Изоэлектрическое осаждение

Однако для белков такое соотношение не обязательно выполняется, поскольку они могут связывать и другие, помимо протонов, ионы, которые вносят вклад в общий баланс зарядов (при условии нейтральности молекулы белка). Можно ожидать, что белки в изоэлектрической точке обладают меньшей растворимостью, чем при меньших или больших значениях pH, и это действительно имеет место. Поскольку в изоэлектрической точке молекула белка не обладает избыточным зарядом, в этих условиях белок легче агрегирует и осаждается. Далее, поскольку аминокислотный состав разных белков различен, для каждого белка существует характеристическое значение р/е. Это свойство является основой метода очистки белков путем изоэлектрического осаждения (осаждения в изоэлектрических условиях) pH смеси белков доводится до значения, равного значению р/ искомого белка, так что последний осаждается из смеси. Значение р/г аминокислот с нейтральной боковой цепью равно 5,6 0,5 для аминокислот, содержащих кислые группы, р/ ниже, а для аминокислот с основными группами в боковых цепях — выше. В то же время для белков р/ может меняться от О до И. Вывод формул для расчета р/ аминокислот имеется в большинстве учебников биохимии. [c.32]

Осаждение (изоэлектрическое осаждение, осаждение растворителем, осаждение солями) Противоточное распределение Распределительная хроматография Диализ и ультрафильтрация [c.347]

Тепловая коагуляция. Регенерация растворимых белков посредством изоэлектрического осаждения не является полной. В частности, альбумины могут оставаться в растворе. Для белков, которые от природы растворимы (преимущественно белки листьев и клубней у растений, белки крови у животных), один из способов регенерации состоит в коагуляции под действием тепла. Действительно, за пределами определенного порога температуры белки денатурируются (они теряют свои функциональные свойства растворимости, ферментативную активность и т. п.) и образуют осадок. Это осаждение позволяет выделять их из водной среды, в которой остаются в растворенном состоянии растворимые продукты (углеводы, минеральные соединения). Как и при применении осаждений, следует уточнить оптимальное значение рн, которое необходимо обеспечить, помимо тепловой обработки. [c.427]

Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспартата и глутамата, имеющими при нейтральном и щелочных значениях pH отрицательный заряд, и остатками лизина и аргинина, имеющими при слабоосновных и тем более при нейтральном и кислых pH положительный заряд. По мере повышения pH заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке (см. 3.1) оказывается равным нулю. Вблизи этой области белок оказывается лишенным ионной атмосферы и его молекулы могут беспрепятственно сближаться до радиуса действия ван-дер-ваальсова притяжения. В ряде случаев это приводит к выпадению белка в осадок. Такой способ выделения белков из раствора называют изоэлектрическим осаждением. [c.234]

Применение изоэлектрического осаждения. Исследователи из Техасского университета (США) точно установили условия применения одного такого процесса для семян сои [67], подсолнечника и арахиса. [c.455]

Маточные растворы после перекристаллизации из воды и маточный раствор после изоэлектрического осаждения, содержащий сульфат натрия, соединяют вместе, нагревают приблизительно до 60° и осаждают ацетатом меди. Медную соль фенил- [c.549]

При очистке фермента оптимальным считают центрифугирование, при котором получают плотный осадок и прозрачную надосадочную жидкость для этого можно пойти на увеличение времени центрифугирования. Осадки, полученные высаливанием, изоэлектрическим осаждением, осаждением в органических растворителях и другими методами, описанными в гл. 3, обычно центрифугируют при 15 ООО в течение 110 мин или при 5000 г в течение 30 мин. Следует отметить, что при работе с малыми объемами центрифугирование при 5000 в течение 30 мин может дать удовлетворительные результаты, если расстояние от мениска до дна пробирки равно 5 см. При работе же с большими объемами, когда это расстояние может достигать 20 см, 30 мин иногда недостаточно. Выше указаны лишь приблизительные величины g, так как при данной скорости вращения д возрастает по мере оседания частиц. Однако, если говорить не о величине а о скорости вращения и, из уравнения (1.1) следует, что время осаждения зависит не от абсолютной длины пути осаждаемой частицы, а от логарифма соотношения Хь и Xt. Эта величина лишь незначительно варьирует в разных центрифугах. Поэтому центрифугирование при 5000 об/мин в течение 30 мин дает сходные результаты во всех центрифугах. [c.16]

Растворимость белков типа глобулинов уменьшается по мере снижения концентрации соли. Это свойство редко используется при работе с грубым экстрактом, так как двукратного снижения концентрации соли можно легко добиться только при добавлении равного объема воды. Если же растворимость не удается снизить более, чем в два раза, никакого осадка не образуется. Однако это свойство может быть полезным (хотя иногда и создает неудобства) на дальнейших этапах очистки, когда обессоливание проводят посредством диализа или гель-фильтрации. При диализе против буфера с низкой ионной силой в диализном мешке может образоваться осадок. Если этот осадок содержит большую, часть нужного фермента или, наоборот, не содержит его, то достигается определенная степень очистки. Осадок отделяют центрифугированием. Однако в процессе гель-фильтрации могут возникнуть неприятности из-за изоэлектрического осаждения белка в колонке. Агрегаты могут забить ко- [c.59]

Большая часть осадков, полученных изоэлектрическим осаждением, представляет собой агрегаты разных белков, в состав которых могут входить фрагменты органелл и комплексы белков с нуклеиновыми кислотами. Если исходный состав раствора меняется, выделяемый фермент в отсутствие его партнеров по осаждению будет иметь уже другую растворимость. Изоэлектрическое осаждение обычно происходит при значениях pH ниже физиологического. Поэтому следует убедиться, что фер- [c.60]

Подводя итог всему сказанному выше, следует отметить, что область всаливания может быть использована в процессе очистки двумя способами. Во-первых, агрегация может происходить при разведении и диализе, и, если нужный фермент присутствует в агрегате, очистка будет эффективной. Во-вторых, можно применять изоэлектрическое осаждение, используя изменение растворимости в зависимости от pH при постоянной ионной силе. В любой из этих двух ситуаций степень достигнутой очистки обычно оказывается минимальной, если нужный фермент остается в растворе, так как при этом в осадок выпадает чаще всего лишь относительно незначительная часть всего белка. В этом случае достигается только осветление экстракта (разд. 2.3). [c.61]

Для фракционирования белковых смесей, находящихся в растворе, широкое применение получили методы дробного осаждения, основанные на изменении растворимости белков в присутствии растворов солей и органических растворителей. При фракционировании солями чаще всего используют сернокислый аммоний, позволяющий создавать высокую ионную силу раствора при низкой температуре, а из органических растворителей — этиловый спирт и ацетон. На различиях в растворимости белков основано и изоэлектрическое осаждение, достигаемое за счет минимальной растворимости глобулярных белков в изоэлектричес-кой точке. В последние годы для фракционирования белков все чаще находят применение центрифугирование, избирательная адсорбция, различные виды хроматографии и электрофореза. [c.88]

Как правило, pH изолята доводят приблизительно до 7, чтобы pH порошка, вновь переведенного в суспензию после сушки, был нейтральным и чтобы обеспечить максимально возможную растворимость белков. Нейтрализованные таким способом продукты называются протеинатами по сходству с казеинатами, получаемыми из казеина.. Концентрированную суспензию нейтрализуют растворами ЫаОН или КОН, реже Са(ОН)2, поскольку она имеет тенденцию снижать растворимость белков. Из-за очень высокой вязкости смеси затруднена гомогенизация и снижается эффективность регулирования pH (вследствие загрязнения электродов). В отличие от этих нейтрализованных продукты, получаемые только изоэлектрическим осаждением, иногда называются изоэлектрическими изолятами, их pH близки к 5. [c.449]

Эти изоляты обеднены а-галактозидами ввиду того, что они тщательно промыты после изоэлектрического осаждения [45]. С другой стороны, антипитательные вещества белковой природы (антитрипсиновый фактор и гемагглютенины) находятся приблизительно в такой же концентрации, как и в исходной муке из гороха и конских бобов, а также в продуктах промыщленного изготовления из сои [161]. [c.464]

Шрот рапса. Кривые растворимости и осаждения белков рапса показывают, что выработка изолята путем солюбилизации в щелочной среде с последующим изоэлектрическим осаждением возможна лишь при низком выходе продукции. Так, проводились [61] последовательные экстракции в водной среде снача- [c.467]

Основная причина агрегации белков заключается, вероятно, в электростатических и вандерваальсовых силах, сходных с силами, действующими при высаливании белков в отсутствие органического растворителя. Гидрофобные взаимодействия имеют здесь меньшее значение из-за солюбилизирующего влияния органических растворителей на неполярные участки белковой глобулы. Было установлено, что вблизи изоэлектрической точки белков осаждение происходит при более низкой концентрации органического растворителя. Это подтверждает предположение о том, что агрегация, происходящая в данном случае, сходна с агрегацией, наблюдающейся при изоэлектрическом осаждении белков. На рис. 3.9 схематически изображены молекулы белков в смеси воды с органическим растворителем агрегация здесь происходит за счет взаимодействий между противоположно заряженными участками на поверхности белков. [c.74]

Для выделения аминокислот используют различные методические приемы — изоэлектрическое осаждение, выделение в виде солей, сложных эфиров, хлоргидратов, солей сульфокислот, электродиализ, ионофорез. Широкое применение получили методы осаждения аргинина в виде флавианата, глутаминовой кислоты — в виде хлоргидрата, аспарагиновой кислоты — в форме тригидрата медной соли, метионина — в виде ртутного комплекса [116, 494—496]. [c.91]

Изоэлектрическое осаждение. Поскольку растворимость большинства белков вблизи их изоэлектрической точки оказывается минимальной, можно подобрать такое значение pH, при котором нужный белок выпадет в осадок, а болыиинство загрязняющих белков останется в растворе. [c.80]

Изоэлектрическое осаждение. Во многих методах очистки так или иначе используется снижение растворимости белков при pH, близком к значению изоэлектрической точки. Так, например, завершающий этап метода очистки по Штраубу одного из мышечных белков — актина — состоит в доведении pH водного экстракта до 4,7, т. е. до значения изоэлектрической точки актина. Этого оказывается достаточно для полного выпадения в осадок актина, практически свободного от примесей. Ряд белков в кристаллическом состоянии, в том числе сывороточный и яичный альбумин, получают, постепенно повышая концентрацию солей в белковых растворах, приведенных к изоточке. [c.18]

Адренокортикотропные гормоны. Точно так же, как образование стероидных гормонов половых желез контролируется белковыми гормонами передней доли гипофиза, образование и выделение стероидных гормонов коры надпочечников контролируется одним из гормонов передней доли гипофиза — адренокортикотропиым гормоном (АСТН) или кортико-тропином Уже давно было сделано наблюдение, что удаление гипофиза вызывает атрофию коркового слоя надпочечников, а такл(е, что сырые экстракты передней доли гипофиза оказывают действие, до некоторой степени сходное с де11ствием коры надпочечников, и могут поддерживать или восстанавливать функцию коры надпочечников после удаления гипофиза. На основании этого наблюдения было сделано предположение, что между деятельностью обеих желез существует взаимная связь. В настоящее время чистый гормон выделен путем фракционированного высаливания и изоэлектрического осаждения . Этот гормон представляет собой протеин с изоэлектрической точкой около 4,6—4,8 его молекулярный вес равен приблизительно 20 000. Введение этого гормона нормальным крысам оказывает такое же влияние на углеводный обмен, как и введение 17-оксикортикостерона До сих пор еще не вполне ясно, влияет ли этот белковый гормон также и на минеральный обмен. После введения его нормальной женщине было отмечена увеличенное выделение стероидов мочи. [c.451]

Теперь рассмотрим различные типы экстрактов. При работе с некоторыми животными тканями частицы составляют незначительную часть экстракта и ими можно пренебречь. Они агрегируют, скажем, при первом же фракционировании сульфатом аммония и затем удаляются. С другой стороны, есть животные ткани, содержащие больше жиров и мембранных структур при экстрагировании таких тканей образуются суспензии. Подкисление среды до pH 6,0—5,0 обычно приводит к агрегации материала, который можно затем отцентрифугировать при относительно низкой скорости. Рибосомы и другие нуклеопротеиды обычно удаляются при подкислении, которое можно рассматривать как одну из форм изоэлектрического осаждения (разд. 3.2) фосфатные группы протонируются и нейтрализуют или по крайней мере снижают заряд частиц суспензии. Этот способ дает очень хорошие результаты при условии, что нужный фермент г) не осаждается изоэлектрически при данном значении pH, б) не адсорбируется на образовавшемся осадке или в) остается стабильным при нефизиологических значениях pH. Экстракт охлаждают и снижают pH соответствующей кислотой (например, 1 М уксусной, разд. 6.1). После перемешивания в течение 10—20 мин осадок отделяют центрифугированием, а pH надосадочной жидкости доводят, если необходимо, до нужного значения перед тем, как приступить к первому этапу фракционирования. Растительные ткани отличаются прежде всего тем, что реакция среды в них более кислая и содержащиеся в них частицы, такие, как фрагменты хлоропластов, агрегируют значительно труднее. К тому же растительные экстракты содержат сравнительно мало корпускулярного материала, если не считать грубых частиц типа зерен крахмала, которые легко осаждаются после приготовления экстракта. [c.49]

Типичным примером выделения мембраносвязанного фермента без использования детергентов служит получение АТР-азно-ю комплекса из митохондрий сердца быка [21]. Прежде всего выделяют митохондрии с помощью метода, дающего наибольший выход. Затем для высвобождения белков матрикса митохондрии обрабатывают ультразвуком. Значение pH доводят до 9,2 в присутствии ЭДТА и снова проводят озвучивание, после чего большая часть мембранных белков митохондрий переходит в раствор. Активную водорастворимую АТР-азу выделяют из полученного раствора изоэлектрическим осаждением (разд. 3.2) и хроматографированием на ДЭАЭ-сефадексе (разд. 4.3). [c.53]

Первоначально белки классифицировали в зависимости от их растворимости, и, хотя сейчас эта классификация в основном уже забыта, соответствующие названия до сих пор используют, когда речь идет о сывороточном альбумине или иммуноглобулинах. Глобулинами называли белки, нерастворимые при низких концентрациях соли в растворе сывороточные глобулины можно осадить, просто разводя сыворотку водой, при этом альбумины остаются в растворе. Поведение глобулинов — пример изоэлектрического осаждения белков в области всалива-ния (разд. 3.2). Однако эта классификация порождает путаницу, так как некоторые белки нерастворимы при pH 6, на растворимы при pH 8 и более низкой концентрации соли. Тем не менее существуют белки, которые по своим свойствам полностью соответствуют глобулинам. Это обычно белки с низкой растворимостью в водной среде, несущие на своей поверхности значительное число гидрофобных аминокислотных остатков. И наоборот, есть много истинных альбуминов, хорошо растворимых в воде и характеризующихся низкой гидрофобностью. [c.56]

Изоэлектрическое осаждение белков с низкой растворимостью можно усилить введением в раствор вещества, снижающего растворимость белка. Осадок можно получить, добавляя в раствор органические растворители или полиэтиленгликоль и одновременно изменяя значение pH (разд. 3.4 и 3.5). Примером использования такого метода служит очистка фосфофруктоки-назы дрожжей [17]. [c.60]

Если при доведении pH требуется большая точность, то темпе ратура во время приготовления буфера может иметь очень существенное значение. Часто в описаниях методов очистки ферментов констатируется, что все процедуры выполнялись при 4 °С между тем, вероятнее всего, используемые буферы смешивались при комнатной темпе1ратуре, так что истинное значение pH при 4 °С было совсем другим. Большинство рН-мет-ров имеет устройство для температурной компенсации, но это не означает, что если прибор установлен на 4°, а работа прово-ди ся при 25 °С, то будет сделана правильная компенсация — прибор ведь не может знать, какая величина dfpKJdT соответствует данному раствору. Для приготовления буфера при 4°С (обычная температура холодной комнаты) необходимо установить компенсатор температуры на 4 °С, поместить электрод в стандартный буфер при 4°С, дать ему охладиться до этой температуры и снять показания прибора при стандартной величине 4 °С. Затем нужно довести буфер, белковый раствор или другой рабочий раствор до желаемой величины pH при 4 °С. В некоторых методах, использующих изоэлектрическое осаждение в присутствии холодного органического растворителя, pH следует доводить щри температуре +2°С и его величина должна быть установлена с точностью 0,1 единицы. Единственно надежный способ выполнить эти условия — поступить так, как описано выше. Между прочим, изменение pH в присутствии органического растворителя — это еще один фактор, влияющий на величины рКа (см. разд. 3.4). [c.249]

Структура антител. Белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам, так как состоят из протеина и сахаров построены из 18 аминокислот. Имеют видовые отличия, связанные главным образом с набором аминокислот. Молекулярная масса иммуноглобулинов находится в пределах 150—900 кД. Их молекулы имеют цилиндрическую форму, они видны в электронном микроскопе. До 80 % иммуноглобулинов имеют константу седиментации 7S устойчивы к слабым кислотам, щелочам, нагреванию до 60 °С. Вьщелить иммуноглобулины из сыворотки крови можно физическими и химическими методами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммунобиологических препаратов. [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология