Полиакриламидный гель приготовление

Фиг. 10. Прибор для приготовления полиакриламидного геля (описание см. в тексте).

Большое распространение получил электрофорез в тонких слоях для разделения высокомолекулярных веществ на различных носителях, особенно на агаровом, крахмальном и полиакриламидном гелях. Благодаря замечательной разделительной способности этот метод нашел применение прежде всего в клинической биохимии. Напомним, что в подавляющем большинстве случаев разделение с помощью этого метода осуществляется на носителях, приготовленных в форме геля. Опыт, накопленный в области хроматографии в тонких слоях, показал, однако, что для разделения некоторых групп веществ, в первую очередь низкомолекулярных, можно с успехом применять и суспензии некоторых сорбентов. [c.160]

Приготовление сыворотки мышей, содержащих TNF, заключалось во введении внутривенно 2> 10 ВСО -через 14 дней вводилось также внутривенно 25 мкг эндотоксина, 2 ч спустя мыши обескровливались. Сыворотки накапливались и сохранялись. 20—30-кратная очистка TNF достигалась в несколько стадий, а именно 1) фракционирование при помощи сульфата аммония 2) гель-фильтрация на сефадексе Г — 100 3) гельфильтрация на сефадексе Г — 200 4) электрофорез на полиакриламидном геле препарата и его отдельной части (полосы). [c.185]

ОЧИСТКА ВЕЩЕСТВ. ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ [c.91]

Приготовление пробы. Обычно препаративный электрофорез в полиакриламидном геле не используют в качестве одного из начальных этапов в очистке белков и нуклеиновых кислот. Для предварительного грубого фракционирования компонентов омесей применяют методы хроматографии, высаливания или осаждения. Чтобы провести электрофоретическое разделение, пробу необходимо сконцентрировать до 5 мл для однородной системы и до 10—20 мл для неоднородной. От избытка солей можно избавиться при помощи диализа или гель-фильтрации. Концентрация солей в исследуемом растворе должна быть такой же, как в буфере концентрирующего геля. Если же этот гель не попользуется, то пробу диализуют против буфера разделяющего геля, разведенного в 5 раз. Медленное вхождение пробы в гель во время электрофореза свидетельствует о слишком высокой концентрации солей. Любой осадок, присутствующий в пробе, следует удалять центрифугированием или фильтрованием через миллипоровый фильтр, так как он может закупорить разделяющий гель. [c.117]

Если гели помещают прямо на стеклянную пластинку, очень важно удалить из-под них все пузырьки воздуха. Со столбиками геля возникает еще одна проблема между стеклянной пластинкой и цилиндрической поверхностью геля часто образуется тонкая пленка жидкости, которая в свою очередь приводит к появлению линии, приблизительно параллельной оси столбика геля. Чтобы решить эту проблему, Паттерсон и Филлипс [979] создали простое приспособление для фотографирования столбиков полиакриламидного геля. Оно представляет собой ряд полукруглых лотков, вырезанных в плоской пластине из органического стекла. Поскольку гели, приготовленные в трубках с внутренним диаметром 5 мм, в процессе окрашивания и обесцвечивания [c.197]

Описаны приемы локализации протеолитической активности после электрофореза в крахмальном [655, 1120] и полиакриламидном гелях [57] с использованием методики включения субстрата в гель. Возможность применения этой методики для указанной цели была недавно изучена [37]. Чтобы предотвратить миграцию белкового субстрата вовремя электрофореза, эти авторы использовали в качестве субстрата казеин, осажденный кислотой. Нерастворимый казеин обрабатывали ультразвуком и образовавшиеся мельчайшие частицы смешивали с гелеобразующим раствором. Конечная концентрация казеина в геле составляла 0,1% (масса/объем). После электрофореза гель инкубировали в течение 2—12 ч при 37°С в 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,5). Казеин пригоден только при электрофорезе в кислой среде, поскольку в щелочной среде он мигрирует. В этом случае вместо казеина можно использовать препарат гемоглобина, приготовленный путем осаждения и обработки ультразвуком. Окрашивание гелей белковым красителем (напри-, мер, нигрозином) увеличивало контрастность полос. [c.303]

Определенные трудности возникают в процессе приготовления и работы с гелями, имеющими низкую ко нцентрацию акриламида. Разбавленные гели полиакриламида способны настолько прочно связываться со стеклянными стенками, что их невозможно извлечь без повреждений. Поэтому рекомендуется использовать пластмассовые трубки (из плексигласа или перспекса) [777]. В этом случае приходится применять приспособление, поддерживающее гель снизу, для предотвращения его выскальзывания из трубки. С этой целью перед заполнением трубки гелеобразующим раствором ее нижнее отверстие закрывают кружками фильтровальной бумаги, ацетата целлюлозы, нитроцеллюлозного фильтра или полупроницаемой мембраны с помощью резинового или пластмассового кольца, надетого на нижний конец трубки. Таким образом обеспечивается электропроводимость. Можно также применять пробку из более концентрированного полиакриламидного геля. [c.371]

В комбинированных гелях, приготовленных одним из описанных выше способов [984], агароза содержится в такой концентрации, которая достаточна лишь для поддержания формы полиакриламидного геля. Таким образом, разделение нуклеиновых кислот в комбинированном геле зависит в основном от свойств полиакриламидного геля как молекулярного сита. Соответственно нуклеиновые кислоты имеют близкие электрофоретические подвижности в комбинированном и чисто полиакриламидном гелях. [c.381]

Так как цитоплазма представляет собой совокупность органелл и молекул различных размеров, представлялось целесообразным смоделировать некоторые отдельные компоненты цитоплазмы путем приготовления различных водных растворов. Необходимо было продемонстрировать наглядность анализа параметров растворенного вещества (с помощью исследования подвижности спин-метки в растворах), таких, как размер молекул, их форма, концентрация и поверхностные свойства. В соответствии с поставленными задачами мы обсудим только некоторые из них. Такого рода параметры могли быть продемонстрированы путем исследования поведения спин-меток в концентрированных растворах сахарозы и в полиакриламидном геле. Одни молекулы (сахароза) — небольшие, хорошо растворимые в воде молекулы, другие, например полиакриламида,— линейные полимеры, образующие гель при комнатной температуре. Анализ молекулярной подвижности в этих двух средах оказался не таким простым , как казался на первый взгляд. В растворах сахарозы до 70 %-ной концентрации это можно было сделать легко. Приготовить растворы более высокой концентрации и тотчас же измерять в них молекуляр- [c.309]

Б. Приготовление 5%-ного полиакриламидного геля [c.122]

Готовят разделяющий гель (предварительно проверяют буфер В (pH 8,8)). На две пластинки нужно 15 мл. Например, для приготовления 12,5% полиакриламидного геля нужно взять [c.69]

Гель-электрофорез, Электрофорез в полиакриламидном меряют колориметрически с реагентом Фолина [22] для построения градуировочного графика используют растворы, приготовленные из кристаллического бычьего сывороточного альбумина. Если белковый образец содержит тритон Х-100 к анализируемой пробе добавляют додецилсульфат натрия [23. [c.152]

Чоулес и Цимм [227] предложили еще один способ разрушения структуры геля. Они заменили бмс-акриламид на этилен-диакрилат полиакриламидные гели, приготовленные с этим сшивающим агентом, хорошо растворяются в щелочной среде. Кусочки геля встряхивают в течение 3—4 ч при 37 °С в плотно закрытых флаконах, содержащих по 0,5 мл смеси пиперидин — спиртовой раствор гиамина (9 1). Если растворение идет медленно, то следует добавить к смеси еще 0,1 мл пиперидина. Радиоактивность определяют в растворе Кинарда [676] с эффективностью 10% для Н. [c.210]

Приготовление геля. Фракционирование РНК проводят в 2,2%-ном полиакриламидном геле (поскольку полиакриламидный гель данной концентрации имеет полужидкую консистенцию, рекомендуется сначала сделать пробку из геля более высокой концентрации или 1%-ной агарозы трубки можно закрыть снизу целлофановой пленкой). К смеси 2,2 г акриламида и 0,12 г метиленбисакриламида добавляют 33 мл трис-ацетатного буфера pH 7,8, 50 мл прокипяченной Н2О, 0,075 мл ТЕМЕД, 16 мл 0,5%-ного раствора персульфата аммония. Смесь осторожно перемешивают и заливают для полимеризации в кассету или трубочки электрофоретической камеры (с. 94). Сверху наслаивают трис-ацетатный буфер, разведенный в 3 раза (электродный буфер). [c.173]

Поскольку выделение продуктов реакции из микробиологической ферментационной среды иногда затруднено, желательно упрощение системы с сохранением ее окисляющей способности. Необходимость превращения вещества S Рейхштейна в гидрокортизон стимулировала исследования в двух направлениях. Первое — это приготовление бесклеточной ферментной системы, полученной из urvularia lunata, которая способна катализировать 11р-гидроксилирование. Для того чтобы получить воспроизводимые результаты с помощью этого метода, необходимо точно соблюдать условия [39а]. Второе — включение клеток мицелия С. lunata в полиакриламидный гель, в котором клетки задерживаются, а субстрат и продукт реакции могут свободно проходить через поры [396]. Гель готовят в гранулированной форме, и его легко отделить от водной среды. При оптимальных условиях с помощью этого метода можно трансформировать 2 мг/ч субстрата на 1 г сухого полимера при одной загрузке. Насколько такой препарат сохраняет ферментативную активность, неизвестно, но, по-видимому, эти гранулы можно несколько раз реактивировать [396]. [c.15]

С появлением новых сильно набухающих гелей пришлось отказаться от хроматографирования в восходящем направлении поэтому в дальнейшем основное внимание будет уделено методике с нисходящим движением элюента. Вскоре эта методика была разработана применительно к сефадексам 0-100 и 0-200 [7—10]. В этом случае для приготовления суспензии целесообразно использовать сверхтонкий сефадекс с размером частиц 10—40 мкм. На гелях с более крупными частицами разрешение гораздо ниже, поэтому оправданы попытки увеличить разрешение, используя гели с размером частиц менее 20 мкм. Радола [66] с успехом применяет для этой цели полиакриламидные гели (биогели Р-60 и Р-300 с размером частиц 400 меш.). [c.257]

Для приготовления геля использовали мономеры, перекри-сталлизованные по Ленингу [19]. Ранее применявшиеся методики для приготовления растворов были немного изменены авторами согласно рекомендациям Нейхоффа [5] (см. разд. 7.2.1). Основное отличие заключалось в том, что при приготовлении 25%-ного полиакриламидного геля авторы добавляли 0,5%-ный [c.281]

Раствор Е. К 200 мг (NH4)2S20s добавляют 5 мл 2%-ного Тритона Х-100 и разбавляют водой до общего объема 10 мл. Приготовление. К одному мл смеси (0,5 мл раствора А и 1,5 мл раствора В) добавляют 1,0 мл раствора Г, получая 20%-ный раствор. К нему добавляют 100 мг акриламида, 10 мг гидан-тоина, в результате чего получают 25%-ный полиакриламидный гель. [c.282]

Данный метод основан на предположении, что разделение белков в полиакриламидном геле зависит не только от заряда, но в значительной степени и от размера молекул. Установлено соотношение между электрофоретической подвижностью и молекулярным весом различных белков. Сравнение подвижности исследуемой полипептидной цепи с подвижностями белков-маркеров дает молекулярный вес этой цепи. Кроме того, электрофоретическая подвижность зависит от количества метилен-бисакриламида, взятого для приготовления геля. Например, подвижность фумаразы (Л150 000) изменяется от 0,28 до 0,63 [c.419]

Иммобилизации фермента уреазы посвящено лишь несколько работ. Самнер и Грехем [443, 444] получили ферментативно активную нерастворимую в воде уреазу, добавляя небольшие количества хлористого натрия в нейтральный раствор уреазы в 30%-ном спирте. Водонерастворимый продукт, вероятно, состоит из молекул уреазы, связанных цепочками дисульфидов этот продукт удалось охарактеризовать лишь частично. Ризель и Качальски [445] сообщили о методе приготовления и свойствах водонерастворимых продуктов уреазы, полученных в результате химического связывания, уреазы диазоти-рованным сополимером и-амино-оь-фенилаланина с г-лейцином. Берн-фельд и Ван [446], а также Хикс и Апдайк [448] продемонстрировали возможность, иммобилизации ферментов в полиакриламидном геле. [c.153]

Было также описано [41] приготовление полиакриламидного геля, который содержит в качестве сшивающего агента Ы,Н -диаллилтартратдиамид (ДАТД) вместо метиленбисакриламида. Такой гель растворяется в 2%-ной йодной кислоте за 20—30 мин при комнатной температуре. Радиоактивность полученного раствора можно измерять, применяя смешивающийся с водой жидкий сцинтиллятор, причем, как было показано в работе [42], очень хорошая эффективность регистрации достигается при использовании сцинтиллятора, содержащего 25% тритона Х-114 в ксилоле. [c.144]

В работах [199—202] описано приготовление полиакриламидного геля с градиентом по размеру пор, предназначенного для молекулярно-ситового электрофореза. Марголис и Ригли [203] также приготавливали полиакриламидный гель с градиентом по размеру пор, в котором содержание поперечных связей повышалось с увеличением концентрации геля. Благодаря этому устранялось влияние различия зарядов при определении молекулярных масс компонентов. [c.161]

При гель-фильтрации разделение происходит по размерам молекул. Чаще всего для этой цели используются декстрановые гели (сефадексы) с различной степенью сшивки. От числа поперечных связей зависит размер пор в геле. (Приготовление хроматографических пластинок с сефадексом описано в разд. 6 гл. III.) Недавно Хьертен [221] разработал для гель-фильтрации сшитые полиакриламидные гели, и в настоящее время ряд марок полиакриламидных шариков с различной пористостью выпускает фирма Bio-Rad Laboratories. Молекулярно-ситовые эффекты (гель-фильтрация) наблюдаются также и при хроматографировании на силикагелях, особенно если предварительно смочить адсорбент элюентом [222—225]. [c.162]

При приготовлении тонких слоев полиакриламидных гелей их можно заливать в промежуток между двумя стеклянными пластинками, разделенными подходящей прокладкой. Боур [399] силанизировал одну из пластинок, чтобы избежать прилипания геля. Силанизирование проводилось одним из следующих двух методов [c.174]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

Метод включения клеток в полиакриламидный гель (ПААГ) используется уже более 20 лет. В первых работах он рекомендовался как универсальный для многих микроорганизмов. Имеющиеся сейчас экспериментальные данные свидетельствуют о наличии отрицательного воздействия акриловых мономеров и в еще большей степени самого процесса полимеризации на жизнеспо-собнось и ферментативную активность многих микроорганизмов. Поэтому в ряде случаев ПААГ заменяют Са-альгинатным гелем, каррагинаном и другими носителями. С другой стороны, следует отметить и преимущества геля простота приготовления, относительная дешевизна, возможность включения клеток любого размера и заданное их количество, прочность фиксации клеток, прочность гранул на стирание и разрыв (свойство, необходимое для реакторов с перемешиванием). Уменьшить набухание геля можно путем его армирования каким-либо неорганическим носителем. [c.224]

Приготовление пробы. По мнению Дэвиса [281], включение исследуемой пробы в стартовый гель препятствует тепловой конвекции диффузии веществ, что приводит к более эффективному разделению. Однако некоторые белки повреждаются в результате полимеризации геля [1407] или под действием флуоресценции [975]. Кроме того, белки могут подавлять полимеризацию геля [570]. Если есть подозрение, что флуоресценция или персульфат (см. ниже) приводят к возникновению артефактов, вместо стартового геля желательно использовать суспензию сефадекса 0-200, гл1ицв рин, сахарозу или мочевину. В то же время эти материалы сам и способны при определенных условиях стать причиной артефактов. Так, сефадекс 0-200 может задерж1И1вать движение белков [173], а сахароза — взаимодействовать с 8-аминогруппой лизина [455] или боратом с образованием отрицательно заряженного комплекса. Поэтому присутствие сахарозы в боратном буфере может привести к эффекту усеченного конуса и боковому распространению белков в процессе электрофореза [759]. С другой стороны, мочевина вызывает диссоциацию белков на субъединицы, препятствует затвердению агарозы в агарозно-полиакриламидных гелях [574] и влияет на активность водородных ионов. [c.97]

Полиакриламидные гели низкой концентрации, применяемые при изучении, например, нуклеиновых кислот или нуклеопротеидных частиц, обладают низкой механической прочностью. Для ее повышения предложено вводить в гель агарозу [984, 1324]. Способы приготовления составных и полиакриламидных гелей практически не отличаются друг от друга. Очищенную агарозу растворяют в воде при нагревании в колбе с обратным холодильником. Полученный раствор, в котором концентрация агарозы должна быть в два раза выше, чем ее конечная концент- [c.101]

Приготовление полиакриламидного геля описано в разделе, посвященном аналитическому электрофорезу. Важмо отметить, что дегазирование раствора акриламида до добавления к нему персульфата необходимо выполнять особенно тщательно, так как наличие пузырьков в геле нарушает условия проведения электрофореза. Полимеризация геля долж на происходить при той же температуре, при которой будет проводиться разделение. Для получения узких зон нужно, чтобы поверхность геля была совершенно гладкой, поэтому воду на раствор акриламида наслаивают как можно аккуратнее. Есл же для внесения пробы используют канавку, то ее формируют при помощи специального шаблона [320]. Готовый гель выдерживают до употребления не менее 1 ч или, что еще лучше, оставляют на ночь. Для удаления несущих заряд примесей и непрореагировавших Б процессе полимеризации реактивов рекомендуется проводить в течение 1 ч преэлектрофорез. [c.117]

Выявление белков с помощью флуориметрии. Полиакриламидный гель флуоресцирует при длинах волн возбуждающего света 280 или 340 нм. Близкие длины волн возбуждают флуоресценцию соответственно нативных белков (максимум испускания 340 нм) и белков, меченных дансилхлоридом или 8-анилино-1-нафталинсерной кислотой (АНС спектр испускания при 460—520 нм). И хотя максимум спектра флуоресценции геля находится при 415 нм, т. е, довольно далеко от максимального испускания флуоресценции как нативных, так и меченых белков, его широкая полоса в значительной степени перекрывает спектры флуоресценции белков. Для приготовления нефлуоресцирующего геля необходимо добавить к смеси мономеров ди-тиотреитол или заменить ТЕМЭД сульфитом [463]. [c.183]

Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос (см. разд. 1.12.2). Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Йохансон и йертен [631], а также Вейс и др. [1392]. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при pH 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом pH была близка к нулю. [c.255]

Амилазную активность после электрофореза в полиакриламидном геле иногда выявляют с помощью метода индикатор ного геля. Гели помещают на пластину крахмала, приготовлен ную из 4%-ного гидролизованного крахмала в буферном раС творе, состоящем из 0,02 М борной кислоты и 0,01 М NaOH [668]. Затем гели инкубируют при 37 °С 15—30 мин (если для разделения панкреатических ферментов используют катионную систему) или 0,5—5 мин (в случае анионной системы). После инкубации крахмальную пластинку фиксируют и обрабатывают йодной кислотой и реактивом Шиффа. [c.297]

Выделение чистой культуры. Чистую культуру можно вьщелить, используя твердую агаризованную среду 9К [168, 176]. Однако, лучше использовать гелевые пластинки, пропитанные средой Летена (№1) или средой 9К (№2) [22, 143] или. плотные среды, приготовленные на полиакриламидном геле. На плотных средах появляются мелкие колонии рыжевато-коричневого цвета. [c.52]

При приготовлении твердых сред для культивирования хемолитоавтотрофных ацидофильных бактерий к жидким средам добавляют отмытый агар, агарозу. Используют также гелевые пластинки или пластинки из полиакриламидного геля. [c.72]

Если необходимо получить меченые вирусоспецифические РНК из зараженных клеток (а не из вирионов), заражение клеток и внесение метки осуществляют, как описано выше, и затем на нужном сроке инфекции из зараженных клеток выделяют РНК. Для разделения сегментов РНК вируса гриппа удобно использовать 6%-ный полиакриламидный гель с 6 М мочевиной, приготовленный на буфере ТВЕ [30]. В этой системе 3 больших сегмента генома (1—3) комигрируют (см. рис. 6.7). Для их разделения используют систему электрофореза в геле с низкой концентрацией акриламида, описанную Ленингом [31]. [c.195]

По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и E oR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и ВЬе I [c.155]

Подобно крахмальному и акриламидному агаровый гель является очень мягким носителем в отличие от электрофореза на бумаге при нем не происходит инактивации белков, что позволяет определять активность отдельных фракций бeлкОДJieпo peд твeннo в геле после проведения электрофореза. Приготовление агарового геля значительно проще, чем крахмального или полиакриламидного, продолжительность электрофореза составляет I—4 ч. [c.92]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология