Взаимодействие фермента с константа Михаэлиса

Изложенное выше, по-видимому, применимо и к отщеплению продуктов ферментативной реакции из связи с активным центром и регенерации свободного фермента. Видимо, и в этом случае происходит последовательный разрыв связей, в ходе которого может освобождаться функциональная группа активного центра, способная к реакции с ингибитором (например, гидроксил серина). Другие группировки, оказывающие влияние на реакционноспособность этой группы, могут оказаться в момент реакции с ингибитором еще занятыми. Очевидно, что при этом фосфорорганический ингибитор будет реагировать с ферментом с иной скоростью, чем при полностью свободном активном центре. Такое явление особенно должно сказываться на кинетике ингибирования при концентрациях субстрата, значительно превышающих величину константы Михаэлиса, т. е. тогда, когда активные центры насыщены молекулами субстрата и для реакции с фосфорорганическим ингибитором доступны лишь те, которые освобождаются в ходе ферментативной реакции. При этом, естественно, скорость ингибирования фермента будет зависеть от соотношения констант скорости к+х (реакция с субстратом) и к1 (реакция с ингибитором). Это соотношение будет неизменным, если реакция идет с полностью свободным активным центром. Оно будет изменяться (при избытке субстрата), если ингибитор будет взаимодействовать с неполностью освобожденным активным центром. Если эти соображения выразить языком кинетики, то можно получить уравнение, вполне аналогичное уравнению (Х.8). Для этого достаточно считать, что с ингибитором реагирует не ацилированный фермент, а продукт его превращения, в котором гидроксил серина уже свободен, но фермент еще не принял исходного структурного состояния. Такое предположение в равной мере объясняет различие соотношения констант скорости ингибирования в отсутствие и в присутствии субстрата для разных по структуре ингибиторов. [c.231]

Здесь Кш,п — величина константы Михаэлиса для превращения субстрата со степенью полимеризации Кп.н — микроскопическая копстапта ассоциации субстрата со степенью полимеризации п с активным центром в таком положении, что восстанавливающий конец субстрата взаимодействует с некоторым сайтом /г, причем суммирование в выражении (43) проводится по всем сайтам активного центра / (см. рис. 11). Видно, что макроскопическая константа ассоциации субстрата с ферментом (величина, обратная константе Михаэлиса) просто равна сумме всех микроскопических констант ассоциации возможных позиционных изомеров. [c.65]

Лишь для нескольких отдельных ферментных реакций было возможно определить величины констант, входящих в Км- Наименьшей по величине, лимитирующей, была константа Кз, как предполагалось теорией. Однако для многих случаев Кз не была лимитирующей, и поэтому оказалось невозможным принимать величину Км за постоянную диссоциации комплекса фермент—субстрат. Несомненно одно — константа Михаэлиса — это величина, хорошо характеризующая действие фермента. Она связана с комплексным, но подчас очень различным взаимодействием между Е и 5. [c.53]

Зависимость констант ]Михаэлиса кз и Км от pH может быть весьма сложной. Поэтому для исследования зависимости от pH среды требуется использование буферных растворов. При этом нередко оказывается, что между компонентами буферного раствора (особенно НРО ) и ферментом имеется определенное взаимодействие. Кроме того, влияние на активность белка и активность субстрата также оказывает ионная сила раствора, что еще в большей степени усложняет интерпретацию процесса в буферном растворе. Этот факт не всегда принимался во внимание. Во всех уравнениях, применявшихся в этом разделе, концентрации должны быть заменены на активности. Когда концентрация субстрата меняется в широком диапазоне, то поправка на активность может быть весьма существенной. Например, изучение скорости реакции уреаза — мочевина в диапазоне концентрации мочевины от 0,0003 до 2,0 М показало, что при высоких концентрациях мочевины скорость реакции падает [112]. Это может быть связано с изменением активности, а не механизма реакции. [c.564]

В случае механизма Бриггса — Холдейна, для которого 2 -1, отношение кса /Км равно к] — константе скорости связывания фермента и субстрата. В гл. 4 будет показано, что константы скорости связывания должны быть порядка 108 М . с-. Это позволяет сделать вывод, что для механизма Бриггса — Холдейна отношение кса. /Км равно 10 — 10 М С-. Каталаза, ацетилхолинэстераза, карбоангидраза, кротоназа, фумараза и триозофосфатизомераза — все эти ферменты по указанному критерию подчиняются кинетике Бриггса— Холдейна, о чем свидетельствуют данные табл. 4.4. Еше одним ферментом такого типа является пероксидаза, выделенная из хрена,— один из первых ферментов, к которому были применены методы исследования быстрых реакций [3]. Сначала пероксидаза образует с перекисью водорода компекс Михаэлиса, который затем взаимодействует с донором водорода (реакция второго порядка). При достаточно высоких концентрациях донора скорость второй реакции значительно превышает скорость диссоциации комплекса Михаэлиса. [c.114]

Если к 1 > к2, то на первой стадии ферментативной реакции с течением времени устанавливается равновесие (квазиравновесный режим протекания реакции), и в выражение для скорости ферментативной реакции входит уже не константа Михаэлиса, а субстратная константа К , характеризующая взаимодействие фермента с субстратом в равновесных условиях [c.105]

На рис. 51 показаны результаты исследования зависимости скорости ферментативной реакции ЛДГ, связанной с мембранами эритроцитов, от концентрации пирувата натрия при pH 7,4. Кинетические кривые для свободного фермента и комплекса фермент—мембрана подчиняются уравнению Михаэлиса—Ментен. Величина константы Михаэлиса для ЛДГ в растворе равна 0,25 0,02 ммоль/л пирувата, а для мембраносвязанной — 0,б0 0,04 ммоль/л. Максимальная скорость ферментативной реакции при взаимодействии ЛДГ с мембраной эритроцитов снижается в 1,2 раза. Значит, ингибирование фермента происходит за счет увеличения в 2,4 раза константы Михаэлиса для диру-вата натрия. [c.179]

Здесь - константа скорости образования фермент-ингибиторного комплекса аналогична - константе скорости образования комплекса Михаэлиса, к аналогична к J , а к аналогична к 2 Авторы установили, что при взаимодействии ФОИ различного строения с ХЭ меняется только величина к , тогда как величины к и к если и изменяются, то лишь в узких пределах. Сделав допущение, что аналогичные соотношения имеют место и при реакции ХЭ с субстратами, авторы вывели формулу для оценки сродства различных субстратов к ХЭ, Мерой такого сродства они предлагают считать отношение У к, обозначенное ими через г [c.364]

Из рис. 43 видно, что все эти величины (ДС , ДОа, ДС , ДС ), характеризующие свободную энергию фермент-субстратного взаимодействия в различных промежуточных состояниях реакции, линейно зависят от свободной энергии переноса субстратного фрагмента К из воды в органический растворитель (ДО итр) - Поэтому на рис. 44 профиль свободная энергия — координата реакции приведен лишь для крайних членов исследуемого ряда субстратов. При построении диаграммы были сделаны два допущения 1) свободная энергия валовой реакции 5 + Н2О Р1 + РдН — это постоянная величина для всех членов изохимического ряда субстратов и равная приблизительно нулю [116, 117 ] 2)/Ср.н Кз, поскольку константа Михаэлиса в реакциях, катализируемых химотрипсином, слабо зависит от природы уходящей группы (см. табл. 25 и 26) [6, 7, 119]. Проанализируем далее, как изменяется профиль свободная энергия — координата реакции при вариации структуры субстрата. [c.151]

Другими словами, существуют две концепции, с противоположных (на первый взгляд) позиций объясняющие субстратную специфичность лизоцима (в отношении длины цепи олигосахаридных субстратов). Согласно первой концепции, при переходе от длинных олигосахаридов к коротким непропорционально возрастает константа ассоциации последних с ферментом за счет резкого увеличения степени непродуктивного (геометрически неправильного) связывания. В итоге константы ассоциации длинных и коротких олигосахаридов с ферментом оказываются одинаковыми Кт = = 10" М от тримера до гексамера, см. табл. 38), по эффективность каталитической деградации коротких олигосахаридов мала. Согласно второй концепции, ири переходе от коротких олнгоса-харидов к длинным последние пс реализуют потенциальные воз-можр[ости фермент-субстратных взаимодействий п комплексе Михаэлиса (что и приводит к их относнтельпо малым величинам констант ассоциации с активным центром), но полностью реализуют взаимодействия в переходном состоянии ферментативной реакции. Чем выше степень полимеризации субстрата (в пределах активного центра фермента), тем бoльнJe он резервирует возможностей для уменьшения свободной энергии переходного состояния реакции за счет дополнительных взаимодействий (по сравнению с взаимодействиями в комплексе Михаэлиса) и тем выше скорость ферментативного гидролиза. [c.196]

Шульман н сотр. [ИЗ—115] исследовали активный центр карбоксипептидазы А путем измерения релаксации малых молекул, связанных с этим ферментом. Карбоксипептидаза является протео-литическим металлсодержащим ферментом, который катализирует расщепление С-концевой пептидной связи в пептидах и белках. Она имеет молекулярную массу 34600 и содержит 1 атом цинка на молекулу, который обусловливает каталитическую активность, но фермент остается активным при замене 20 + на ионы Мп + или Со2+ [116]. Кристаллическая структура фермента известна [117, 118]. С атомом металла координированы три белковых лиганда, и имеются свободные положения по меньшей мере еще для двух лигандов. Связывание растворителя (НгО) [ИЗ], ингибиторов [114] или фторид-иона [115] на активном центре Мп2+-фермента влияет на релаксацию связанных ядер не только потому, что белок имеет длинное время корреляции, но также вследствие наличия парамагнитного иона металла. Уширение резонансных сигналов растворителя было объяснено тем, что одна молекула воды связывается с ионом Мп2+. Как следует из измерения уширения пиков метильных или метиленовых протонов конкурирующих ингибиторов — индо-лилуксусной, г/7ег-бутилуксусной, бромуксусной и метоюсиуксус-ной кислот — и одновременного определения времен корреляции взаимодействия протонов ингибитора с металлом, релаксация определяется главным образом временем обмена комплекса белок — ингибитор. Используя известные константы Михаэлиса — Ментен и эти данные, можно определить константы скорости всех отдельных стадий реакции фермента с субстратом. [c.393]

Из косвенных методов чаще других используется метод, основанный на изучении рН-зависимости некоторых параметров реакции, таких, например, как максимальная скорость или константа Михаэлиса. Изменение этих параметров в зависимости от pH часто напоминает по своему характеру титрование одной ионизируемой группы (см. гл. VI). Можно поэтому определить соответствующее значение pi a этой группы и попытаться идентифицировать ее путем сравнения полученного значения рЛТ с известным значением p7i для боковых цепей различных аминокислот. Все это сопряжено с известными трудностями. В результате взаимодействия с соседними группами в белке, а также с субстратом или буфером величина pZ для ионизируемой группы в белке может заметно отличаться от соответствующей величины для той же группы, присутствующей в свободном виде в растворе. Кроме того, величины pifa для различных титруемых групп белков в значительной степени перекрываются. Например, группа с pif 10 может быть либо аминогруппой, либо фенольной гидроксильной группой, либо сульфгидрильной группой. В некоторых случаях определение величины A/i ионизации помогает приписать данное значение рЛТ той или иной группе, однако нередко однозначное отнесение полученного значения рЖ к определенной функциональной группе оказывается все же невозможным. Известно также, что рН-зависимость может отражать титрование нескольких остатков, а не какой-либо одной индивидуальной группы. Наконец, крутые перегибы кривых, описывающих зависимость скорости реакции от pH, могут вызываться ие только титрованием, но также и другими факторами, например изменением стадии, лимитирующей скорость реакции. К счастью, все эти ослол<иения возникают не всегда. Часто заключения, сделанные на основании рН-зависимости, удается подкрепить другими методами. Исходя из данных по зависимости максимальной скорости реакции от pH, следует, например, считать, что у всех ферментов, перечисленных в табл. 29, в каталитическом акте участвует остаток гистидина. Для химотрипсина это заключение подтвернодается тем, что соответствующий хлоркетон, являющийся аналогом субстрата химотрипсина, избирательно реагирует с одним остатком гистидина и вызывает таким путем инактивацию фермента. На основании [c.199]

Если экспериментально обнаружено, что вабл зависит от концентрации субстрата, то механизм мономолекулярной инактивации фермента можно исключить из рассмотрения. Так, например, из данных, приведенных на рис. 49, следует, что механизм инактивации арилсульфатазы протекает с участием фермент-субст-рахного комплекса или при бимолекулярном взаимодействии фермента с субстратом, а не через свободную форму фермента. С другой стороны, экспериментальное обнаружение независимости набл от 5о не является однозначным доказательством справедливости механизма I, поскольку такая зависимость может иметь место для механизмов II и III в условиях большого избытка. субстрата по сравнению с константой Михаэлиса. В этих условиях принципиально важным является определение параметров Ут Кт. [c.121]

Установлено, что взаимодействие ЛДГ с F-актином и нативным тонким филаментом приводит к уменьшению каталитической активности фермента. При связывании с F-актином происходит увеличение значения константы Михаэлиса для NADH и уменьшение максимальной скорости реакции. Для свободной и связанной форм ЛДГ выполняется уравнение Михаэлиса — Мен-тен. Предполагают, что обратимое взаимодействие изофермента М ЛДГ с F-актином является специфическим и обусловлено образованием белок-белкового комплекса. [c.174]

Смотреть страницы где упоминается термин Взаимодействие фермента с константа Михаэлиса : [c.119] [c.122] [c.194] [c.228] [c.22] [c.208] [c.486] [c.532] [c.371] [c.240] [c.62] [c.175] [c.179] [c.180] [c.22] [c.169] [c.69] [c.76] [c.92] [c.122] [c.188] [c.279]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология