Мононуклеотиды разделение

В основе метода лежит разделение РНК и ДНК путем гидролиза исследуемого материала слабой щелочью, при котором происходит расщепление РНК по 3, 5 -фосфодиэфирным связям до мононуклеотидов. В этих условиях ДНК устойчива к действию щелочи, что делает возможным выделение ее в виде осадка. [c.164]

РНКаза поджелудочной железы гидролизует фосфодиэфирные связи внутри молекулы одноцепочечной высокополимерной РНК. В результате образуется смесь олиго-, ди- и мононуклеотидов, которые могут быть отделены от фермента и субстрата — высокополимерной РНК — гель-хроматографией на колонке. Разделение рибонуклеотидов, различающихся по числу нуклеотидных звеньев, может быть проведено методом ионообменной хроматографии. [c.176]

Разделение мононуклеотидов анионообменной хроматографией [1505]. [c.294]

Из числа щелочных систем все еще применяются смеси С1 и Сз. Первая особенно пригодна для разделения монофосфатов нуклеозидов, а вторая позволяет разделить соединения даже с большим числом фосфатных групп (от динуклеотидов до олигонуклеотидов, высшие фосфорилированные мононуклеотиды), малоподвижные в системе Сь [c.127]

Нуклеозиды могут быть получены как ферментативным, так и химическим путем из любого встречающегося в природе нуклеотидного материала. Однако главным источником получения этих гли-козидов служат нуклеиновые кислоты, выделяемые из различных тканей и организмов. Расщепление рибонуклеиновой кислоты до смеси входящих в ее состав нуклеозидов может быть достигнуто различными способами, среди которых следует упомянуть гидролиз разбавленным раствором аммиака при повышенной температуре [2], кипячение в течение нескольких дней с водным пиридином [31 и гидролиз, катализируемый ионами различных металлов [4]. Предложенный недавно метод [51 основан на кипячении рибонуклеиновой кислоты (или мононуклеотида) с водным раствором форм-амида в течение нескольких часов при pH 4. Разделение и выделение нуклеозидов было в значительной степени улучшено благодаря использованию ионообменных методов [6]. [c.12]

В течение многих лет результаты трудоемких и весьма грубых анализов нуклеиновой кислоты, проведенных первыми исследователями, указывали, как полагали, на эквимолекулярные отношения двух пуриновых (аденин и гуанин) и двух пиримидиновых (урацил и цитозин) оснований. Позже применение хроматографии на бумаге [222] и, в меньшей степени, ионообменной техники дало быстрые и относительно точные методы количественного определения компонентов рибонуклеиновых кислот. При гидролизе нуклеиновой кислоты щелочью образуются мононуклеотиды, которые могут быть затем разделены либо как таковые, либо в виде нуклеозидов, после дефосфорилирования. Кислотный гидролиз, напротив, дает пуриновые основания и пиримидиновые мононуклеотиды. Спектрофотометрическое определение подвергнутых разделению компонентов после элюирования их с бумаги (с применением электрофореза [223] или хроматографии) или с ионообменной смолы позволяет получать молярные соотношения оснований. [c.404]

Г. Разделение. Величины Rf нуклеотидов . Мононуклеотиды [c.41]

СОЛИ [27]. Однако, судя по опыту авторов этой статьи, метод ступенчатого элюирования вполне обеспечивает разделение мононуклеотидов при хроматографии на ПЭИ-целлюлозе. [c.44]

В литературе описаны попытки использования сефадексов и биогелей, представляющих собой соответственно сшитый декстран и гранулированный полиакриламидный гель, для разделения компонентов нуклеиновых кислот за счет различного сродства их молекул к сорбенту [32, 33]. Однако в основном гель-хроматографию применяют для фракционирования нуклеиновых кислот и их компонентов в соответствии с размерами молекул этих соединений. Например, на колонке с сефадексом 0-10 нуклеозиды и нуклеотиды отделяются от неорганических солей (выходят со свободным объемом колонки) [34]. Аналогичным образом олигонуклеотиды, содержащие больше 10—15 нуклеотидных остатков, не задерживаются на сефадексе 0-25 или 0-50, а мононуклеотиды проникают в поры геля и поэтому элюируются значительно медленнее [3]. Именно этот метод широко используют для удаления избытка нуклеозидтрифосфатов из смеси биосинтетических олиго- и полинуклеотидов [35]. [c.167]

Первым этапом в изучении структуры нуклеиновых кислот является определение их нуклеотидного состава. С этой целью проводят гидролиз нуклеиновых кислот до мононуклеотидов или свободных азотистых оснований последующее разделение продуктов гидролиза производится с помощью хроматографии на бумаге, на ионообменных смолах, посредством электрофореза. [c.384]

Рис. IV.31. Разделение смеси мононуклеотидов на целлюлозе с использованием двумерной тонкослойной хроматографии.

Хроматографическое разделение. На пластинку с ПЭИ-деллюлозой на расстоянии 1,5—2 см от нижнего края и между точками наносят гидролизат РНК и мононуклеотиды- свидетели в количестве 100— 150 нмоль каждого (на тонкие пластинки промышленного изготовления 15—30 нмоль). Восходящую хроматографию проводят сначала в [c.182]

Ионообменные смолы очень удобны для разделения сложных смесей мононуклеотидов и низших олигонуклеотидов. На НСОО -форме этих ионитов при элюировании муравьиной кислотой или раствором формиата аммония удается осуществить очень четкое препаративное разделение компонентов смеси. Кроме крутизны градиента, которую легко регулировать, для хорошего разделения требуется выполнение еще ряда условий. Во-первых, отношение высоты колонки к диаметру должно быть примерно равно 10. Во-вторых, важно, чтобы скорость потока элюента не превышала 0,6 мл-см -мин . Еще одно очевидное требование — исключение из подаваемого в колонку раствора нежелательных анионов (трихлоруксусной кислоты, или —после экстракции хлорной кислотой — иона IO4 ) с тем, чтобы не снизилась емкость колонки, а следовательно, и ее эффективность. Если элюирование ведут муравьиной кислотой, то удалять ее после хроматографического разделения следует выпариванием в мягких условиях (например, в роторном испарителе). Экспериментатору следует помнить о том, что в процессе выпаривания происходит концентрирование в образце муравьиной кислоты, поэтому выпаривание необходимо вести при пониженной температуре. Формиат аммония можно удалить возгонкой при слегка повышенной температуре (до40°С) под вакуумом (масляный насос). Нуклеотиды можно адсорбировать из соединенных фракций на активном угле, масса которого в 5—10 раз должна превышать массу нуклеотида. После [c.327]

Все перечисленные изомеры мононуклеотидов хорошо известны. Смесь 2 - и З -фосфатов образуется при гидролизе рибонуклеиновых кислот наилучшим с препаративной точки зрения является щелочной гидролиз. Как будет подробно рассмотрено ниже, образование смеси 2 - и З -фос-фатов является следствием механизма гидролиза нуклеиновых кислот, и поэтому принципиально невозможно направить этот процесс таким образом, чтобы получить только 2 - или только З -замещенные изомеры. Эти изомеры с чрезвычайной легкостью переходят один в другой, и их разделение стало возможным лишь в последнее время в связи с развитием техники ионообменной хроматографии. [c.215]

Рандерат первым описал анализ методом ХТС нуклеиновых оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов [68—71], а также анализ нуклеотид-полифосфатов и нуклеотид-коферментов [71—73]. По эффективности разделения ХТС на целлюлозе и силикагеле Г превосходит хроматографию на бумаге [69, 70]. При получении хроматограммы на слое целлюлозы и хроматограммы на бумаге при совершенно одинаковых условиях пятна на тонком целлюлозном порошке получаются меньше и более резко очерченными, чем на волокнистой бумаге [71]. Кроме того, для разделения производных нуклеиновых кислот методом ХТС затрачивается меньше времени, чем для разделения методом хроматографии на бумаге [70—72]. [c.442]

Изомерные пуринмононуклеотиды успешно разделяют на слоях целлюлозы по методу Рандерата [71, 73], используя следуюш,ие, предложенные Маркхамом и Смитом [58] растворители. Растворитель насыш,енный водный раствор сульфата аммония — i М цитрат натрия — изопропанол (80 + + 18 + 2) в течение 90 мин поднимается на 10 см (см. рис. 177). Растворитель mpem-амиловый спирт — муравьиная кислота — вода (30 + 20 + 10), впервые описанный Михельсоном [62], также обеспечивает, по Рандерату [71], за 120 мин прекрасное разделение нуклеотидов па целлюлозе. Для разделения мононуклеотидов этот растворитель подходит лучше, чем все другие указанные здесь системы (см. табл. 114). [c.443]

Ионообменная хроматография в колонках со смолой дауэкс привела к открытию и разделению изомерных 2 - и 3 -мононуклеотидов [18]. Таким же образом были найдены и другие новые мононуклеотиды [18, 20, 27, 28]. Смилли [79] фракционировал мононуклеотиды из рибонуклеиновой кислоты на ионообменной бумаге. Он применил целлюлозную бумагу, пропитанную обменником амберлит . [c.446]

Мононуклеотиды и нуклеотидполифосфаты разделяют на слоях эктеола методом ионообменной хроматографии в качестве растворителя пригоден разбавленный водный раствор хлорида натрия (табл. 115 и 117). Как правило, удовлетворительного разделения достигают за 15 мин. Величины Rf нуклеотидов являются функцией концентрации хлорида в растворителе скорость движения нуклеиновых оснований и нуклеозидов не зависит от концентрации хлорида. Это отчетливо видно из рис. 178, который заимствован из работы Рандерата [69]. [c.448]

Разделение мононуклеотидов на эктеола методом ХТС [69] [c.448]

Колоночная хроматография весьма тщательно разработана и позволяет добиться прекрасного разделения однако низкомолекулярные осколки нуклеиновых кислот можно столь же успепшо разделить и методом ХТС на ионообменниках при меньшей затрате труда и времени. Хотя до настоящего времени метод ХТС применяли только для разделения пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов, можно полагать, что на слоях эктеола и ДЭАЭ можно разделить также олигонуклеотиды, анури-новые кислоты и высокомолекулярные рибо- и дезоксирибонуклеиновые кислоты. Этот метод может оказаться пригодным также для анализа углеводных компонентов нуклеиновых кислот (841 (см. стр. 456) — в виде их обратных комплексов (см, [211),—- а также о-фосфорной кислоты и полифос-форных кислот [77] (см. стр. 473). В связи с этим следует отметить анализ методом ХТС птеридинов [63], фармацевтически важных пуриновых и пиримидиновых производных (см. стр. 310) и водорастворимых витаминов (см.стр. 236). Особенно важной является работа Нюрнберга по анализу методом ХТС витаминов группы Ве и амида никотиновой кислоты [64]. [c.451]

При хроматографии на молекулярных ситах мононуклеотиды обычно элюируются в одной зоне. Тем не менее сефадекс G-10 и биогель Р-2 можно использовать для разделения полифосфатов аденозина и тимидина в соответствии с их молекулярными массами (при элюировании формиатным буферным раствором с рн 6 [47]) или, например, при изучении взаимодействия нуклеотидов с ионами металлов [116]. Молекулярные сита успешно применяли при разделении олиготимидиловых кислот и при изучении влияния концевой фосфатной группы на результаты разделения [69, 117]. [c.56]

Программа DINASIN [178] была предназначена для оптимизации синтеза двухспиральной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Для превращения четырех мононуклеотидов (аденина, цитозина, гуанина и тимина) в цепочку ДНК используют три класса реакций защиту мононуклеотидов, простую конденсацию звеньев одной цепи и образование дуплекса. Включив в программу оценку времени, требуемого для реакции разделения и анализа продуктов, Пауерс сосчитал возможную продолжительность полного синтеза аланинового гена, фактически осуществленного в группе Кораны за 20 человеко-лет. Результаты расчета показали, что использование выбранного программой оптимального пути синтеза позволило бы сэкономить 50 % этого времени. [c.52]

Дезоксирибонуклеаза стрептококка (стрептодорназа) также расщепляет межнуклеотидные связи, образуя фрагменты различной длины, несущие на конце 5 -фосфатную группу. При этом получаются главным образом олигодезоксинуклеотиды с длиной цепи более двух нуклеотидов, а также небольшое количество динуклеотидов и следы мононуклеотидов [357]. Анализ этих продуктов указывает на преимущественное расщепление связей ф5 -пиримидин-3 -ф5 -пурин, т. е. действие этого фермента комплементарно действию панкреатической дезоксирибонуклеазы I. Оба эти фермента действуют при одних и тех же условиях pH, требуют присутствия одинаковых ионов металлов и оба являются эндонуклеазами (расщепляют цепь не постепенно, а сразу по всей ее длине) [357]. Присутствующие в каждом случае в гидролизатах следы мононуклеотидов могут представлять собой концевые нуклеотиды цепи ДНК. Не вполне ясно, заключается ли действие всех таких ферментов на нативную двуспиральную дезоксирибонуклеиновую кислоту в расщеплении межнуклеотидных связей с последующим разделением олигонуклеотидных тяжей [358] или, наоборот, в разрыве водородных связей и разделении цепей ДНК, за которым следует гидролиз ковалентных связей. Существуют некоторые данные, показывающие, что на начальных этапах действия дезоксирибонуклеазы гидролизу предшествуют структурные изменения [359]. [c.422]

Дальнейшее развитие ферментативных методов гидролиза позволит подробнее исследовать порядок чередования мономерных звеньев в цепи ДНК и РНК. Панкреатическая РНК-аза расщепляет цепь РНК между рибозой с присоединенным пиримидиновым основанием и впереди идущей фосфорной кислотой. Гидролизат содержит при этом немного мономерных единиц п значительные количества димеров, тримеров и тетрамеров. Разделение гидролизата РНК производится на DEAE-целлюлозе с элюцией солевым градиентом. Хроматография ди- и тримеров оказывается весьма эффективной. Количества мононуклеотидов и динуклеотидов каждого типа не сильно отличаются от ожидаемых по теории вероятности, если, зная концентрацию каждого тина мономеров в цени и считая их расположение случайньш, рассчитать выход каждого типа двойников после разрыва цепочки около всех пири-мидинов. На три- и тетрамерах уже обнаруживаются сильнейшие Отступления от статистики. Так, например, тринуклеотид АГЦ встречается в РНК из дрожжей в 2,5 раза чаще, чем ГАЦ. Подобные изомерные полинуклеотиды встречались бы одинаково часто, если бы звенья распределялись в цени по закону случая. [c.247]

Фиг. 7. Разделение npoflyitTon гидролиза тРНК на целлюлозе (схема). Описание дано в тексте. тРНК гидролизовали панкреатической РЫК-азой. Каждый нуклеотидный остаток в олигонуклеотиде обозначен первой буквой тривиального названия мононуклеотида. ф — псевдоуридиловая кислота.

Разделение мононуклеотидов. Четыре основных рибо- или дезокси-рибонуклеотида разделяются при pH 3,5, например, в 0,05 М аммоиии-формиатном буфере, за счет различий л значениях р1С NH2-гpyпн. (табл. 3). кислот. Нри этом значении pH разделяются 2 - и З -изомеры Гф. [c.53]

ЮЩИМ электрофоретическим разделением продуктов. Этот метод онреде-ления последовательности применяется после частичного гидролиза олигонуклеотидов фосфодиэстеразой из селезенки — ферментом, который последовательно отщепляет З -мононуклеотиды с 5 -конца фосфорнлнро- [c.66]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология