Холинэстераза в анализе

Если холинэстераза иммобилизована с помощью ковалентного связывания, то срок службы биосенсора возрастает Так, датчик, состоящий из рН-электрода с иммобилизованной на поверхности ацетилхолинэсте-разой (путем сшивки глутаровым альдегидом с альбумином), функционирует без изменения характеристик достаточно длительное время. С его помощью определяли паратион и севин на уровне 10 - 10моль/л Продолжигельность анализа 30 мин. Содержание паратиона и севина контролировали по относительному снижению отклика сенсора после внесения в ячейку аликвоты пробы. Заметим, что величина измеиения pH зависит не только от активности фермента, но и от буферной емкости раствора. Поскольку увеличение кислотности происходит лишь на мембране, а в объеме раствора pH остается практически постоянным, обычно применяют высокие (до 0,1 моль/л) концентрации субстрата и ячейки большого (100 мл и выше) объема. Кроме глутарового альдегида для иммобилизации холинэстеразы используют сополимеры акрил- и метакриламида, желатин. В последнем случае стеклянный шарик рН-электрода погружают в 5-10%-й раствор желатина, содержащий фермент, затем высушивают и обрабатывают водным раствором глутарового альдегида. Аналогичные мембраны используют и в датчиках на основе рН-чув-ствительных полевых транзисторов (911. [c.294]

Энзиматические методы анализа пестицидов разработаны и используются почти исключительно для определения фосфорорганических соединений. В действии этих соединений одной из основных черт является подавление холинэстеразной энзимной системы, что, вероятно, связано и с их высокой токсичностью по отношению к млекопитающим. Многие из таких соединений сами по себе, их метаболитические продукты или продукты химических превращений обладают столь значительной способностью тормозить действие холинэстеразы, что на этом свойстве основывают методы их чувствительного определения, часто превосходящие в этом отношении химические методы анализа. [c.16]

В литературе приведено большое количество экспериментально измеренных величин констант Михаэлиса для различных по химическому строению субстратов и холинэстераз различных тканей. Однако в основном это разрозненные данные, полученные часто при несопоставимых условиях реакций, что затрудняет их анализ применительно к исследованию механизма действия холинэстераз. [c.157]

Что касается точности результатов количественных определений Б полевых лабораториях, то в связи со стремлением упростить работу этих лабораторий они несомненно уступают в этом смысле стационарным лабораториям, располагающим большим запасом времени для проведения работы и лучшим техническим оснащением. Это должно найти отражение и в точности расчетов. Бессмысленно, например, данные по угнетению холинэстеразы, полученные при биохимическом анализе на бумаге, рассчитывать с [c.22]

Выше мы рассмотрели результаты применения методов ферментной кинетики, а также некоторых других методов к анализу реакций, катализируемых холинэстеразами, и реакций этих ферментов с ингибиторами. Представляется полезным суммировать изложенные выше выводы и обсудить наиболее вероятный механизм каталитического действия данных ферментов, хотя многие вопросы механизма действия холинэстераз сейчас еще окончательно не решены. [c.237]

Как правило, лимитирующая стадия реакции (обычно это превращение фермент-субстратного комплекса) характеризуется величиной энергии активации — 10 ккалЫоль, причем часто значение Е достигает 1—2 ккал/моль. Образование комплекса Михаэли- са часто происходит при еще меньших значениях энергии активации. Вместе с тем, при анализе термодинамических данных ферментативных реакций весьма отчетливо выступает влияние энтропийного фактора на скорость процесса. Так, например, при действии аденозинтрифосфатазы на АТФ (см. стр. 131) образование комплекса Михаэлиса происходит с большой скоростью вследствие определяющего влияния изменения энтропии (49,9 энтр. ед.), но не величины энергии активации (21 ккал/моль). Аналогичное значение имеет А5 для многих других ферментов, например, для ацетил холинэстеразы (подробнее этот фермент будет рассмотрен в гл. X). [c.135]

ХОЛИНЭСТЕРАЗА, см. Ацетилхолинэстераза. ХОЛОСТОЙ ОПЫТ (контрольный опыт), повторение процедуры хим. анализа в аналогич. условиях (с теми же реагентами, приборами и т. п.), но без анализируемого к ва. Проводят для определения поправки, к-рую необходимо вычесть из значения аналит. сигнала, измеренного при анализе исследуемого в-ва, чтобы получить правильный результат. Иногда поправку специально не определяют, а учитывают непосредственно в ходе измерений аналит. сигнала напр., в дифференц. спектрофотометрии р-р, полученный в X. о., используют в качестве р-ра сравнения. X. о., проведенный без анализируемого в-ва, не всегда позволяет найти правильное значение поправки, т. к. распределение определяемого компонента между фалами в разл. стадиях анализа может зависеть от содержания всех остальных компонентов. Флуктуации результатов X. о. определяют предел обнаружения вещества. Значения поправки X. о. зависят от чистоты реактивов и условий анализа. ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТЫ, сульфатированные муко-полисахариды. Входят в состав соединит, тканн животных (хрящей, сухожилий). Углеводные цепи X. (см. ф-лу) по- [c.665]

На рис. 33 приведена схема аппаратуры для исследования кинетики действия холинэстераз с использованием регистрирующего рН-метра. На рис. 34 представлена фотография типичной кинетической кривой, записанной на приборе, а на рис. 35 — кинетическая зависимость, пересчитанная в координаты [№] —время. Последняя прямая показывает, что наблюдаемая реакция имеет нулевой порядок. Обращает на себя внимание первоначальный период ускорения реакции, постоянно наблюдаемый при регистрации снижения pH в первые секунды после прибавления субстрата в реакционную среду, содержащую фермент. К анализу причин этого явления мы обратимся ниже. [c.147]

Первые попытки количественного анализа кривых рН-зависи-мости активности холинэстераз принадлежат Уилсону и Бергману [79]. [c.181]

Эти методические подходы в последние годы начали использоваться для анализа связи между строением ФОС и их реакционноспособностью в нуклеофильных реакциях, в том числе в реакциях с холинэстеразами. [c.212]

При анализе зависимости антихолинэстеразных свойств фосфорорганических соединений от их химической структуры были приняты во внимание следующие соображения. Анализ показателей, характеризующих кинетику ферментативного гидролиза ацетилхолина, давал повод думать о том, что механизм действия исследуемых препаратов па холинэстеразу сводится к фосфорилированию последней. [c.443]

Основу чувствительной к ферменту электродной системы, предназначенной для анализа холинэстеразы в сыворотке крови, составляют рН-электрод и тонкая полимерная мембрана, из которой удалена [c.204]

Кроме того, оборудование большинства передвижных полевых автолабораторий дает возможность отбирать любые- пробы для анализа. При помощи средств, предназначенных для биохимического определения фосфорорганических ОВ, в этих лабораториях можно определять активность холинэстеразы в крови. [c.249]

Взаимосвязь между концентрацией инсектицида в растворе и степенью угнетения холинэстераз устанавливается опытным путем для условий проведения анализа и выражается в виде графика или стандартной шкалы. [c.199]

Для анализа использовали метод подавления холинэстеразы [c.170]

Еще недавно почти все анализы остаточных количеств систокса проводили по энзиматическому методу который вначале был разработан для систокса, а затем для многих других фосфорорганических пестицидов. Однако при исследовании метаболизма систокса найдено что остатки систокса представляют собой в основном продукты окисления его изомеров. Поскольку активность подавления холинэстеразы каждого из этих соединений различна, очевидно, что без предварительного знания природы исследуемых веществ нельзя провести точный анализ. Предполагалось также, что сам систокс обладает наименьшей ингибирующей способностью. [c.401]

Оптимизация определений необратимых ингибиторов холинэстераз-достаточно сложный и трудоемкий процесс. Поэтому при вьшолнении анализа строго соблюдают последовательность операций по подбору фер-мергга, составу реакционной среды, концентрации субстрата и др Эго позволяет снизить пределы обнаружения ингибитора и повь сить то шость определений [c.291]

В аналитических исследованиях в связи с иммобилизованными ферментами необходимо упомянуть ферментные электроды [21], ферментные термисторы [40] и ферменты, ковалентно связанные с полистиролом или найлоном для целей автоматического анализа [24, 46]. Гильбо [22], например, использовал ферментные электроды для определения глюкозы, мочевины, L-аминокислот, галактозы, ацетилхолина и дегидрогеназ. Ферхмеиты, связанные с капиллярными реакторами, использованы в соединении с автоанализатором фирмы Te hni on для анализа различных субстратов, таких как глюкоза, мочевина и мочевая кислота [55]. Гудзон и др. [20] описали применение иммобилизованной холинэстеразы для контроля воздуха и воды, для обнаружения ингибиторов фермента, таких, как пестициды. Система характеризуется чрезвычайной чувствительностью. Например, органофосфат параоксон может быть обнаружен в количествах 1 10 в воздухе и воде. [c.442]

Этот метод дает удовлетворительные результаты при изменении концентрации ацетилхолина не менее чем на 25%, что не позволяет исследовать начальный участок кинетической кривой. Самый по себе метод не дает кинетической кривой, и для ее построения необходим анализ значительного числа проб, что создает большие технические трудности. Наконец следует отметить, что метод Хестрина не вполне специфичен и при наличии в анализируемой пробе эфиров карбоновых кислот (а также ангидридов, галоидангидридов и тому подобных активных ацильных производных) получаются неудовлетворительные результаты. Это особенно приходится иметь в виду при работе с ингибиторами холинэстераз, многие из которых имеют строение эфиров и ангидридов. [c.144]

Применительно к простым реакциям фосфорсодержащих соединений (диссоциация кислот, таутомерные превращения, гидролиз и некоторые дру- pJ гие реакции) М. И. Кабач-ником [151] была разработана теория, позволившая показать правомерность применения корреляционных уравнений и вычислить значения констант бф для разнообразных заместителей А и В при фосфоре. Однако использование этих констант для анализа влияния заместителей на реакционноспособность ФОС в отношении холинэстераз находит пока ограниченное применение. [c.213]

При анализе причин повышения антихолинэстеразной активности необходимо иметь в виду, что сама по себе подвижность Р—8-свЯзи, по-видимому, мало меняется при изменении структуры радикала. Как следует из данных табл. 33, константа скорости щелочного гидролиза в этом ряду соединений почти не изменяется. Это значит, что распределение плотности электронов в молекуле, подвергающейся нуклеофильной атаке гидроксила при щелочном гидролизе, у рассматриваемых соединений различается несущественно. Об этом же говорят величины энергии активации для реакции ингибирования холинэстераз. Таким образом, энергетический барьер нуклеофильного замещения, определяющийся в основном распределением зарядов в реагирующих молекулах, по-видимому, одинаков для всех четырех соединений. Из данных таблицы следует, что увеличение константы скорости фосфорилирования холинэстераз есть следствие повышения предэкспонента RZ, отражающего возрастание пространственного соответствия молекулы ингибитора структуре активной поверхности. При появлении в молекуле ингибитора тетраэдрической структуры с тремя метильными группами (ХХХУП ), близкой по строению катионной группе ацетилхолина XXXИ, повышается способность [c.233]

Таким образом, вопрос о конкретном химическом строении участка холинэстераз в районе катионной группировки требует дальнейшего исследования. При этом необходимо иметь в виду, что использование методов ферментативной кинетики для этих целей может быть полезным только в том случае, если для сопоставления выбираются адэкватные константы, что не во всех случаях принимается во внимание. Так, например, вывод о том, что 3,3-диме-тилбутилацетат в качестве субстрата холинэстераз несущественно отличается от ацетилхолина [174—175], был основан на сопоставлении скорости гидролиза при концентрации оптимальной для каждого субстрата. При этом, следовательно, оценивалась максимальная скорость реакции, которая находится в сложной зависимости от констант скорости промежуточных стадий. Без анализа кинетики этих стадий и оценки констант субстрата или констант [c.236]

Параоксон - диэтил-п-нитрофенилфосфат - обычно определяют по вызываемому им снижению активности холинэстеразы в диапазоне концентраций от 100 до 1000 нг/мл со стандартной ошибкой 12 нг/мл. Тетрам — кислый оксалат 0,0 -диэтил-8- -диэтиламинэтилфосфотиола-та — также определяют в области концентраций от 50 до 300 нг/мл со стандартной ошибкой 19,2 нг/мл [619]. Этот метод применим также для анализа органических карбаматов, снижающих активность холинэстеразы. [c.204]

