Пептиды хроматография,

Метод ионообменной хроматографии является наиболее совершенным приемом разделения пептидов. Как и при хроматографии аминокислот, для этой цели используют полистирольные смолы типа Дауэкс, причем тип избираемой смолы (анионо- или катионообменник) зависит от характера разделяемых пептидов. Хроматографию кислых и нейтральных пептидов лучше проводить на сильных анионообменниках (Дауэкс-1, активная ионогенная группа — четвертичное аммониевое основание), тогда как [c.83]

НО все же она весьма полезна при характеристике и определении чистоты пептидов. Хроматографию на бумаге можно проводить как восходящим, так и нисходящим методом для этого, как правило, используют бумагу ватман, № 1. Растворители, обычно применяемые для хроматографии пептидов, перечислены в табл. 6. Сильно кислые (муравьиная кислота) и щелочные системы растворителей следует применять осторожно, так как они могут вызывать расщепление некоторых пептидов. (О реактивах для идентификации см. стр. 142—146.) Относительная подвижность пептидов в некоторых системах растворителей рас- [c.136]

Ввиду того, что различия в растворимостях полипептидов очень невелики, для выделения индивидуальных пептидов и.з смесей требуются специальные методы. К ним относятся фракционный диализ, распределительная хроматография (например, на колонке из бумажного порошка или листе бумаги), адсорбционная хроматография, ионнообменная хроматография, электрофорез и противоточное распределение по Крэйгу (т. е. распределение между двумя ограниченно смешивающимися жидкостями). Для характеристики выделенных пептидов и доказательства их однородности применяют противоточное распределение, количественный анализ аминокислотного состава и определение концевых групп полипептидной цепи. [c.383]

Хроматографию особенно щироко применяют в биохимических анализах, например для разделения аминокислот и пептидов, алкалоидов, стероидов, различных экстрактов из природных продуктов. Преимуществом ее является то, что для анализа достаточно очень небольшого количества вещества (порядка нескольких микрограммов). [c.113]

Обратнофазовая гидрофобная хроматография пептидов с элюцией ацетонитрилом дает хорошие результаты, однако, как уже упоминалось, этот растворитель дорог, трудно хранится и очень токсичен. Поэтому привлекают внимание работы, где в качестве органической составляющей элюента использовались спирты. [c.202]

ИОН-ПАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПЕПТИДОВ [c.203]

Для фракционирования пептидов используют различные методы колоночной хроматографии и ТСХ. Ранее мы уже знакомились с разделением пептидов гель-фильтрацией и обратнофазовой гидрофобной хроматографией. Нередко, если пептидов много, хроматографические методы следуют один за другим. Например, сначала пептиды разделяют на группы по размерам гель-фильтрацией, а затем следует ХОФ или ионообменная хроматография. [c.299]

Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих < оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

Для лучшего разделения соединений с близкими значениями R , а также для увеличения часто проводят хроматографирование в нескольких (обычно двух) системах растворителей, пропуская второй растворитель в том же направлении, что и первый. Это приводит к уплощению пятен разделяемых соединений в направлении, перпендикулярном пропускаемому растворителю, и способствует их лучшему разделению. Более полное разделение аминокислот и пептидов достигается при двухмерной хроматографии (второй растворитель пропускают в направлении, перпендикулярном первому) или при сочетании хроматографии (одно направление) и электрофореза (второе взаимно перпендикулярное направление). Последний метод носит название метода пептидных карт или отпечатка пальцев . [c.126]

Разделение аминокислот и пептидов с помощью ионообменной хроматографии может быть осуществлено двумя способами путем хроматографии на колонках и методом тонкослойной хроматографии. [c.133]

Описано фракционирование радиоактивно меченных пептидов трипсинового гидролизата белка на колонке Spherisorb ODS (0,46 25 см) линейным градиентом (0—62,5%) этанола в 4,5%-ном растворе НСООН. Фракционирование вели при температуре 40° со скоростью элюции 1,4 мл/мин в течение 95 мин [Smart et al., 1981]. В растворах с высоким содержанием этанола (как и ацетонитрила) растворимы ие все пептиды. Хроматографию труднорастворимых пептидов иногда удается осуществить, используя в качестве органического растворителя пропанол. В силу своей большей, чем у этанола, гидрофобности пропанол элюирует с октадециловых колонок даже крупные пептиды при концентрации менее 20%. Относительно высокая вязкость пропанола заставляет снижать скорость элюции, но для крупных пептидов это все равно необходимо делать ввиду их замедленной диффузии. [c.202]

Методы анализа фракций могут быть физическими, химическими и биологическими. Одним из лучших методов считается детектирование радиоактивных изотопов. Результаты измерений оформляют в виде кривой зависимости определяемой величины от объема злюата. По распределению пиков на хроматограмме судят о возможности объединения некоторых фракций, совершенно чистых, без примесей других компонентов. Методом ионообменной хроматографии можно разделять различные катионы и анионы, четвертичные аммониевые основания, амины, аминокислоты, белки, продукты гидролиза пептидов, физиологические жидкости, гидролизаты клеточных оболочек микробов, антибиотики, витамины, нуклеиновые кислоты. [c.361]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Бацитрацин А, выделенный из В. subtilis, был охарактеризован Крейгом (1955) как сшитый циклопептид, состоящий из 12 аминокислотных остатков, идентифицированных после частичного гидролиза пептида и его динитрофенильного производного комбинацией противо-точного распределения, бумажной хроматографии, зонного электрофореза н полного химического анализа [c.703]

Большинство аминокислот практически не поглощает свет в доступной для регистрации области, так что их приходится окра-тпвать нпнгидрином. Этот метод окраски будет подробно рассмотрен в приложении 2, посвященном аминокислотным анализаторам. Пептиды и белки поглощают свет в области 206—215 нм за счет пептидной связи и в широкой области спектра с максимумом вбли- и1 280 нм за счет присутствия в них ароматических аминокислот. Азотистые основания и нуклеиновые кислоты хорошо поглощают вблизи 260 нм. Поэтому не удивительно, что основной метод детектирования в хроматографии белков и нуклеиновых кислот — это регистрация поглощения света в ультрафиолетовой области спектра. Соответствующие приборы мы будем для краткости именовать УФ-детекторами. [c.82]

В УФ-детекторах фирмы РЬагтас1а иУ-1 и иУ-2 установлена ртутная лампа низкого давления, в новой модели иУ-1/214, предназначенной специально для регистрации белков и пептидов, ее заменяет цинковая лампа низкого давления, имеющая яркую полосу свечения при 214 нм. Использование дейтериевой лампы и монохроматоров в детекторах для обычной хроматографии практикуется редко ввиду дороговизны этих приборов и малой интенсивности света. Такие монохроматоры применяются для высокочувствительной ЖХВД. [c.83]

Уже упоминалось, что высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком дав.лении (ЖХВД) по.лучила очень широкое распространение главным образом в качестве экспресс-метода технологического контроля производства низкомолекулярпых природных (и неприродных) соединений. В исследованиях белков и нуклеиновых кислот ЖХВД играет пока бо.лее скромную, но заметную роль (фракционирование пептидов, идентификация аминокислот прц секвеннровании белков и др.). Далее мы увидим, что для исследо- [c.91]

Обессоливание и смена буфера с помощью гель-фильтрации широко используются в ходе очистки белков и пептидов для освобождения от сульфата аммония или в качестве промежуточной операции, подготавливающей препарат к последующему этапу хроматографии (ионообменной, аффинной или других видов). Если объем раствора белка изл еряется миллилитрами, то рутинную операцию его очистки нередко ведут вслепую . Однажды откалибровав небольшую колонку с сефадексом С-25, последующий отбор фракций, содержащих высокомолекулярные компоненты, производят по объему элюата, нередко просто путем отсчета капель. Соотношение объемов исходного раствора и колонки в этом случае может составлять примерно 1 10. В препаративных вариантах обессоливания, когда желательно максимально использовать объем колонки и избежать разбавления препарата, 5то соотношение можио увеличить до 1 3, контролируя выход хроматографических зон по УсГ-поглощению. Скорость элюции в таких опытах может быть значительной, порядка 20мл/см -ч (скорость продвижения фронта зоны очищаемого вещества по колонке — 20 см/ч). [c.137]

В другом варианте обратнофазовой гидрофобной хроматографии плазмы крови на колонке Li hrosorb RP-8 элюцию вели в среде, подкисленной до рП 3 монохлоруксусной кислотой, используя выпуклый градиент концентрации ацетонитрила (0—45%) в смеси с 0,05 М раствором ДДС-Na (1,4%о). Последний, по-видимому, блокирует заряды аминогрупп и обеспечивает гидрофобность аминокислот, т. е. играет роль ион-парного агента, как подробнее описано ниже для случая фракционирования пептидов. [c.194]

Реакция присоединения данзилхлорида но первичным аминогруппам давно используется для флюоресцентной метки пептидов и аминокислот [Остерман, 1981]. Как и в случае ОФА, при этом одновременно существенно увеличивается степень гидрофобности аминокислот, что улучшает возможности их хроматографии и повышается чувствительность детектирования. Существенным недостатком ме- [c.195]

Обратнофазовую гидрофобную хроматографию исноль.зуют обычно для разделения относительно мелких пептидов, наиример трипсиновых гидролизатов белка. Ввиду наличия в составе пептидов как гидрофобных, так и гидрофильных аминокислотных остатков их взаимодействие с гидрофобизированной матрицей оказывается не слишком сильным, и в практике встречаются режимы хроматографической элюции, сходные с оппсапными для ФТГ-АК. [c.201]

При разделении относительно крупных бромциановых пептидов ОС-, р- и 7-цепей глобина человека 0,1 %-ный раствор ТФУ, помимо своей роли в осуществлении ион-парной хроматографии, оказался очень полезен как прекрасный растворитель для пептидов, в частности гидрофобных. Кроме того, раствор ТФУ прозрачен вплоть до А, = 216 нм и легко удаляется лиофилизацией. Фракционирование вели на колонке Li lirosorb RP-8 (0,46 X 50 см). Использование сорбента с меньшей, чем в рассмотренных выше примерах, гидрофобностью обусловлено большими размерами пептидов. Колонку уравновешивали 0,1%-ньш водным раствором ТФУ, впрыскивали в нее 100 мкл смеси пептидов и вели элюцию линейным градиентом концентрации изопропанола (от нуля со скоростью нарастания 1,6% в минуту) в течение 1 ч при температуре 28 и скорости подачи элюента 0,7 мл/мин. Профиль элюции показан на рис. 96 (сплошная линия). Пептиды длиной 32, 43 и 64 аминокислотных остатка хорошо отделились друг от друга [Mahoney, Hermod-son, 1980]. [c.204]

В начале 1982 г. было опубликовано исследование, посвященное сопоставлению возможностей использования RP-8-, RP-18- и феппл-силикагелей для фракционирования трипсиновых пептидов в двух вариантах линейной градиентной элюции обычного градиента концентрации пропанола при pH 4 и ион-парной хроматографии с градиентом концентрации ацетопитрила. Были выбраны следующие комбинации растворителей при элюции пропанолом раствор А — 0,25 М пиридин в 0,9 М СН3СООН (pH 4) раствор В — 60%-ный раствор пропанола в растворе А. При ион-парной хроматографии использовали следующие комбинации раствор А — 0,09 %-ный водный раствор ТФУ раствор В — смесь ТФУ, воды и ацетопитрила в пропорции 0,09 9,91 90. В обоих случаях использовали линейный градиент (О—70%) раствора В в смеси с раствором А. [c.206]

Рассмотрению возможностей обратнофазовой гидрофобной хроматографии белков в основном посвящен сравнительно недавно опубликованный обзор [Rubinstein, 1979]. Основные его выводы совпадают с тем, что было сказано выше при рассмотрении обратнофазовой гидрофобной хроматографии пептидов. Для белков с молекулярной массой в интервале 12—30 тыс. Дальтон автор отдает предпочтение силикагелям, модифицированным октилсиланом (Са). В качестве органического компонента элюента, по его мнению, следует предпочесть градиент концентрации пропанола, вплоть до 40%-ной концентрации, если позволяет растворимость белка. Для получения узких пиков рекомендуется в качестве водного компонента использовать буфер высокой (примерно 1 М) концентрации, подавляющий ионное взаимодействие белка с силанольными группами матрицы. При pH 5—6 разрешение получается обычно хуже, чем при pH 4 (формиатно-пиридиновый буфер) или 7,5 (Na-ацетатный буфер). Существенно указание на то, что скорость элюции следует снизить до 60—90 мл/см Ч. Продолжительность фракционирования белков при этом остается относительно небольшой — 1—3 ч. Белки целесообразно разделить предварительно на группы [c.210]

Фракционирование аминокислот — важная область применения ионообменной хроматографии, обеспечивающая в первую очередь анализ алпиюкислотного состава белков и пептидов после их исчерпывающего гидролиза, а также физиологических жидкостей и пище- [c.295]

Изящная комбинация химической модификации с ионообменной хроматографией была использована для быстрого отбора из совокупности пептидов, полученных после трипсинового гидролиза, тех из них, которые содержат Met. Смесь трипсиновых пептидов растворяли в 30%-ной СН3СООН и обрабатывали радиоактивно меченным иодацетамидом. На атоме серы метионина возникал дополнительный положительный заряд, поэтому при хроматографии на сильном катионообменнике такие пептиды задерживались но сравнению с нормальным положением их элюции. По наличию метки со- [c.298]

В предыдущем разделе мы упоминали рекламные сведения фирмы LKB о возможностях ионообменной хроматографии смеси пептидов на новых поиооблтепниках типов 2133 UltroPak TSK 545 DEAE и ...TSK 535 M . О фракционировании белков на атих обменниках пока пс сообщалось, но можно думать, что такие данные в недалеком будущем должны появиться. [c.314]

В числе аффинных сорбентов, выпускаемых той и е фирмой, есть еще один, предназначенный также для ковалентной хроматографии. В отличие от всех предыдущих он па конце довольно длинного спейсера несет атом ртути, охотно связывающий меркаптосоедюшния. Такой сорбент мончно использовать, например, для выделения из смеси пептидов, содержащих цистеин [c.397]

В заключение отметим вариант двумерного фракционирования нентидов комбинацией колоночной (в данном случае — ионообменной) хроматографии и ТСХ фракций с колонки на пластинках силикагеля [Aromatorio et al., 1980]. Это — частный пример из широкой области использования ТСХ как дополнительного инструмента для анализа результатов фракционирования пептидов различными рассмотренными ранее методами колоночной хроматографии, в том числе и ЖХВД. [c.490]

Рассмотрение принципа действия и особенностей использования аминокислотного анализатора начнем с того, что сформулируем представления об анализируемом препарате. Для наиболее интересного случая — анализа состава белка — им является смесь 20 природных аминокислот. Все компоненты этой смеси представляют одинаковый интерес, подлежат полному разделению и количественной оценке. Интервал. молекулярных масс простирается ог 75 (Gly) до 204 (Тгр), диапазон значений р1 — от 2,97 (Glu) до 10,76 (Arg). Различия в стеиени гидрофобности тоже выражены сильно от гидрофильных дикарбоновых и оксикислот до весьма гидрофобных, несущих довольно протял<енные алифатические и ароматические боковые группы. Заметим сразу, что такие различия должны облегчить задачу хроматографического разделенпя, но вряд лн позволят обойтись без ступенчатой смены элюентов. В обычных условиях хроматографии все алшнокислоты достаточно устойчивы, но следует обратить внимание с этой точки зрения и на предшествующий хроматографии этап исчерпывающего гидролиза белков и пептидов (от него будут зависеть и результаты анализа). Агрегация аминокислот маловероятна, за исключением возможности окисления цистеинов до цистинов. Не-специфическая сорбция за счет гидрофобных взаимодействий с материалом матрицы безусловно возможна, но здесь она будет использоваться в интересах фракционирования. [c.515]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология