Отщепление пептида от полимера-носителя

Метод противоточного распределения (ПТР) применялся для очистки многих пептидов, синтезированных твердофазным методом. Хотя для очень хорошего разделения смеси требуется много переносов, большинство пептидов, полученных твердофазным методом, особенно пептидов с молекулами средней длины, довольно чистые после отщепления от полимера-носителя, и для их очистки достаточно небольшого количества переносов, обычно от 100 до 300 переносов. Преимущество противоточного распределения состоит в том, что с помощью этого метода можно обрабатывать довольно большие количества вещества с гораздо большей легкостью, чем в случае использования колоночной хроматографии. Кроме того, очистка методом ПТР обычно занимает меньше времени (о деталях метода см. [20, 21, 34]). [c.114]

Рис. 6. Отщепление пептидов от полимера-носителя.

Отщепление пептида от полимера-носителя [c.93]

Отщепление раствором НВг в СРзСООН. Прибор для отщепления пептида от полимера-носителя действием раствора НВг в СРзСООН показан на рис. 19. Пептидил-полимер суспендируют в трифторуксусной кислоте (10 мл СРзСООН на 1 г полимера) в сосуде для отщепления. Если пептид содержит цистеин, метионин или тирозин, а кроме того бензильные или КБЗ-группы, то в трифторуксусной кислоте дополнительно растворяют анизол или метилэтилсульфид (50 молей на 1 моль чувствительной аминокислоты, см. стр. 32, 57). Установлено, что удовлетворительную защиту обеспечивает и метионин (15 молей на 1 моль чувствительных аминокислотных остатков) [80]. Через [c.93]

Рис. 19. Отщепление пептида ОТ полимера-носителя раствором бромистого водорода в трифторуксусной кислоте.

В реакционный сосуд загружают сухой пептидил-полимер и помещают другой магнитный перемешивающий стержень. Если в пептиде, подлежащем отщеплению от полимерного носителя, имеются чувствительные аминокислоты наряду с защитными бен-зильными, карбобензокси- или нитрогруппами, то в реакционный сосуд добавляют также анизол (не менее 50 экв анизола на 1 экв пептида). [c.99]

Для некоторых пептидов можно получить более высокие выходы. Для этого суспендируют соответствующие пептидил-полимеры в очищенном диоксане, охлаждают суспензию и затем прибавляют к ней равный объем холодного метанола, насыщенного аммиаком колбу закрывают и перемешивают смесь, как указано выше [128]. Используют также смеси насыщенного аммиаком метанола и диметилформамида [44], Если отщепление пептида от полимера-носителя посредством аммонолиза проходит неудовлетворительно, то вначале можно отделить пептид от полимера переэтерификацией в виде метилового эфира, а затем последний превратить в амид в растворе. [c.103]

Отщепление гидразином [93]. Пептидил-полимер суспендируют в очищенном диметилформамиде Ъмл ДМФА на 1 г полимера) и добавляют к суспензии безводный гидразин (30 экв на 1 экв пептида). Смесь перемешивают в течение 2 дней при комнатной температуре. Полимер-носитель отфильтровывают и промывают диметилформамидом. Объединенные фильтрат и промывные жидкости упаривают в вакууме, а гидразид пептида очищают подходящим методом. [c.103]

Сосуды для отщепления пептида от полимера-носителя [c.150]

Рис. 25. Сосуды для отщепления пептидов от полимера-носителя.

Метилэтилсульфид (для защиты некоторых аминокислот на стадии отщепления пептида от полимера-носителя). [c.162]

Поскольку бромистый водород довольно плохо растворим в трифторуксусной кислоте, процесс отщепления проводят обычно, пропуская слабый ток безводного бромистого водорода в суспензию пептидил-полимера в трифторуксусной кислоте в течение 60— 90 мин. Отделение пептидов этим методом осуществляется превосходно. Так, при синтезе аналогов брадикинина выход очищенных пептидов составил 85% в расчете на первую аминокислоту, присоединенную к полимеру [128]. Выходы других пептидов колебались в пределах от 85 до 50%. Естественно, что выход снижается, если на какой-либо стадии реакция протекает неполно. Нельзя определять выход пептида после отщепления его от полимерного носителя по сухому весу неочищенного продукта, так как упомянутый реагент отщепляет от полимера также значительное количество непептидного материала, обычно нерастворимого в воде. Этим веществом непептидной природы, как правило, пренебрегают, поскольку его легко удалить любыми методами очистки. Хотя природа его подробно не исследована, можно предполагать, что это вещество представляет продукт разложения самого полимера. Было показано, что отщепление не вызывает перехода а-связи остатка аспарагиновой кислоты в ангиотензине в р-связь [65], хотя при получении одного пептида, содержащего связь остатка аспарагиновой кислоты с остатком серина, был получен в результате промежуточной циклизации р-аспарагиновый пептид [75]. Некоторые исследователи сомневаются в правильности и необходимости длительного отщепления. Почти все пептиды, которые можно отщепить от полимера, отделялись, в конечном счете, в первые несколько минут [30, 65] (см. стр. 88), а при отщеплении ангиотензина [65] в течение более 5 мин получали вещество, которое не расщеплялось лейцинаминопептидазой, хотя электрофоретически оно отличалось от р-аспарагинового пептида. Для отщеп- [c.34]

Использование защитной карбобензоксигруппы создает дополнительные трудности при синтезе пептидов, содержащих серин или треонин. Если в классическом пептидном синтезе серин и треонин часто можно использовать без защиты боковых гидроксильных групп, то при твердофазном синтезе эти группы обычно приходится маскировать. Если этого не делать, то большой избыток активированной аминокислоты, применяемый для обеспечения полноты присоединения каждого вводимого остатка, может иногда вызвать ацилирование гидроксильных групп указанных аминокислот. Поскольку образовавшаяся подобным путем сложноэфирная связь устойчива в условиях синтеза, то в пептидной цепи могут возникнуть разветвления, которые на последующих стадиях синтеза будут удлиняться. Бензиловые эфиры, обычно используемые для защиты гидроксильных групп серина и треонина, в отличие от грет-бутилоксикарбонильных аминозащитных групп устойчивы по отношению к безводному хлористому водороду, применяемому для удаления грег-бутилоксикарбонильной группы. Если, однако, использовать карбобензоксигруппу, то бромистый водород в уксусной кислоте, применяемый для удаления карбобензоксигруппы, будет также расщеплять и простые бензиловые эфиры, и в итоге образуются Р-ацетильные производные. Если для отщепления пептида от полимера в дальнейшем используют омыление, то ацетильные группы также отщепляются, но их присутствие следует иметь в виду, когда на последующих стадиях желательны другие методы отщепления пептида от полимерного носителя. Ацети-лирования остатков серина и треонина можно также избежать, применяя для удаления карбобензокси-групп на каждой стадии бромистый водород в трифторуксусной кислоте до сих пор подобный метод в твердофазном синтезе еще не использовали. Однако этот метод может оказаться практически нецелесообразным вследствие ограниченной растворимости бромистого водорода в трифторуксусной кислоте, т. е. потребуется пропускать газообразный бромистый водород через суспензию полимера на каждой стадии синтеза, [c.42]

В конце синтеза пептидил-полимер помещают на тарированную воронку с пористым фильтром, промывают уксусной кислотой, спиртом и сушат в вакуум-эксикаторе над едким кали. Так как часть аминокислот может быть связана с пептидил-полимером ионогенно или за счет адсорбции после стадии пептидообразования, то анализы пептидил-полимеров или неочищенных отщепленных пептидов на содержание аминокислот лучше проводить после дополнительной стадии удаления БОК-защитной группы. НС1 в диоксане (или НС1 в СНзСООН) удаляет сорбированную БОК-аминокислоту. Промывку пептидил-полимера следует проводить очень тщательно, чтобы удалить из вещества весь НС1 перед длительным хранением. Вес пептидил-полимера записывают. Увеличение веса полимерного носителя в процессе синтеза может служить приблизительным методом контроля количеств присоединенных аминокислот и дает верхний предел количества пептида, полученного на полимере. Аликвотную часть пептидил-полимера можно проанализировать на аминокислотный состав (см. стр. 122). После этого пептид отделяют от полимерного носителя одним из методов, рассмотренных на стр. 93—104. [c.88]

Полимер-носитель трижды промывают трифторуксусной кислотой (каждый раз берут по 10 мл СРзСООН на 1 г полимера), следя за тем, чтобы трифторуксусная кислота при каждой промывке пропитывала и экстрагировала полимер в течение 1 мин, затем раствор пептида упаривают досуха при пониженном давлении без нагревания. Пептид несколько раз растворяют в подходящем растворителе, например в смеси уксусная кислота — вода (3 1) или метанол— вода (1 1), и упаривают растворитель при пониженном давлении для удаления избытка бромистого водорода (пептид на этой стадии всегда обнаруживает кислую реакцию). Если в раствор для отщепления пептида был добавлен анизол, неочищенный продукт тщательно экстрагируют эфиром (для удаления анизола, метионина и метилэтилсульфида можно использовать также хроматографию на сефадексе), а затем сушат пептид в высоком вакууме. Неочищенный пептид после отщепления раствором бромистого водорода в трифторуксусной кислоте всегда содержит много нримесей непептидного характера, поэтому вес вещества на этой стадии не является действительным показателем выхода. Выход неочищенного пептида можно определить лишь после аминокислотного анализа гидролизата. [c.95]

Отщепление аммиаком [14, 128]. Безводный метанол насыщают при 0° сухим аммиаком, загружают пептидил-полимер (10 мл раствора на 1 г полимера), помещают в колбу магнитный перемешивающий стержень, колбу плотно закрывают и перемеши-Бают суспензию на магнитной мешалке в течение 2 дней при комнатной температуре. Затем колбу открывают, полимер-носитель отфильтровывают, промывают его метанолом, объединенные фильтрат и промывную жидкость упаривают в вакууме. В случае пептидов, не растворимых в метаноле, применяют другой подходящий растворитель. [c.103]

Отщепление путем переэтерификации [56]. Метиловые эфиры. Пептидил-полимер суспендируют в безводном метаноле (40 мл метанола на 1 г полимера) и добавляют к суспензии триэтиламин (50 молей на 1 моль пептида). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 час. Полимер-носитель отфильтровывают, растворитель упариваюг и полученный метиловый эфир пептида очищают подходящим способом. [c.104]

Вследствие хорошо известной неустойчивости триптофана в кислых средах к синтезу триптофансодержащих пептидов твердофазным методом сначала подходили очень осторожно. Однако оказалось, что трип- тофан можно удовлетворительно вводить в пептидные цепи при твердофазном синтезе, осуществив небольшие изменения в обычной схеме. Для остатков триптофана в процессе синтеза представляют потенциальный риск два момента — это стадия отщепления БОК-групп и отделение конечного продукта от полимера-носителя. [c.111]

Для отделения триптофансодержащих пептидов от полимера-носителя без какой-либо потери триптофана можно использовать безводный фтористый водород [64]. Это и не удивительно, так как Сакакибара еще раньше показал, что фтористый водород не разрушает триптофан [106]. Отщепление раствором бромистого водорода в трифторуксусной кислоте приводит к потере не менее 15% триптофана. Для отщепления можно использовать также некоторые основные реагенты. Для триптофансодержащих пептидов успешно применялись аммонолиз [64], переэтерификация со спиртом и триэтиламином [56], отщепление действием этилата натрия [55]. [c.113]

По нашим оценкам твердофазным методом синтезировано до сих пор не мепее 200 различных пептидов. Мэррифилд опубликовал полный список [76] всех пептидов, твердофазный синтез которых описан в литературе до февраля 1967 г. В этом списке указаны полимер-носитель, защитные группы, конденсирующие агенты, реагенты для деблокирования, метод отщепления, способы очистки веществ, а также выходы полеченных соединений. Приложение Г иллюстрирует только возможности применения метода и суммирует некоторые последние достижения. [c.158]

Преыму1цества использования пористых стекол для анализа аминокислотной последовательности. Шарики PG сохраняют постоянный объем в ходе всего цикла отщепления, не подвержены набуханию — сжатию, поэтому в отличие от носителей на основе органических полимеров ими можно заполнять колонки без разбавления другими материалами. Стекла нечувствительны к давлению в колонке, поэтому жидкости можно прокачнва 1ь через колонку с высокой скоростью. Они химически устойчивы во всех средах, за исключением сильных оснований, особенно нри высоких температурах, поэтому присоединение пептидов к носителям следует проводить при рН<10. [c.383]

Подавляющее большинство химических связей между ФАВ и полимером-носителем специфически гидролизуется ферментами. Эта специфичность была использована для отщепления действующего начала в заранее заданном месте организма [42]. Разный набор ферментов в разных местах позволяет выделить среди них специфичные именно для клеток данной локализации. Наиболее широкий набор гидролитических ферментов имеется в лизосомах протеазы, нуклеазы, гликозидазы. Таким образом, чтобы добиться биодеструктируемости, необходимо ввести в нужное место карбоцепного полимера — в главнун> цепь или во вставку — фрагменты пептидов, олигосахаридов или олигонуклеотидов, которые были бы субстратами упомянутых ферментов и могли бы расщепляться ими [43]. Такие карбоцепные сополимеры были синтезированы на основе Н-(2-гидроксипропил)метакриламида (2.3). Они содержат боко- [c.59]

Отщепление синтезированного пептида от полимерного носителя , рис. 2-12) составляет последнюю стадию синтеза Меррифилда, а последующая очистка полученной смеси продуктов — самая трудная операция. Снятие полимера осуществляется с помощью реагентов, которые либо селективно расщепляют якорную связь между С-концевой аминокислотой и носителем, либо одновремеино с этим позволяют частично или полностью деблокировать полипептид. Связь типа алквлзамещенного бензилового эфира лучше всего расщепляется ацидолизом. Для этого часто применяются растворы бромоводорода в трифторуксусной кислоте, уксусная кислота меньше подходит в качестве растворителя из-за опасности ацетилирования гидроксиаминокислот. Описаны также многие отщепления при помощи безво- [c.192]

В настоящее время грег-бутилоксикарбонильная группа является стандартной защитной группировкой для а-аминогрупп при твердофазном пептидном синтезе (см. рис. 2). грег-Бутилоксикарбонильную группу можно удалять как безводным хлористым водородом в органическом растворителе, так и безводной трифторуксусной кислотой. Ни один из этих реагентов не расщепляет бензиловые эфиры. Таким образом, здесь имеется необходимое для успеха синтеза различие между устойчивостью связи пептида с полимерным носителем и связи защитной группировки с а-аминогруппой. В качестве носителя можно использовать ненитрованный сополимер стирола с дивинилбензолом, а конечный пептид можно отщеплять от полимера безводным бромистым водородом в трифтор уксусной кислоте или безводным фтористым водородом. Установлено, что оба метода отщепления дают удовлетворительные результаты и позволяют избежать осложнений, присущих отщеплению омылением. Имеются защитные группы, которые обеспечивают маскирование функциональных групп боковых радикалов аминокислот и в то же время совместимы с трет-бу тилоксикарбонильной группой. В настоящее время осуществлен синтез многих пептидов твердофазным методом при использовании этих групп. [c.43]

В других случаях происходит распределение реагентов в системе жидкость — жидкость. По этой причине концентрация реагента в микроокружении N-коицевой части пептида особенно мала. Этой проблемы легко избежать, используя систему с одним растворителем [80]. Местные перераспределения, происходящие по любому из вышеупомянутых механизмов, возникают в ходе последовательного отщепления и вызывают временное или постоянное снижение реакционной способности отдельных цепей. Этот недостаток усиливается при наличии заведомых негомогенностей в структуре матрицы (неравномерное распределение поперечных сшивок и т. д,), В результате химической модификации пористого стекла образуется поверхность, покрытая тонкой пленкой поперечно-сшитого силоксанового полимера, а не цепь, присоединенная к сорбенту в одной точке. Поэтому в случае носителей на основе стекла должны сущест- [c.441]

Два главных препятствия до сих пор ограничивают пределы возможностей автоматического ЖФ-метода Эдмана [32]. Первой проблемой является перенос остаточных аминокислот на каждый последующий цикл. Это явление происходит как из-за неполного присоединения реагента к белку, так и из-за неполного отщепления модифицированной N-концевой аминокислоты в виде 2-анилинотиазолинона другая проблема заключается в том, что па стадии кислотной обработки карбамоилпеп-тида (белка) происходит расщепление внутренних неустойчивых пептидных связей, приводящее к появлению новых полипептидных цепей, т. е. новых последовательностей. В результате этих двух процессов накопление фона ФТГ-аминокислот достигает такого уровня, что однозначная идентификация последовательности аминокислот основной цепи становится невозможной, Для снижения уровня остаточных пиков было предложено проводить и конденсацию, и отщепление АТЗ дважды в каждом цикле [31]. Однако такое изменение стандартной методики приводит к большим потерям пептида (вымывание из реактора). Для снижения этих потерь в реактор добавляют носители-белки или органические полимеры [78, 92], но, к сожалению, белки подвержены ацидолизу, в результате чего возникают ложные последовательности. Для снижения уровня остаточных аминокислот, появляющихся в результате неполного взаимодействия ФИТЦ с полипептидами (особенно если Pro—N-концевой остаток), повышают температуру реактора до 55°С [94]. [c.456]