Гибсон и Гюильбо [625] предложили два метода определения активности холинэстеразы. В обоих методах используется то обстоятельство, что измеренный стеклянным электродом pH разбавленного трис-буфера при значениях pH, близких к рК (8.1), меняется линейно. Один из методов — это полуавтоматический анализ, рассчитанный на [c.205]

В работе Филлипса и др. (Phillips et al., 1962) представлена схема анализа пищевых продуктов, позволяющая обнаружить, охарактеризовать и оценить количество большинства инсектицидов, которые подавляют холинэстеразу или содержат хлор. С этой целью бензольный очищенный экстракт образца подвергают исследованию тремя независимыми методами методом биопроб, определением общего количества органического хлора и методом, позволяюпщм установить аптихолинэстеразноё действие. Совместная обработка полученных результатов позволяет придти к определенным выводам. [c.10]

Очень существенно при проведении анализа пользоваться хорошо отработанными препаратами как энзима, так и субстрата. Несоблюдение этого условия может привести к несопоставимости полученных результатов. Однако Янок и Кемка (Janok, Кешка, 1956) показали, что ингибиция тиофосом мало зависит от сорта и чистоты препарата холинэстеразы. [c.17]

Ацстилхолиновый электрод применим для анализа органофос-фатных пестицидов, поскольку последние проявляют ацетилхо-лииэстеразпую активность [57]. Кроме того, электрод использовали для определения активности холинэстеразы в крови и ее составляющих (сыворотке, эритроцитах [58] см. также гл. XI). [c.228]

Для обнаружения фосфорорганических пестицидов применяется множество реагентов. Грант и др. [96] привели таблицу чувствительности обнаружения 12 фосфорорганических соединений при обработке хроматограмм И различными обнаруживающими реагентами, а Уоттс [97] опубликовал обзор реагентов, применяемых для обнаружения соединений этого типа. Наибольщей чувствительностью отличается проба по подавлению активности холинэстеразы (Т-113) с помощью этой пробы можно идентифицировать весьма малые количества пестицидов— вплоть до 40-10- г. Содержащиеся в образце примеси мало влияют на результаты анализа. Однако надо следить, чтобы хроматограммы не были перегружены Кессиди и др. [98] нащли, что экстракты люцерны, которую не опрыскивали пестицидами, образовали зоны подавления, когда аликвотные доли были слишком велики. [c.165]

В случае применения антихолинэстеразного вещества сильное повышение активности нерва происходит, по-видимому, из-за внезапно наступающей неспособности холинэстеразы удалять свободный ацетилхолин, выделяющийся в синапсах, количество которого становится выше необходимого для нормального течения процессов в постсинаптической области. Но это объяснение механизма действия неприменимо для случая с ДДТ, поскольку ДДТ не ингибирует холинэстеразу. При отравлении ДДТ все же происходит нарушение стабильности в синапсах центральной нервной системы. Маловероятно, чтобы нестабильность вызывалась непосредственно ДДТ, поскольку, во-первых, химический анализ даже нескольких граммов нервных цепочек тараканов, отравленных ДДТ, показал отсутствие этого инцектицида, а, во-вто-рых, нестабильность имеет обратимый характер. Подобрав соответствующую дозу ДДТ, возможно вызвать у тараканов (в 0дн0]М и том же температурном интервале в несколько градусов) прострацию или же возврат к нормальной жизнедеятельности. При этих условиях в фазе прострации будет наблюдаться нестабильность в синапсах, а при выздоровлении насекомых — стабилизация. Спонтанный поток нервных импульсов в центральной нервной системе будет иметь место или будет отсутствовать в зависимости от того, находится ли насекомое в фазе прострации или произошел возврат жизнедеятельности к норме. [c.159]

ДДВФ — сильный ингибитор холинэстеразы холинэстеразным методом были получены удовлетворительные результаты при анализе остатков. Однако для анализа препаратов этот метод не пригоден. [c.292]

Для определения остатков диброма разработано два основных метода анализа. Один из методов — неспецифичный — основан на угнетении холинэстеразы, другой — специфичный — заключается в превращении диброма в ДДВФ с последующим количественным определением методом микрокулонометрической газовой хроматографии. Оба метода неоднократно модифицировались, особенно обращалось внимание на усовершенствование способа очистки. [c.316]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология