Создание градиента плотности сахарозы

Наиболее широкое применение нашел метод изоэлектрической фокусировки. Он основан на создании под действием внешнего электрического поля стабильного градиента pH, причем значение pH возрастает от анода к катоду. В такой системе каждый белок перемещает в том или ином направлении в соответствии со знаком своего заряда до тех пор, пока не достигнет участка, в котором значение pH совпадает с его изоэлектрической точкой. На этом участке дальнейшее его перемещение под действием электрического поля прекращается, так как его заряд становится равным нулю. Приложенное поле, поддерживающее стабильный градиент pH, препятствует также диффузному размыванию зоны. Механизм аналогичен только что рассмотренному эффекту градиента плотности раствора сахарозы на стабилизацию зон при седиментации. Действительно, если в результате диффузии белок уходит из участка, на котором pH = р1, в сторону катода, он попадает в область более высоких значений pH и заряжается отрицательно. Под [c.243]

Для создания преформированного градиента сахарозы пользуются специальными устройствами (см. раздел Градиентные и фракционирующие приборы ). Для центрифугирования вирусов обычно применяют градиент плотности сахарозы 20—60%. Исходные растворы сахарозы (20% и 60%) готовят на каком-либо буфере, обычно СТЕ, pH 7,4. Если объем центрифужной пробирки 20— 30 мл, то на созданный градиент можно нанести сверху 1—2 мл очищенной и концентрированной вируссодержащей суспензии (до 5—10 мг вируса). Количество наносимого вируса может варьировать для каждого типа вируса. [c.60]

Выше уже упоминалось о возможности использования градиента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведены соображения, касающиеся подбора концентраций инициирующих добавок в этом случае. Преимущества таких градиентных гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиентных гелей используют такие же смесительные устройства, как при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацентрифугирования. В этом случае также можно получать линейные и нелинейные градиенты, выпуклые и вогнутые , в том числе экспоненциальные. [c.24]

СОЗДАНИЕ ГРАДИЕНТА ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ [c.214]

Таким образом, почти единственным (во всяком случае, преимущественно употребляемым) материалом для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании является сахароза. Остановимся подробнее на свойствах ее растворов, способах образования градиентов плотности, выборе режимов центрифугирования и приведем несколько примеров центрифугирования в градиентах сахарозы. [c.210]

Затем через второй патрубок медленно (4 мл/мин) по стенке подают в колонку рабочий раствор, формируя при этом ступенчатый или плавный градиент плотности. При создании ступенчатого градиента в 33 нумерованные пробирки помещают по О, 0,1, 0,2... 3,2 мл разбавленного раствора сахарозы с амфолитами и по 3,2, 3,1, 3,0, 2,9... О мл концентрированного раствора сахарозы. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и поочередно, вручную или с помощью перистальтического насоса, вносят в рабочую камеру. [c.307]

Рис. 9. Прибор для электрофореза в градиенте) плотности в начале электрофоретического разделения [985]. А, Л-образная трубка. Б. Составные части поршня. 1 — аппарат для создания градиента плотности 2 — двухходовой кран 5 —трехходовой кран — пластмассовый шприц для вне сения пробы 5 — пропускание воздуха для перемешивания раствора при формировании градиента 6 — ось редуктора, понижающего число оборотов мотора 7—нитка 8 — анодная платиновая спираль Р —градиент —поршень /7 —проба в выбранном положении /2 — насыщенный раствор сахарозы 75 —пробка из полиакриламидного геля 74 — насыщенный раствор хлористого натрия /5 — катод 75 —водяная рубашка для термостатировання 77—пластмассовая трубка 75 —зубчатая насечка 7Р —пробка из полиакриламида или агарозы 20 — уплотнительное кольцо 21 — наконечник для присоединения пластмассовой трубки.

Образование градиента плотности. Существует много методов создания градиентов концентрации самого разнообразного вида (см., например, [14, 15]). Для электрофореза обычно применяют постоянный градиент плотности, для чего необходимо создать линейно меняющуюся с высотой концентрацию сахарозы в столбике жидкости подходящих размеров. Можно, например, просто аккуратно налить друг па друга слои жидкости с уменьшающейся концентрацией сахарозы. Если толщина слоев невелика, ступеньки постепенно сглаживаются диффузией можно [c.66]

Линейный градиент плотности раствора s l можно префор-мировать с помощью такого же смесителя градиента, какой был описан ранее при рассмотрении градиентов плотности сахарозы. Тяжелая жидкость должна иметь плотность р -1-Др/2, а легкая ро —Др/2. Обязательно надо позаботиться о том, чтобы площадь основания цилиндра, содержащего тяжелую жидкость (обычно смесителя), была больше площади основания второго цилиндра (резервуара) в соответствии с отношением плотностей двух жидкостей. Для приведенного выше примера это отношение равно 1,82 1,58=1,15. Можно рассчитать, что для создания такого соотношения площадей (в случае цилиндров равных диаметров) в резервуар придется вставить палочку, диаметр которой равен 0,36 диаметра цилиндра. [c.252]

Радикальный способ борьбы с нестабильностью исходной зоны — создание идеальной треугольной формы уже в момент ее введения. Было предложено устройство, позволяющее ввести зону одновременно с градиентом плотности [14]. Оно может оказаться очень полезным при препаративном разделении больших количеств вещества. Устройство состоит из трех последовательно соединенных сосудов, первый из которых открыт, а два последних закрыты и снабжены мешалками. Образец вводится в самый маленький последний сосуд, а первый и второй заполняются буферным раствором с сахарозой. При соответствующих размерах сосудов и концентрациях сахарозы можно добиться распределения плотности, хотя и нелинейного (экспоненциального), но достаточно близкого к идеальному . Понятно, что если применяется подобное устройство, возможен только нисходящий [c.77]

Стабилизация разделяемых компонентов при работе в периодическом режиме достигается при помощи градиента некоего вещества (сахарозы, фиколла и др.), которое соприкасается с электролитом, находящимся в электродных сосудах (рис. 3.8). Градиент плотности формируют над слоем концентрированного раствора вещества, используемого для создания градиента. Этот слой выполняет роль своего рода прокладки. Охлаждение осуществляется и снаружи (водяная рубашка), и изнутри (охлаждающий цилиндр) циркулирующей водой, температура которой составляет 4°С. Таким образом, поперечное сечение колонки имеет форму кольца, охлаждаемого с обеих сторон. По окончании электрофореза фракции отбирают, выпуская содержимое колонки через отверстие в ее нижней части или высасывая его при помощи насоса через капиллярную трубку в центре охлаждающего цилиндра [87]. [c.117]

Тем не менее, ввиду широкой распространенности метода ИЭФ в жидкостных колонках следует рассмотреть его особенности. Процесс ИЭФ белков здесь протекает в растворе амфолитов без носителя. Опасность конвекционного перемешивания слоев жидкости блокируется созданием по высоте колонки достаточно крутого линейного градиента плотности раствора сахарозы, которая не мешает формированию градиента pH и фокусированию белков. Колонку заполняют с помощью перистальтического насоса из смесителя градиента того же типа, что используется для приготовления линейных градиентов плотности растворов сахарозы для ультрацентрифугирования [Остерман, 1981]. На дно колонки амфолиты поступают в 50%-ном растворе сахарозы, к ее верхнему концу концентрация сахарозы снижается до 5%. [c.67]

Метризамид имеет определенные преимущества перед сахарозой в отношении плотности и вязкости его растворов. При одинаковой концентрации вязкость раствора метризамида несколько меньше, чем раствора сахарозы, а плотность — существенно выше. Это означает, что для создания устойчивых градиентов плотности растворов метризамида требуются заметно меньшие его концентрации. И все же метризамид практически почти не используют для зонально-скоростного центрифугирования, что объясняется рядом причин. Одна из них, как будет видно ниже,— очень низкие значения плавучих плотностей нуклеиновых кислот в его растворах и, следовательно, малые скорости осаждения [c.209]

Если диаметр резервуара больше диаметра смесителя (рис. 52, /), то начальные изменения плотности будут резче выражены, чем в случае линейного градиента, зато конец градиента будет более пологим. Это означает, что если в резервуаре находится более плотный раствор сахарозы, то градиент будет выпуклым (а), а если менее плотный — вогнутым (б). Только вариант б пригоден для создания градиента сахарозы с резким нарастанием плотности у дна пробирки. Жидкость, вытекающую из смесителя, в этом случае придется наслаивать по стенке пробирки. [c.216]

Из приведенных в предыдущей главе данных следует, что сахароза и глицерин непригодны для создания необходимого в этом случае градиента. Плавучая плотность нуклеиновых кислот выше, чем самых концентрированных растворов сахарозы [c.241]

Среда для растирания при выделении ядер должна содержать сахарозу (0,35—0,45 М) для создания изотоничности с клеточным содержимым, а также СаС12 (0,002 М) для предотвращения агрегации выделенных ядер. Из гомогената, освобожденного от клеточных стенок и неразрушенных клеток путем фильтрования через специальную ткань (М1гас1о1Ь), ядра осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 350 g. Основными примесями в данном случае являются крахмал и разрушенные ядра. Дальнейшая очистка достигается центрифугированием в градиенте плотности. При использовании градиента плотности сахарозы (0,8—2,0 М) удается получить довольно чистую фракцию ядер, однако их биохимическая активность оказывается низкой, очевидно, вследствие неблагоприятного воздействия раствора высокой осмотической концентрации [3]. Поэтому для [c.30]

Для выделения различных мембранных структур из гомогената, имеющих разные величины коэффициента седиментации, применяют зональное центрифугирование в градиенте плотности определенных веществ. Исследуемый раствор наносят на предварительно приготовленный в центрифужной пробирке градиент плотности и центрифугируют. Градиент создается путем последовательного наслоения растворов градиентной среды уменьшающейся концентрации (плотности) в центрифужной пробирке. Субклеточные структуры разделяются на отдельные зоны в соответствии с их относительной плотностью. Для создания градиента плотности необходимо подбирать вещества в чистом состоянии, не взаимодействующие с компонентами суспензии и реагентами исследуемого раствора. Чаще всего для этого используют сахарозу, однако ее растворы с высокой концентарцией имеют большую вязкость, вследствие чего происходит дегидратация органелл или их лизис. Кроме того, серьезным недостатком этого метода является проницаемость многих органелл для сахарозы, что вызывает их осмотическое разрушение и изменение эффективной плотности. Поэтому в настоящее время для создания градиента плотности предпочитают применять другие среды фиколл, перколл и др. (табл. 16). [c.218]

Сначала амфолиты-носи-тели с выбранныьм диапазоном pH смешивают с растворами, используемыми для создания градиента плотности. При работе с амфолином фирмы LKB его конечная концентрация составляет обычно 1%. Для получения необходимого градиента плотности в о)писанном выше приборе в нижнюю часть колонки наливают 50%-ную (масса/объем) сахарозу, а в верхнюю1 7о Ную или чистый раствор амфолина. Это делают с помощью градиентного смесителя, а при его отсутствии наслаивают друг на друга растворы сахарозы с постепенно убывающей плотностью. Исследуемую пробу можно смешать с одним из таких слоев. При использовании смесителя ее добавляют либо к легкому, либо к тяжелому раствору сахарозы. Кроме того, пробу можно нанести поверх сформированного градиента. После этого электродные сосуды наполняют соответствующими растворами. В катодный сосуд наливают разбавленный раствор этанолами-на или другого сильного органического основания (в случае же сильно основных белков используют гидро ксид натрия), а в анодный сосуд — разбавленную серную или фосфорную кислоту. [c.132]

Препарат ДНК можно приготовить любым стандартным методом и все операции проводить в растворе, так как необязательно работать с очень длинными молекулами. Проведите частичное расщепление ДНК рестриктазой Mbol и фракционирование в градиенте плотности сахарозы точно так же, как и при создании библиотеки фаговой ДНК [24]. [c.116]

Для создания градиентов плотности среды при зонально-скоростном центрифугировании нашли применение растворы следующих веществ сахарозы, глицерина, метризамида ( Ме1п8ат1-с1е ), фиколла ( р1соП ) и перколла ( РегсоИ ). Первые два вещества общеизвестны, поэтому приведем краткие характеристики трех остальных. [c.206]

Фиколл-400 — полисахарид, полученный сополимеризацией сахарозы и эпихлоргидрина, с молекулярной массой 400000, хорошо растворимый в воде и устойчивый в широком диапазоне pH (при рН<3 гидролизуется). Следует избегать его контакта с сильными восстановителями и окислителями. По плотности растворы фиколла уступают растворам сахарозы той же концентрации, а по вязкости заметно их превосходят. Главным достоинством фиколла является малое (при концентрации ниже 20%) осмотическое давление его растворов. Большой размер молекул фиколла не позволяет им проходить через клеточные мембраны, поэтому его используют для создания градиентов плотности при центрифугировании клеток, клеточных органелл и частиц, связанных с мембранами. Эти градиенты применяют не только при зонально-скоростном, но и (чаще) при равновесном центрифугировании [Aspray et al., 1975]. Порошкообразный фиколл производит шведская фирма Pharma ia . [c.208]

В начале главы были указаны причины относительно редкого использования глицерина для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании. Главным его недостатком является более высокая вязкость растворов по сравнению с растворами сахарозы той же плотности. Однако недавно повышенная вязкость концентрированных растворов глицерина была использована для фракционирования относительно тяжелых оЛигонуклеосом. Хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фракционировали в градиенте 7,6— 76% (по объему) глицерина при 130 ООО g в течение 16 ч. Профиль олигонуклеосом от моно- до пентамеров равномерно распределялся по этому градиенту [Rennie, 1979]. [c.239]

Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. И растворенное вещество (ДНК), и растворитель сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности s l, так как ионы цезия обладают большой массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. oli. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеидов плазмы крови человека. [c.49]

Для создания градиентов плотности растворов чаще всего применяются растворы сахарозы, иногда с фиксированным pH. В некоторых случях хорошее разделение получается при использовании вместо обычной воды D2O. В табл. 2.1 приведены свойства некоторых растворов сахарозы. [c.49]

Для создания необходимых градиентов плотности в целях устранения конвекционных потоков или разделения частиц по их плавучей плотности можно использовать и некоторые другие вещества. Тяжелая вода для этой цели непригодна, так как, обмениваясь с молекулами воды гидратной оболочки частиц, она увеличивает их плотность. Имеются данные о применении градиентов плотности коллоидного раствора окиси тория, поливинил-пирролидона, солей цезия и рубидия, тартрата калия (для вирусов), бычьего сывороточного альбумина (для эритроцитов) [2]. В специальных случаях можно использовать сульфолан, триметилфосфат и мочевину [5] например, при исследовании рибосомной РНК, когда требуется, чтобы растворы были оптически прозрачны при 260 нм, или же когда фракцию приходится добавлять непосредственно в сцинтилляционную смесь, или в тех случаях, когда вещества, создающие градиент плотности, не должны искажать определения с орцинолом или дифениламином [5], Однако наиболее часто для увеличения плотности раствора по-прежнему используют растворы сахарозы и солей цезия. [c.176]

Если требуется получить точные значения коэффициентов седиментации при помощи препаративного центрифугирования в градиенте плотности, то наилучшим решением является создание изокинетичесшго градиента. Последний формируется таким образом, чтобы за счет отношения Ц - К2р(дг)]/Ь(дг)] полностью скомпенсировать прирост ускоряющей силы с увеличением X Аппроксимацией такого градиента может служить надлежащим образом подобранный экспоненциальный градиент какого-либо компонента раствора, при добавлении которого р и 1 раствора изменяются пропорционально его концентрации. Тогда коэффициент седиментации является линейной функцией пройденного расстояния. При этом не следует забывать, что величины К2 препаратов и стандартов должны совпадать. Надо также отдавать себе отчет в том, что в концентрированной сахарозе могут обнаружиться заметные термодинамические эффекты, связанные с трехкомпонентно-стью системы. При правильном подходе, однако, центрифугирование в градиенте сахарозы является чрезвычайно эффективным средством исследования. [c.252]

Процесс создания преформированного градиента несколько отличается от создания градиента сахарозы. Используют тот же градиентный прибор но объем камер смесителя меньший — по 4 мл. В смеситель наливают раствор большей плотности, в резерв вуар — меньшей, причем в растворе с меньшей плотностью ресус-пендируется вирус. Общий объем этих двух исходных растворов не должен превышать объема центрифужной пробирки. Так как плотности исходных растворов для градиента сильно отличаются, то необходимо рассчитывать объем каждого из заливаемых в прибор исходных растворов, т, е, их вес должен быть одинаковым. Этот расчет делают по формуле [c.66]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология