорении (более 10 м/с ) через некоторое время в кювете установится седиментационное равновесие, т.е. в радиальном направлении возникнет постоянный во времени градиент плотности. Если в таком бинарном растворителе содержится полимерный компонент с плотностью, промежуточной между плотностями элементов растворителя, то полимер начнет собираться в полосы в тех местах кюветы, где его плотность равна плотности бинарного растворителя. Чем ниже молекулярная масса, тем больше коэффициент диффузии и тем сильнее размывается эта полоса (изоденса). Для сополимеров (если сомономеры имеют разные плотности) в результате установления равновесия могут появиться несколько полос макромолекулы с различной плотностью соберутся в разные полосы. Следует отметить, что метод применим для молекулярных масс выше критической, иначе ширина полосы становится соизмеримой с длиной ячейки. [c.325]

Равновесная седиментация в градиенте плотности [c.489]

Для оценки композиционной неоднородности существуют следующие методы гель-проникающая хроматография (ГПХ) с одновременным определением дифференциального показателя преломления и ультрафиолетового и/или инфракрасного спектров тонкослойная хроматография (ТСХ) седиментация до достижения равновесного градиента плотности. [c.25]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Рис. 1.9. Принципиальная схема равновесной седиментации в градиенте плотности (плотности компонентов трех компонентной системы Р1<Рп<Р2)-а — положение компонентов при установившемся равновесии б — распределение плот" ности виг — интегральная С (х) и дифференциальная йС йх = / (х) кривые распределения концентрации полимера.

Метод центрифугирования в градиенте плотности имеет две разновидности метод, основанный на измерении скорости седиментации в градиенте сахарозы, и метод равновесного центрифугирования, в котором используется градиент хлористого цезия. В первом варианте используется заранее приготовленный градиент, а во втором — градиент создается под действием поля центробежных сил непосредственно в ходе эксперимента. [c.417]

Формулы (6.112), (6.113) и (6.114) позволяют определить из опытов по равновесной седиментации в градиенте плотности молекулярный вес и полидисперсность состава, а формулы (6.116) и (6.118)—избирательную сольватацию. [c.492]

Отметим, наконец, что равновесная седиментация в градиенте плотности, как и обычное седиментационное равновесие, может использоваться для определений молекулярного веса [ср. формулы (6.112) и (6.117)]. Однако при этом следует считаться с тем, что локальная концентрация полимера в области изоденсы высока и пренебрежение термодинамической поправкой (пропорциональной второму вириальному коэффициенту Лг) приводит к сильным искажениям при расчетах. Так, в работе [84] для системы хлороформ — бензол было получено сильно завышенное, а для системы ДМФ — хлороформ — заниженное значение Л1 . Авторы объясняют это наличием агрегативных тенденций (Лг < 0) в первой системе и большими положитель- [c.493]

Рассмотрим теперь вопрос о равновесной седиментации в установившемся градиенте плотности. [c.366]

Теория седиментации применительно к клеткам подробно рассмотрена в недавно опубликованном обзоре [4]. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности требует достаточно высокой скорости вращения и/нли достаточно продолжительного времени, чтобы клетки смогли перераспределиться вдоль градиента в соответствии с их плавучей плотностью. Этот метод имеет известные ограничения, поскольку разделение клеток производится в соответствии с их плотностью, а плавучие плотности многих типов клеток частично перекрываются [5]. Другими недостатками этого метода являются необходимость приложения больших центробежных сил и возможная токсичность материалов, используемых для создания [c.166]

Здесь р, и г,—соответственно плавучая плотность и равновесная координата на градиенте частиц с интересующей нас константой седиментации го,— частота вращения ротора, тыс. об/мин / — время миграции, г. [c.246]

Центрифугирование в градиенте плотности основано на том же принципе. Как и в вышеуказанном случае, градиент плотности создается градиентом концентрации. В колонке градиент концентрации достигается тем, что слои с различной концентрацией помещают друг над другом, после чего начинается медленная диффузия, постепенно выравнивающая градиент. Роль сил тяготения сводится главным образом к стабилизации системы путем снижения до минимума конвекционных токов. Наоборот, при центрифугировании в градиенте плотности градиент концентрации является результатом сил, действующих в центрифуге, и достигает равновесного значения. Установленный таким образом градиент плотности достаточно стабилен. Этот эффект был использован Пикельсом [2] для снижения конвекции в опытах по центрифугированию. Такой же принцип применяли Калер и Ллойд [31 в своих опытах с так называемой стабилизированной движущейся границей в препаративной ультрацентрифуге. Другим применением градиента плотности является зонное центрифугирование —методика, разработанная Брекке [4], которая позволяет разделять компоненты смеси полимеров на дискретные зоны. Предварительно создают градиент плотности, так что ни в одной точке плотность не превышает плотности любого из компонентов исследуемого образца, раствор которого помещают сверху, а затем подвергают центрифугированию. Различные компоненты мигрируют в разные зоны, которые все более и более разделяются по мере центрифугирования. Еще до того, как движущаяся с наибольшей скоростьЕо зона достигнет дна кюветы, центрифугу останавливают и анализируют различные зоны. Очевидно, что метод основан на различиях в скоростях седиментации. Градиенту плотности принадлежит второстепенная ролы стабилизация системы и влияние плотности жидкости на скорость седиментации. [c.418]

В центробежном поле можно создать стабильный градиент плотности растворителя. Как известно из теории седиментации, вследствие диффузионного размы вания границы седиментахщи в конечном итоге в центрифужной ячейке устанавливается равновесное распределение концентрации каждого компонента, описываемое уравнением [c.244]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - / о/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в 5.1. [c.244]

Метод седиментационного равновесия в качестве абсолютного метода онределения молекулярных весов полимеров обладает рядом достоинств. Силовое поле ультрацентрифуги обусловливает осаждение крупных частиц типа пыли, но в то же время практически весьма слабо влияет на низкомолекулярные включения в образце. На довольно малом количестве полимера можно измерить молекулярные веса, изменяюш иеся от нескольких сотен до нескольких миллионов, а также получить обш ую картину степени полидисперсности. Недостатки метода, обусловленные большим временем эксперимента и трудностями при исследовании достаточно низких концентраций образцов, применяемых для надежной экстраполяции к бесконечному разбавлению, могут оказаться не столь суш ественнымй, если применять идеальные растворители и использовать появившиеся возможности быстрого достижения равновесных условий седиментации. В то время как метод скоростной седиментации обладает большей чувствительностью к тонким характеристикам распределений по молекулярным весам, метод седиментационного равновесия применяют главным образом для определения средних молекулярных весов, хотя использование этого метода в случае смешанных растворителей (седиментация в градиенте плотности), как недавно было показано, перспективно для определения наличия в образце других типов неоднородности. [c.238]

Особым случаем равновесного центрифугирования является седиментация при градиенте плотности [14, 76, 135], для которой применяют двухкомпонентные системы растворителей. Градиент плотности возникает вследствие седиментационного разделения составных частей растворителя вещества с различной плотностью распределяются в различных точках, где их эффективная плотность равна плотности окружающей среды. Вследствие диффузии в этих полосах накопления зависимость с от г в идеальном случае подчиняется закону Гаусса. Чаще всего этот метод применяли для исследования нуклеиновых кислот, но можно получить распределение в градиенте плотности и для полимеров умеренного молекулярного веса, если в качестве растворителей брать смеси 1,2-дибром-1,2-дифторэтана с циклогексаном и использовать оптическую шлирен-систему [221. Другая система описана Бреслером и сотр. [30]. Сведения о распределении сополимеров по составу можно получить также путем измерения рассеяния света[33]. [c.61]

Для определения состава и строения Б. используют также УФ- и ИК-спектроскопию, рентгенографию, дифференциальный термич. анализ, а также пикнометрич. и рефрактометрич методы исследования, основанные на правиле аддитивности уд. объемов и уд. рефракций компонентов Б. Достаточно успешно используется и метод ЯМР, к-рый значительно облегчает точное установление состава и строения Б. Для определения мол. массы и композиционной неоднородности Б. типа (А) — (В), в нек-рых случаях (прп подборе растворителей с учетом показателей преломления компонентов Б.) м. б. использован метод светорассеяния. Точный, но довольно сложный метод количественного анализа Б.— равновесная седиментация в градиенте плотности с использованием ультрацентрифуги. Данные о составе и строении Б. могут быть получены и при изучении нек-рых их физико-механич. свойств (напр., термомеханических). [c.136]

Равновесная седиментация ДНК в градиенте плотности s l была впервые исследована Меселсоном, Сталем и Виноградом. При такой методике [c.138]

Рис. 21. Принципиальная схема равновесной седиментации в градиенте плотности трехкомнонентной системы (плотности компонентов р <р<р").

Центрифугирование в градиенте плотности, предложенное Ме-сельсоном [60], — ценный метод исследования природных и синтетических полимеров, основанный на различии в плотностях или скоростях седиментации его используют для разделения компонентов смеси полимеров на дискретные зоны (зонное центрифугирование). Например, сошлемся на развитие методики изучения равновесного центрифугирования в капиллярах [61 ]. [c.30]

Незначительного различия в иарциальнолг удельном объеме атактического и стереорегулярного полимера (г З-Ю лгл/г для полистирола) достаточно для разделения полос при равновесной седиментации в градиенте плотности [499]. В соответствующих случаях применение этого метода для исследования стереорегу- лярных полимеров может оказаться весьма эффективным (см. [76], глава ХП1). [c.250]

При скоростях ротора, много меньших, чем те, при которых проводят опыты по скоростной седиментации, в результате центрифугирования устанавливается равновесное распределение макромолекул. Форма этого распределения самым тесным образом связана с молекулярной массой и не зависит от фрикционных свойств молекулы. При наличии смеси компонентов с помощью равновесного центрифугирования получают средневесовое значение молекулярной массы. В ряде случаев можно проанализировать равновесное распределение взаимодействующих макромолекул и определить константу связывания. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является чрезвычайно эффектив- [c.265]

Пусть первоначально пробирка заполнена раствором s l одинаковой концентрации по всему объему. Выделим мысленно три молекулы 1, 2 и 3, находящиеся на разных уровнях внутри пробирки. Каждая из них будет испытывать действие центробежной силы, направленной перпендикулярно оси вращения ротора. Пока они находятся вдали от наружной стенки пробирки, их поведение будет точно таким же, как поведение молекул в пробирке бакет-ротора. На каждом из уровней начнет формироваться градиент плотности раствора. В сечениях 1 и 3, удаленных от стенки пробирки, со временем установится равновесие седиментации и диффузии молекул, как было описано для бакет-ротора. Очевидно, что равновесная плотность в сечении 1 будет ниже, чем в сечении 3, поскольку сечение 1 находится ближе к оси вращения ротора. [c.253]

Огромным достоинством равновесного центрифугирования в градиенте плотности является возможность разделения веществ в соответствии с их плотностью. Например, ДНК, содержащую изотоп можно отделить от N-ДНК. При седиментации до достижения равновесия в плотном растворе s l различие в плотности на 0,014 г/см приводит к разделению зон и N-ДНК на 0,5 мм в стандартной ячейке центрифуги при 40 000 об/мин. Другие изотопы позволяют достичь еще большего разрешения, что показано в табл. 11-1. [c.332]

Плотность большинства белков в s l составляет 1,3, хотя от этого значения могут быть отклонения в пределах 0,050 г/см Можно ли разделить два белка с молекулярными массами 10 000 и плотностями 1,300 и 1,340 равновесным центрифугированием в s l (Скорость центрифугирования для седиментации в s l находится в пределах от 20 000 до 50 000 об/мин. Хотя градиент плотности зависит от скорости, для приближенного расчета его можно считать равным 0,020 г-см- -мм . ) [c.348]

Еще один метод разделения органелл основан на равновесном (изопикническом) центрифугировании в градиенте плотности. Полученный из листьев экстракт наслаивают иа градиент концентрации сахарозы и затем центрифугируют до тех пор, пока органеллы не достигнут равновесного положения в градиенте в соответствии с нх плавучей плотностью. Разделение оргаиелл в данном случае основано ие на различии в скорости нх седиментации, а на различии в их плотности. Пероксисомы имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные хлоро-лласты, а интактные хлоропласты имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные митохондрии. Обычно полученные из листьев экстракты наслаивают на градиент концентрации сахарозы (примерно 20—60% по весу), который затем центрифугируют в роторе с подвесными стаканами в течение 3—4 ч при 100 000 g. Равновесное положение пероксисом достигается при Ллотности 1,25, интактных хлоропластов — при плотности 1,20—1,22, а митохондрий — при плотности 1,18—1,20. Бо- лее высокая плавучая плотность пероксисом может быть юбусловлена тем, что они частично проницаемы для сахарозы. После центрифугирования градиент делят иа фракции (объемом около 1 мл весь объем стакана обычно составляет [c.416]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология