Реакции иммуноферментного анализ

Рис. 22. Принципиальные схемы гомогенных методов иммуноферментного анализа а—Г — свободный гаптен Е—Г — меченный ферментом гаптен АЬ — антитела 5 н Р — субстрат н продукт ферментативной реакции б — Ag—5 — меченный субстратом антиген Ag — свободный антиген Е — фермент Р — продукт ферментативной реакции символ х — ингибирование ферментативной реакции

Рис. 11-2. Схема реакций, протекающих при гомогенном флуоресцентном иммуноферментном анализе с применением антител, меченных ферментом.

Хемилюминесцентные методы иммуноферментного анализа. Использование катализаторов в качестве маркеров в люминесцентном иммуноанализе является наиболее перспективным направлением, поскольку относительно катализатора реакции квантовый выход гораздо выше, чем относительно субстрата, и, следовательно, этот подход принципиально позволяет повысить чувствительность метода. [c.133]

ИФА. Иммуноферментный анализ относится к числу наиболее чувствительных и специфических методов серологического исследования при паразитозах. Метод с успехом применяется для диагностики эхинококкоза, альвеококкоза, трихинеллеза, токсока-роза, описторхоза, фасциолеза, шистосомоза Мансона. В перспективе — применение этой реакции при филяриатозах. [c.386]

Антигены, меченные субстратами и кофакторами, также нашли применение в гомогенных методах иммуноферментного анализа. Сущность этих методов (уравнения 6, 7, 8) заключается в том, что при взаимодействии меченого антигена с антителами субстрат становится не доступным для действия фермента, в результате чего продукт ферментативной реакции не накапливается в системе (рис. 22, б) [c.115]

Созданы и применяются в производстве высокочувствительные диагностические препараты на основе метода ИФА (иммуноферментного анализа), ДНК-зондов, внедрения полимеразной цепной реакции (ПЦР).Используются моноклональные антитела, полученные методом гибридомной технологии. Получены генетически трансформированные кролики с геном асРНК, устойчивые к вирусам лейкоза, а также трансгенные кролики с геном альфа-2 интерферона. Разработана рекомбинантная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота на основе оспененного вектора. На культуре клеток нарабатывается антиген и производится диагностика лейкоза крупного рогатого скота. Генно-инженерные вакцины против ящура и сибирской язвы производятся в объемах, обеспечивающих потребности в них России, стран СНГ и ряда других государств мира. [c.428]

Экспериментальные методы определения ферментативной активности. В иммуноферментном анализе наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. [c.59]

Регистрируемой величиной в иммуноферментном анализе является концентрация продукта ферментативной реакции. Скорость его образования пропорциональна каталитической активности в системе и определяется по изменению какого-либо ее параметра [c.233]

Иммуноферментный анализ. Метод широко внедрен в лабораторную практику в последнее время. В основе метода— использование антител, меченных ферментами (чаще всего пероксидазой). Конъюгацию осуществляют глутаровым альдегидом или другим бифункциональным реагентом. Реакцию проводят в условиях, исключающих инактивацию фермента. Техника постановки реакции состоит в следующем. Антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола. Если антитела, меченные ферментом, направлены к адсорбированному антигену, они окажутся фиксированными в лунках. Затем в лунки вносят раствор субстрата (если к антителам присоединена пероксидаза, то это перекись водорода и индикатор — диаминобензидин). В результате ферментативного превращения субстрата появится цветной продукт. Степень окраски пропорциональна количеству сорбированных антител с ферментом. [c.263]

Особое распространение получили методы, основанные на использовании антигенов и антител, меченных ферментами, — так называемый иммунофермеитный анализ. Они используются для изучения широкого круга соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, различных белков и ферментов. Существуют гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы иммуноферментного анализа, принципиально различающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител или антигенов, иммобилизованных на нерастворимых носителях. [c.306]

Методы иммуноферментного анализа с помощью индикаторных полосок полностью удовлетворяют этим требованиям, пригодны для использования вне лаборатории и, что особенно важно, могут применяться с различными хромогенными субстратами. ферментные метки в отличие от флуоресцентных и радиоактивных легко детектировать по продуктам катализируемых ими реакций. Это делают визуально или с помощью простых портативных приборов. Очевидно, что индикаторные полоски — очень удобные матрицы для реагентов, позволяющие упростить обработку образцов и разделение компонентов реакционной смеси. [c.130]

Использование флуориметрии в сочетании с иммуноферментным анализом представляет собой простую модификацию существующих методов. Нет сомнений, что этот метод получит более широкое распространение, если в продажу будут поступать соответствующие приборы. Повышение эффективности регистрации продукта ферментативной реакции само по себе не компенсирует все прочие лимитирующие факторы ИФА, такие, [c.295]

Использование кислородного электрода Кларка для детектирования потери или образования кислорода в ферментативной реакции стало интересным шагом в развитии иммуноферментного анализа. В качестве ферментных меток чаще всего используют глюкозооксидазу и каталазу. [c.58]

Для использования сэндвич-гибридизации в зонд нужно ввести спехщальные группы, обладающие высоким сродством к вспомогательному белку, несущему метку. Как и в иммуноферментном анализе, с этой целью часто используют биотин. Его легко присоединить к олигонуклеотидам или ввести в молекулу ДНК мягкой обработкой зонда. Например, небольшое число цитозиновых остатков можно превратить в производные, несущие алифатическую аминогруппу. С этой целью зонд обрабатывается этилендиамином или гексаметилен диамином в присутствии бисульфита натрия в соответствии с реакцией [c.262]

Большое внимание уделено экспресс-диагностике инфекционных болезней и новейшим методам иммуно- и генодиагностики, которые начинают широко применяться в лабораторной практике. Среди них иммуноферментный анализ, иммуноэлектронная микроскопия, реакция иммунофлюоресценции, радиоиммуноло- [c.5]

При наличии гибридов производят смену среды Дальбекко (без аминоптерина) в течение последующих 14 дней и, наконец, добавляют минимальную модифицированную среду Дальбекко. После этого следует скрининг (от англ. s reen — решето, хфосеивать) гибридных клеток по образованию антител, используя серологические реакции, радиоиммунный, иммунофлуоресцентный или иммуноферментный анализ. Более чувствительный из них радиоиммунный метод. [c.576]

Иммобилизованные ферменты применяют для автоматического анализа биологических субстратов и лекарственных веществ как покрытые электроды (электрохимические датчики, на которые нанесен слой иммобилизованного фермента) в методах сухой химии (слои реагентов и ферментов, при прохождении через которые происходит реакция и образуется окрашенное вещество). 2. Иммуноферментный анализ используют для определения природных лекарственных веществ и ксенобиотиков. Суть его в том, что молекула фермента, соединенная с антигеном или антителом, служит индикатором реакции антиген - антитело в среде. Измеряя активность фермента, можно сказать, сколько молекул антигена вступило в иммунохими-ческую реакцию с антителом. 3. Биотехнология лекарственных препаратов предполагает использование иммобилизованных ферментов в синтезе лекарств. За счет специфичности ферментов в оптималь- [c.478]

Интересные возможности были обнаружены при использовании ферментов для повышения чувствительности иммунохими-ческих методов анализа. Сущность любого иммунохимического анализа сводится к тому, чтобы после завершения реакции антиген-антитело определить концентрацию избыточного компонента (антигена или антитела), не вступившего в реакцию. Поскольку эти концентрации очень невысоки (10 — 10 моль/л), для их обнаружения обычно применяют легко детектируемую метку радиоактивным атомом, вводимым в один из компонентов (радиоактивный иод, тритий). Оказалось, что без потери чувствительности метода радиоактивная метка может быть заменена присоединением фермента, который после реакции обнаруживается по его каталитической активности. Накоплен достаточный материал по применению этого нового метода, получившего название иммуноферментный анализ (ИФА). С помощью ИФА могут быть детектированы любые вещества, обладающие свойствами антигенов и, естественно, многочисленные возбудители заболеваний человека, животных, растений. Многие из этих методов могут быть приспособлены к автоматическому режиму слежения, что важно для решения задач экологии, контроля технологических производств и т. д. [c.17]

На практике при проведении ферментативной реакции на последней стадии иммуноферментного анализа обычно измеряют не скорость ферментативной реакции, а оптическую плотность или флуоресценцию продукта через определенный фиксированный промежуток времени. Для того чтобы такое измерение было эквивалентно определению скорости реакции, необходимо, чтобы кинетические зависимости накопления продукта реакции от времени имели вид прямых во всем временном диапазоне. В таком случае оптическая плотность раствора (или интенсивность флуоресценции продукта реакции), измеренная через фиксированный интервал времени после начала ферментативной реакции, будет реально отражать концентрацию фермента в системе. Так как скорость реакции, согласно уравнению (4.7), сильно зависит от концентрации субстрата, проводить ее следует на такую глубину, чтобы можно было пренебречь расходованием субстрата в ходе ферментативной реакции (т. е. выполнялось условие [SJo onst), В противном случае ввиду уменьшения концентрации субстрата в системе скорость ферментативной реакции будет постепенно падать, а следовательно, измеряемая через фиксированный промежуток времени оптическая плотность не будёт отражать истинную концентрацию фермента в растворе. [c.62]

Биолюминесцентный иммуноферментный анализ (БИФА). В этой группе методов можно выделить методы, основанные на использовании в качестве меток люцифераз (светляков и бактерий) и методы с маркерами — ферментами, участвующими в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами. В табл. 4.6 приведены имеющиеся модификации БИФА ряда антигенов. [c.129]

В литературе описано большое количество модификаций иммуноанализа с маркерами, детектируемыми в хемилюминесцентных реакциях. Классификация их, как правило, осуществляется в соответствии с типом метки. Маркером в методах хемилюминес-центного иммуноферментного анализа (ХИФА) является катализатор-фермент, в методах хемилюминесцеИтного иммуносубстрат-ного анализа (ХИСА) — молекулы субстратов. [c.133]

В качестве метки в иммуноферментном анализе широко применяют пероксидазу хрена, методы получения и стабилизации конъюгатов с которой хорошо изучены. Пероксидазу хрена чаще всего определяют колориметрически, но для этой цели можно также использовать различные хеми- и биолюминесцентные реакции (см. табл. 12.1). [c.168]

Высокая массчувствительность (доли нанограмма) определяет интерес к использованию пьезокварцевых резонаторов в качестве своеобразных микровесов в научных исследованиях (например, для изучения начальных стадий химических реакций, адсорбции, фазовых переходов, происходящих на поверхности, в качестве детекторов в ГХ и ВЭЖХ, в иммуноферментном анализе). [c.472]

ЛИТЬ по образованию продуктов катализируемой им реакции. Большинство используемых ферментных меток способно за 1 мин при обычных температуре и давлении превращать в продукты 10 молекул субстрата в расчете на одну молекулу фермента. Каталитическая эффективность фермента сильно зависит от его трехмерной структуры (конформации), Пространственная структура фермента, как и любого белка, поддерживается многочисленными нековалентными взаимодействиями, такими, как гидрофобные и водородные связи, ионные контакты, а также ковалентными дисульфидными связями. Трехмерная структура фермента обеспечивает близкое соседство определенных аминокислотных остатков в положениях, наиболее выгодных для осуществления катализа. Нековалентные химические связи непрочны и легко разрушаются или ослабляются под влиянием тепловой энергии или дополнительных нековалентных взаимодействий, возникающих, например, при связывании ионов, хао-тропных агентов, детергентов, липидов и т. д. Известно, что присоединение к ферменту другой молекулы (скажем, аллосте-рического эффектора) в области, удаленной от активного центра (т. е. каталитического центра), может вызвать конформацион-ную перестройку, изменяющую пространственное расположение аминокислотных остатков в этом центре. Изменения в некова- лентных взаимодействиях, приводящие к новой, необычной конформации фермента, способны существенно повлиять на каталитическую активность. Подобная конформационная гибкость становится одной из помех при использовании фермента в качестве метки. Однако эта же гибкость полезна для разработки иммуноферментного анализа без разделения компонентов, основанного на вызываемых антителами изменениях в конформации конъюгата [лиганд — фермент]. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в их молекулах многочисленных функциональных групп (аминогрупп, сульфгидрильных, карбоксильных, карбамоильных, остатков тирозина), через которые можно ковалентно присоединять молекулы лигандов. [c.12]

Берд и Вонг (Burd, Wong, 1977, 1979) разработали иммуноферментный анализ без разделения компонентов, основанный на использовании связанных с лигандом флуорогенных субстратов. В этом методе (рис. 2-4) производное лиганда ковалентно соединяют с флуорогенным субстратом фермента, получая прочный конъюгат [субстрат — лиганд (С—Л)], который конкурирует с определяемым веществом за имеющиеся в ограниченной концентрации антитела к Л. В результате по реакциям I и II образуются Л Ат и С—Л Ат. Когда в растворе нет определяемого вещества Л, конъюгат С—Л связывается с антителами против Л при этом индикаторная реакция III не идет, так как связанный с антителами конъюгат С—Л Ат в отличие от свободного С—Л не является субстратом фермента. Однако при увеличении концентрации Л количество свободного С—Л, чувствительного к ферменту, будет возрастать и, следовательно, по реакции III будет образовываться большее количество продуктов. Таким образом, конъюгат [флуорогенный субстрат — лиганд (С—Л)] играет двойную роль а) как аналог лиганда С—Л успешно конкурирует за связывание с антителами к лиганду б) как эффективный аналог субстрата С—Л участвует в индикаторной реакции III с образованием продуктов. [c.17]

FAD С образованием каталитически активного ко 1плекса ДНФ—АпоГО FAD (реакция IIJ). Таким образом, количество продуктов, выделяющихся в реакции IV, пропорционально количеству определяемого вещества. Данные, приведенные на рис. 7-4—7-5, свидетельствуют о появлении нового метода иммуноферментного анализа без разделения компонентов (гомогенного метода). [c.102]

Очевидно, что неинструментальные количественные методы очень удобны в тех случаях, когда решающее значение приобретают портативность оборудования и скорость определения. Этим требованиям не удовлетворяет большинство методов иммуноферментного анализа, в которых иммуноспецифический сигнал связан с активностью ферментной метки. Поскольку ферментативные реакции зависят от времени и температуры, методы, основанные на измерении активности, обычно требуют специальной калибровки, точного контроля времени и температуры. Все это в совокупности с трудностью визуального определения малых изменений поглощения или отражения неизбежно приводит к использованию довольно сложных приборов. [c.149]

Иммуноферментный анализ (ИФА) оказался жизнеспособной альтернативой уже заслужившим признание радиоиммунологическим методам. Поскольку он достаточно дешев, отличается высокой устойчивостью реагентов, чувствительностью и быстротой, в продаже появились специальные наборы для определения веш.еств с помощью ИФА (Мопгое, 1984). В большинстве вариантов ИФА за ходом- индикаторной ферментативной реакции следят по изменению окраски. При использовании флуоресцентной системы детектирования методы ИФА становятся еще более чувствительными и избирательными и в то же время остаются простыми, быстрыми и дешевыми (Kelly, hristian, [c.162]

Методика иммуноферментного анализа. Смешивают в стеклянных пробирках (16X100 мм) по 20 мкл стандартных растворов или образцов плазмы с 30 мкл буфера А. Осторожно перемешав, прогревают растворы в кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения добавляют 0,4 мл буфера Б и 0,1 мл раствора конъюгата. Растворы перемешивают и добавляют 0,1 мл антисыворотки против кортизола в разведении 1 500 (конечное разведение 1 3000) и инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин. После добавления 100 мкл нормальной сыворотки кролика, разведенной в 40 раз, приливают 100 мкл раствора козьих антител против иммуноглобулинов кролика. Смесь перемешивают на вортексе, инкубируют 2 ч при 4°С, затем центрифугируют 10 мин при 2000 g. Осадок дважды промывают буфером Б, Активность фермента в осадке определяют с использованием в качестве субстрата о-нитрофенил-p-D-галактоз и да. Время инкубации при измерении ферментативной активности 1 ч. Количество образовавшегося к концу реакции о-нитрофенола определяют спектрофотометрически при 420 нм. [c.268]

Пероксидаза хрена и специфические антитела против нее (Ан-тиПХ) широко используются в иммуноферментном анализе [Им-муноферментный. .., 1988 Ким, 1989] и иммуноцитохимии [По-лак, Ван Норден, 1987]. Способов использования пероксидазных реакций в аналитических целях в настоящее время накопилось очень много. Однако особый интерес вызывают способы анализа [c.50]

К счастью, потенциометрические методы иммуноферментного анализа не обязательно являются гетерогенными по своей сути. Гомогенные методы удобнее, чем гетерогенные, так как включают меньшее число операций. Фононг и Рехнитц [6] описали метод гомогенного потенциометрического иммуноферментного анализа для человеческого иммуноглобулина О с использованием СО2-электрода. В этом методе получают конъюгат IgG, меченный ферментом, и затем ингибируют активность последнего, связывая конъюгат с антителами к IgG. Используемая ферментная метка, хлоропероксидаза, несколько необычна. Это гем-содержащий фермент, который катализирует ряд реакций галогенирования органических молекул в присутствии пероксида водорода и соответствующего галогенида, например бромирования (3-кетоадипиновой кислоты. Этот процесс сопровождается образованием СО2, что и используют в данном аналитическом методе [c.62]

По чувствительности и селективности амперометрическое детектирование вполне оответствует требованиям иммуноанализа. Этот вопрос обсуждается в опубликован-юм недавно обзоре [34], Прямое электрохимическое определение антитела обычно возможно, поэтому к антителу или антигену (гаптену) пришивают электрохимически ктивную метку. Чаще, однако, в иммуноферментном анализе находят активность )ермента, определяя концентрацию в растворе электроактивного продукта катализи- уемой ферментом реакции. Поскольку в расчете на один моль фермента может случаться за разумное время по меньшей мере моль продукта, имеет место [c.145]