анализ аминокислот чувствительность

Газовая хроматография как метод анализа аминокислот имеет следующий недостаток перед разделением необходимо дважды проводить дериватизацию. Как уже говорилось в предыдущих главах, некоторые методы ЖХ разработаны применительно к немодифицированным аминокислотам, тогда как другие предусматривают дериватизацию с целью упрощения обнаружения и увеличения чувствительности. [c.177]

Поскольку для ГХ-анализа вообще и анализа аминокислот в частности характерно стремление к получению наилучшего разделения при минимальных затратах веществ, обычно предпочитают пользоваться наиболее чувствительным из всех детекторов — пламенноионизационным (фиг. 69). [c.299]

Аминокислоты и другие вещества, содержащие первичные аминогруппы (пептиды, белки, амфетамины и др.) образуют с реактивом флуоресцирующие продукты. Используя флуориметрический детектор, чувствительность анализа аминокислот доводят до 10"i —10 i моль. [c.380]

В ходе исследования во многих случаях необходимо располагать простым и чувствительным методом анализа аминокислот, особенно при работе с малыми количествами веществ. Открытие а- [c.107]

Существенные экспериментальные трудности, которые до последнего времени ограничивали исследования в области белковой химии, в значительной степени обусловливались отсутствием простых и надежных способов анализа аминокислот. Лишь благодаря развитию за последние два десятилетия ионообменной и распределительной хроматографии удалось разработать автоматический метод количественного анализа аминокислот с использованием окисления аминокислот нингидрином и фотометрирования продуктов реакции [9]. Однако стремительное развитие химии белков и пептидов, среди которых обнаружены важнейшие биорегуляторы и антибиотики, уже сейчас предъявляет новые требования по чувствительности и быстроте анализа. Сложность аппаратурного оформления и дороговизна эксплуатации, безусловно, ограничивают применение автоматического анализатора Мура и Штейна и в значительной степени обусловливают интерес к разработке новых методов аналитического определения аминокислот, свободных от указанных недостатков. [c.252]

Одновременно разрабатывалась методика анализа аминокислот и других чувствительных к нингидрину соединений в физиологических жидкостях. Гамильтон [8] разработал систему высокого разрешения для таких жидкостей и получил более 175 хроматографических пиков чувствительных к нингидрину компонентов в одном образце мочи хроматографирование длилось около двух дней. [c.233]

Таким образом, последние годы ознаменовались бурным развитием газохроматографического разделения энантиомеров на различных оптически активных стационарных фазах. Быстрота анализа, высокая чувствительность и надежность результатов позволили применить эти методы для определения степени оптической чистоты диссимметрических соединений и расчета констант скоростей их рацемизации [111], для изучения процессов рацемизации в твердофазном пептидном синтезе [112], для определения абсолютной конфигурации производных аминокислот в соответствии с их хроматографическим поведением [ИЗ]. [c.65]

В хроматографии пептидов, как и в хроматографии кислот, наблюдается тенденция к автоматизации анализа. Лишь в редких случаях такой анализ ведут с целью полного разделения смеси пептидов и их идентификации. В принципе подобный анализ можно вести так же, как и анализ аминокислот, т. е. путем повышения эффективности колонки и чувствительности обнаружения. Окрашенные продукты, образующиеся в результате обработки элюата нингидрином, характеризуются малым по- [c.312]

Одно из достоинств метода ТСХ — его быстрота. Анализ аминокислот этим методом требует значительно меньше времени, чем хроматографирование на бумаге. Так, двумерное хроматографирование на бумаге длится несколько дней, тогда как методом ТСХ его можно осуществить за 4—5 ч. Другое преимущество ТСХ — повышенная чувствительность. Например, чувствительность определения гистамина этим методом в 2 раза выше, а чувствительность определения цистеиновой кислоты в 50 раз выше [24]. При двумерном разделении различие в чувствительности еще больше и для отдельных кислот может возрастать в 250—500 раз. [c.478]

Заметная флуоресценция появляется при температуре не ниже 37°. Преимуществом этого метода является то, что аминокислоты не разрушаются, в то время как при применении реактивов вроде нингидрина они переходят в другие соединения. Однако цветные реакции являются более чувствительными. При количественном анализе аминокислот применяют обычные методы, как, например, титрование, визуальную и фотоэлектрическую колориметрию и т. д. [c.160]

В ходе исследования во многих случаях необходимо располагать простым и чувствительным методом анализа аминокислот, особенно при работе с ма- [c.64]

Таблица 2.2. Относительная чувствительность анализа аминокислот методом жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией [66

Все большее зпачепие в химии белка приобретают проблемы загрязнения образцов посторонними примесями, поскольку чувствительность методов анализа повышается, а исследователю часто приходится иметь дело с очень малыми количествами вещества. Было показано, что источниками примесей при анализе аминокислот газожидкостной хроматографией могут быть отпечатки пальцев, грязное стекло, вода, соляная кислота, резиновые перчатки и более очевидные загрязнения — слюна, кусочки кожи, сигаретный дым [310]. Более 150 пептидов было обнаружено в одном отпечатке пальцев [242] (разд. 8.19.2.2). [c.243]

В последние годы благодаря использованию ферментов функции ионселективных электродов удалось существенно расширить и сделать их применимыми для быстрого клинического анализа на глюкозу, мочевину, аминокислоты и другие метаболиты. Такие электроды называются ферментными электродами или электрохимическими сенсорами. Создание электродов с указанными свойствами оказывается возможным благодаря тому, что ряд ферментов обладает высокой специфичностью, т. е. способностью катализировать превращения одного единственного вещества из многих сотен и даже тысяч веществ близкой химической природы. Если, например, фермент катализирует реакцию, в ходе которой изменяется pH среды, то рН-чувствительный электрод, покрытый пленкой геля или полимера, содержащей этот фермент, позволит провести количественное определение только того вещества, которое превращается под действием данного фермента. Из мочевины в присутствии фермента уреазы образуются ионы МН+. Если ионселективный электрод, чувствительный к ионам ЫН , покрыть пленкой, содержащей уреазу, то при помощи его можно количественно определять мочевину. Ферментные электроды — один из примеров возрастающего практического использования ферментов в науке и технике. [c.138]

Из многочисленных детекторов, существующих в настоящее время, для количественного анализа аминокислот пригодны только детектор по теплопроводности, газовый денситометр и пламенноионизационный детектор. В детекторе теплопроводности для обеспечения достаточной чувствительности в качестве газа-носителя необходим гелий или водород, в газовом денситометре — азот или гелий, а в пламенно-ионизационном детекторе — высокоочищен-ный азот. [c.299]

Специфика хроматографического анализа аминокислот определяется особенностями этой группы сорбатов, в которую входят представители, сильно различающиеся по кислотно-основным свойствам и УФ-спектрам. Работы этого класса можно выполнять различными методами, используя либо стандартную аппаратуру для ВЭЖХ, либо специализированные приборы — аминокислотные анализаторы. Выбор оптимального варианта диктуется характером аналитической задачи необходимой чувствительностью, наличием в образце веществ других классов, присутствием лишь нескольких аминокислот, либо всего набора белковых аминокислот. [c.328]

Использование стандартной ВЭЖХ-техники предпочтительно в тех случаях, когда аминокислотный анализ не является основной задачей лаборатории и работы этого типа выполняются эпизодически, а также если необходимо определение только некоторых из веществ этой группы. Наиболее подходящими вариантами являются обращенно-фазовая и ион-парная ВЭЖХ. Для повышения чувствительности детектирования перед анализом аминокислоты могут быть переведены в УФ-поглощающие производные. В некоторых случаях неплохие результаты получаются при детектировании свободных аминокислот в области 200—215 нм. [c.328]

Анализ аминокислот методом жидкостной хроматографии разрабатывался многими исследователями В настоящее время одним из самых чувствительных считается ВЭЖХ-метод определения аминокислот в виде даисилпроизводных Получают указанные производные путем обработки пробы аминокислоты 5-диметиламинонафталинсульфанилхлоридом (дансилхлоридом или ДНО [c.166]

Метод был успешно применен к анализу смесей парафинов и олефинов С1 — С12, нафтенов С5 — Са, альдегидов, спиртов и кетонов. На примере изомеров гексана показано, что чувствительность анализа в результате конверсии возрастает (высота пиков на хроматограмме увеличивается в 2 раза). Метод конверсии до метана был применен А. Златкисом с сотр. [35, 36] для анализа аминокислот и летучих альдегидов, образующихся при пин-гидриновом методе анализа аминокислот. [c.180]

Новый метод анализа аминокислот быстро развивался. Появилась возможность с его помощью приступить к решению ряда сложных, казавшихся неразрешимыми проблем, и прежде всего проблёмы определения первичной структуры белков. Вскоре стало очевидным, что анализ аминокислот в его первоначальном варианте слишком трудоемок и недостаточно эффективен. Ввиду этого был поставлен ряд исследований по механизации трудоемких операций и совершенствованию организации эксперимента. Основной вклад в решение этих задач вновь внесла группа исследователей под руководством Мура и Стайна [4]. Благодаря проведению реакции аминокислот с нингидрином в проточном капиллярном реакторе и измерению интенсивности окраски на регистрирующем проточном фотометре трудоемкая обработка фракции была преобразована в непрерывный процесс. Таким образом, на основе аналитического метода был создан новый прибор — аминокислотный анализатор. Выпуск и дальнейшее усовершенствование этого прибора были предприняты промышленными фирмами. Последующие усилия были направлены на повышение эффективности и чувствительности анализа. Первое время причиной низкой эффективности прибора служила длительность элюирования. Основой для дальнейшей оптимизации процесса послужила теоретическая работа Гамильтона [5], в которой было показано, что повышения эффективности можно достигнуть путем увеличения скорости подачи элюента и уменьшения размеров зерен ионита. В результате многочисленных модификаций ионитов (а эта работа все еще продолжается) удалось более чем в 10 раз сократить время элюирования без снижения разрешения. Сокращение продолжительности анализа [c.306]

В книге достаточно детально рассмотрены основные преимущества и недостатки классического метода определения аминокислотного состава белков с помощью ионообменной хроматографии по Муру и Стейну даны указания относительно выбора ионообменников, подготовки реактивов и численной интерпретации результатов. Значительное место также уделено изложению принципов анализа аминокислот методом газожидкостной хроматографии. Применение этого метода, обладающего на 2—3 порядка большей чувствительностью по сравнению с нингидринной реакцией по Муру и Стейну, позволяет значительно снизить количества белка, требуемые для определения его состава. Анализ аминокислот с помощью газожидкостной хроматографии пока еще не находит широкого применения, однако имеющиеся в ли-Фературе данные позволяют считать этот метод весьма перспективным. Кроме того, обсуждаются возможности использования газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектромет-рией для определения состава и аминокислотной последовательности в пептидах. [c.4]

Метод пептидных карт на одном листе бумаги сейчас следует рассматривать скорее как аналитический, чем как препаративный. При препаративном разделении пептидов в тех же условиях обычно смесь пептидов последовательно разделяется методами электрофореза и хроматографии в несколько приемов, каждый раз нанося пробу во всю ширину бумаги. После проведения электрофореза вырезают полосы бумаги таким образом, чтобы в середине и по трем краям оставались узкие полоски бумаги. После проявления этих полосок нингидрином вырезанные полосы вставляются обратно, и на них карандашом отмечаются пептидные зоны. Пептиды соответствующих зон с нескольких листов бумаги после смывания объединяются и хроматографируются опять же на полном листе (каждая объединенная зона отдельно). Подобные трудоемкие операции связаны с необходимостью иметь достаточное количество вещества для дальнейшего анализа. Повышение чувствительности методов анализа концевых групп даст возможность определять всю аминокислотную последовательность пептида после получения пептидной карты на одном листе бумаги. Для анализа К-концевых аминокислот уже разработан [8] флуоресцентный метод с 1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлЬри-дом, который в сто раз чувствительнее (достаточно 10 — 10" мкмоль пептида) обычно используемого метода с динитро-фторбензолом [9]. [c.237]

Еще одно направление развития методов анализа аминокислот связано со значительным повышением чувствительности анализа. Повысить чувствительность анализа до уровня пикомолей [193] можно, в частности, применяя флуорескамин (флуорам ). ( а ( этот реактив не флуоресцирует, но его аминокислотные производные интенсивно флуоресцируют при УФ-облучении. В результате обнаруживать соединения можно, [c.311]

Метод анализа аминокислот с помощью ионообменной хроматографии базируется на работах Штейна и Мура [3—5], которые систематически изучали проблемы, связанные с разделением и количественным определением наиболее распространенных аминокислот. В 1958 г. эти авторы [5] предложили автоматическую систему, позволяющую проводить полный анализ аминокислот за 24 ч. В дальнейшем эта система неоднократно модифицировалась с целью увеличения скорости и чувствительности анализа. В настоящее время предел обнаружения аминокислот составляет несколько пикомолей, а длительность анализа равна 90 мин. Следует, однако, отметить, что ни одна из современных систем не дает такого высокого разрешения, как система, предложенная Муром и др. [5] . Уменьшение разрешающей способности, которое является следствием увеличения скорости разделения, затрудняет или даже делает невозможным определение малораспространенных аминокислот. [c.37]

Бактерии широко используются для количественного анализа большого числа веществ, которые способствуют их росту или ингибируют его витаминов, аминокислот, микроэлементов, пиримидиновых оснований, полиаминов, дезоксирибонуклеозидов, дезоксирибонуклео-тидов, лекарственных гфепаратов, антибиотиков и других химиотерапевтических агентов [70, 105а]. Хотя инструментальные методы (например, анализ аминокислот с помощью аминокислотного анализатора) частично заменили некоторые из бактериологических методов, последние еще используются довольно часто. В некоторых случаях (например, при определении витамина Ве) наблюдается различная чувствительность к разным формам витамина, поэтому такой анализ нелегко заменить другими методами. До тех пор пока не удастся выделить и охарактеризовать фактор роста, его влияние на рост соответствующего организма часто служит единсгвен-ным показателем при последующем выделении этого фактора из природного материала. [c.260]

Регулируемая селективность масс-спектрометра как хроматографического детектора означает следующее параллельно с хроматограммой анализируемого образца по полному ионному току могут быть записаны одна или несколько хроматограмм по заранее выбранным значениям miz (так. называемые масс-фрагменто-граммы) . Следует подчеркнуть, что предел обнаружения в этом методе примерно в 100 раз меньше, чем по полному ионному току, что обусловлено снижением уровня шумов. Такой прием дает возможность даже в сложных смесях легко обнаруживать присутствие веществ, дающих в масс-спектрах сигналы с характеристичными массовыми числами, и широко применяется при анализе следов галогенсодержащих соединений в воздухе (на фоне относительно большого количества углеводородов), аминокислот в виде их летучих производных, метаболитов лекарственных препаратов и т. д. Для повышения чувствительности масс-фрагментограммы, как правило, записывают по массовым числам максимальных сигналов в спектрах анализируемых веществ. [c.201]

К реакционной газовой хроматографии (в смысле определения Драверта и сотр.) должен быть отнесен также метод, разработанный Златкисом и сотр. (1958, 1960) для прямого определения алифатических аминокислот в водном растворе при применении двух реакторов (см. разд. 8.1.2). В нагреваемом до 140° реакторе I, заполненном нингидрином, сначала происходит окислительное разложение аминокислот до летучих альдегидов и двуокиси углерода. Продукты реакции разделяются в присоединенной последовательно колонке при комнатной температуре и переводятся в реактор II, заполненный никелем на кизельгуре. Это заполнение обеспечивает при 425° гидрогениза-ционное расщепление всех альдегидов до метана. Присоединяемая к реактору II короткая колонка с молекулярными ситами служит для абсорбции образующейся и захваченной из пробы воды. Отдельные аминокислоты затем определяются в виде пиков метана при помощи катарометра. Применением реактора II решается относительно простая задача газохроматографического анализа веществ, содержащих воду, тем более что метан в отличие от альдегидов легко высушить. Кроме того, превращение альдегидов в метан позволяет более просто количественно определять аминокислоты, так как специфическая для данных веществ теплопроводность остается всегда одинаковой и вследствие этого не нужно вводить поправочных коэффициентов в количественные результаты. Тот факт, что катарометр при обычной температуре может применяться для определения метана, положительно сказывается на чувствительности метода. [c.274]

ТСХ модифицированных ароматическими заместителями аминокислот в последние годы предпочитают вести на пластинках с полиамидным покрытием, поэтому из обзора Нидервизера процитируем только методы фракционирования немодифицированных аминокислот. Разумеется, ни по чувствительности и воспроизводимости результатов, ни тем более по точности количественных определений ТСХ аминокислот не может конкурировать с современными аминокислотными анализаторами. Однако существует немало ситуаций, когда возможности ТСХ оказываются вполне адекватными поставленной задаче определение аминокислотного состава, сопоставление родственных полипептидов, выявление генетических различий, проявляющихся в замене каких-либо аминокислот, клинические анализы физиологических жидкостей и др. На рис. 160 показана приведенная в цитируемом обзоре картина распределения пятен носле двумерной ТСХ модельной смеси аминокислот на иластинках с сп-ликагелевым покрытием. На старт вносили но 1 мкг каждой из ал1И-нокислот в 0,5 мкл 0,1 М раствора НС1. Элюцию в нервом направленип проводили смесью хлороформа, метанола и 17 %-ного аммиака (2 2 1), а во втором — смесью фенола и воды (3 1 но массе). [c.482]

В клинич. анализе (анализ крови, мочи, тканей и др. объектов на содержание лек. в-в, метаболитов, стероидов, аминокислот и т.п.) важным является не только чувствительность, точность и экспрессность анализа, но и воспроизводимость его результатов. Когда последнее требование имеет решающее значение, применяют хромато-масс-спект-рометрию в стандартных условиях, а также высокопроиз- [c.403]