Полипептиды расщепление специфическое

Окисленная рибонуклеаза. Действие химотрипсина на рибонуклеазу менее специфично, чем действие на этот субстрат трипсина. Об этом свидетельствуют более низкие выходы полипептидов при разделении гидролизата методом ионообменной хроматографии [154]. В выделенных полипептидах установлено наличие 151 аминокислотного остатка, в то время как в полипептидах, полученных в результате расщепления трипсином, обнаружено всего 124 остатка. По-видимому, это объясняется тем, что некоторые участки полипептидной цепи появляются более чем в одном из пептидных обломков. О более сложном составе гидролизата можно судить по небольшим количествам примесей (как правило, не выше 15%), присутствующих в большинстве основных фракций. Эти примеси не мешали определению аминокислотного состава фракций, но их присутствие еще раз подчеркивает трудности, которые встречаются при фракционировании смесей пептидов, полученных менее специфическими методами гидролиза. Гидролизаты рибонуклеазы были получены инкубированием в течение 24 час с ферментом при pH 7. При более кратковременном инкубировании гидролизат содержал дополнительно [c.204]

Даже при специфическом ферментативном или химическом расщеплении белка или полипептида среднего молекулярного веса получается довольно сложная смесь пептидов. Существует набор разнообразных методических приемов фракционирования этой смеси и очистки отдельных компонентов. Вряд ли можно предложить какую-то одну схему фракционирования, которая была бы равным образом применима ко всем белковым гидролизатам. Первым этапом обычно является предварительное фракционирование в соответствии с зарядом или размером пептидов. За ним следует уже окончательная очистка пептидов с помощью электрофореза, ионообменной или иной хроматографической процедуры. [c.37]

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты под действием протеолитических ферментов. Трипсин и химотрипсин-это специфические ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление полипептидов в определенных местах их цепи (табл. 6-6). Ниже приведена последовательность В-цепи полипептидного гормона инсулина. Учтите, что цистиновый поперечный мостик между А- и В-цепями уже разорван под действием надмуравьиной кислоты (см. рис. 6-12). [c.162]

СПЕЦИФИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ [c.90]

Для определения аминокислотной последовательности в длинных поли-пептидных цепях требуется специфически расщепить полипептид, т. е. расщепить его в немногих определенных точках и получить фрагменты, содержащие по нескольку аминокислот. Очень важно, чтобы расщепление было строго специфичным, так как необходимо быть уверенным в том, что число образующихся индивидуальных пептидов невелико, а их количества достаточны для дальнейшего исследования. Специфичность расщепления обеспечивает также и воспроизводимость результатов. Для специфического расщепления пептидных цепей часто применяют протеолитические ферменты — трипсин, химотрипсин и пепсин. [c.90]

Фосфолипиды, находящиеся на внутренней стороне плазматической мембраны тромбоцитов, экспонируются в результате индуцированного коллагеном разрушения и дегрануляции тромбоцитов. Эти фосфолипиды связывают ионы Са + и протромбин (последний, по N-концевой области, содержащей остатки Gla). Тромбоциты содержат также фактор V, который в активированной форме (VJ соединяется со специфическими рецепторами на мембране тромбоцитов (рис. 55.9). Фактор служит рецептором для фактора Хз, который в свою очередь связывает протромбин в области F-1-2 (рис. 55.8). Фактор Х также является сериновой протеазой, он расщепляет каталитически неактивную молекулу протромбина в областях, указанных на рис. 55.8. При этом высвобождается N-концевая часть протромбина. В результате расщепления тромбина фактором Х образуются полипептиды тромбина А и В, связанные дисульфидным мостиком. [c.327]

Таблица 22. Специфическое расщепление полипептидов

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

По другому методу цистиновые межцепочечные мостики окисляются бромом или бромной водой, что также приводит к образованию сульфогрупп. В случае цистина выход цистеи новой кислоты количественный. Однако при попытках окислить цистин инсулина й папаина бромом без предварительного частичного гидролиза продукты окисления были получены с невысокими выходами [316]. Для повышения степени заг вершенности окисления белки предварительно можно подвергать денатурации или восстановлению. Из окситоцина — одного Из низших полипептидов, при окислении бромной водой образуется цистеиновая кислота с хорошим выходом одновременно наблюдается специфическое расщепление тиро-зилизолейциновой связи (см. ниже раздел Бромная вода). [c.171]

Специфический протеолиз — удобный процесс для образования сложных белковых структур. Во многих случаях белки модифицируются путем расщепления одной или нескольких пептидных связей. Для обозначения этого типа катализируемых ферментами реакций, которые играют доминирующую роль во многих физиологических процессах [137—139], используются термины ограниченный протеолиз или специфический протеолиз (табл. 4.2). Хорошо известными примерами специфического расщепления полипептидов являются активация предшественников пищеварительных ферментов, морфогенетические процессы в бактериальных вирусах и каскадные процессы коагуляции и комплементного действия крови [138, 140]. Недавно было показано, что механизмы посттрансля-ционного расщепления имеют место также при образовании таких разных белков, как инсулин, коллаген и специфичные белки вирусов. Кроме того, высокоспецифичное протеолитическое расщепление ферментов важно при инактивации и активации специфических внутриклеточных ферментов (табл. 4.2). [c.72]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Специфическое химическое рсхш пление пептидных связей можно осуществить с помощью двух окисляющих агентов. Один из них, Ы-бромсукцинимид, вызывает расщепление пептидной связи, в которой участвует остаток триптофана, с одновременным разрушением этого остатка и его окислением [64]. Успешное использование этого метода удалось лишь в нескольких случаях. Помимо изучения структуры полипептида, выделенного из вируса табачной мозаики, Ы-бромсукцинимид был использован при анализе последовательности низкомолекулярного глюкагона [58 и М-кон-цевой последовательности гемоглобина [79]. Существенный недостаток этого метода заключается в том,что М-бромсукцинимид расщепляет не все пептидные связи, образуемые остатками триптофана. [c.36]

С другой стороны, известны ферменты, которые проявляют относительно широкую специфичность и взаимодействуют со многими веществами, имеющими общие структурные особенности Например, химотрипсин катализирует гидролиз многих пептидов и полипептидов, но разрывает только те пептидные связи, в которых карбонильная группа принадлежит остаткам фенилаланина, тирозина или триптофана (табл. 6-6). Несколько иная ситуация имеет место в случае кишечной фосфатазы, катализирующей гидролиз самых разных эфиров фосфорной кислоты, хотя скорости их расщепления сильно различаются. Изучение субстратной специфичности ферментов привело к возникновению идеи о комплемен-тарности молекулы субстрата й специфического участка на поверхности молекулы фермента, когорые лодходят друг к другу, как ключ к замку. К этому участ- [c.241]

Синтез пептидов, содержащих фенилаланин, не представляет особых трудностей (см., например, [774, 775, 1114, 2368]). Фенилаланин наряду с глицином и аланином является именно той стандартной аминокислотой, на которой проверяли новые защитные группы, методы синтеза пептидов и степень рацемизации. С этой целью часто используют bo-Gly-L-Phe-Gly-OEt (см. главу X, А, 1, б). Фенилаланинсодержащие пептиды также неоднократно синтезировали для изучения специфического расщепления амидной связи фенилаланил—аминоацил химотрип-сином. Фенилаланин очень часто встречается в природных биологически активных полипептидах. Интересно, что о-изомер также входит в состав многих пептидных антибиотиков. Пептиды, содержащие один остаток фенилаланина, поглощают в ультрафиолетовой области с е=187 это иногда облегчает определение молекулярного веса пептидов [2389, 2393]. [c.194]

Денатурация является весьма характерным свойством белков и представляет собой сложное явление, в основе которого лежит изменение вторичной, третичной и четвертичной структур белковой молекулы. Известно, что синтетические и природные полипептиды не подвергаются денатурации. Полимерные углеводы и другие высокомолекулярные вещества также не обладают способностью к денатурации. Отсюда следует, что ни макромолекулярность, ни химический состав не являются достаточными для объяснения этого свойства белков. Все известные данные указывают, что денатурация белка представляет собой внутримолекулярную перегруппировку, не связанную с расщеплением пептидных связей, в результате которой утрачиваются уникальное пространственное расположение и форма полипептидных цепочек при этом теряется, как правило, специфическая биологическая активность данного белка. К денатурации не относятся ни процессы, связанные с гидролитическим (протеолитическим) расщеплением пептидных связей, ни многие другие обратимые и необратимые изменения белка, если они обусловлены реакциями отдельных группировок и не затрагивают белковую молекулу в целом (например, взаимодействие с многими ионами, включение некотсфых органических заместителей и др.). [c.183]

Важнейшим типом специфического активирования является образование активной формы некоторых ферментов, главным образом протеолитических, из недеятельных проферментов. Этот процесс обычно состоит в отщеплении от белковой молекулы профермента (зимогена) — полипептида, маскирующего каталитически активный участок молекулы. Расщепление проферментов в большинстве случаев производится особыми ферментами — киназами. В качестве наиболее изученных из них можно назвать энтерокиназу кишечного сока, активирующую неактивный трипсиноген, который после отщепления гексапептида переходит в активный фермент трипсин. Профермент тромбокиназа крови активирует протромбин, который переходит в активный тромбин, участвующий в свертывании крови. В других случаях проферменты расщепляются обычными протеазами хемотрипсиноген активируется трипсином. Активация пепсиногена в кислой среде происходит автокаталитически под действием образующегося пепсина. [c.244]

Реакция фенилизотиоцианата с аминогруппами белков очень похожа на соответствующую реакцию изоцианатов. Было найдено, что фенил-изотиоцианат можно применять для определения содержания аминных концевых групп в белках и последовательности аминокислот в полипептидах и белках в последнем случае проводят постадийное расщепление с аминного конца молекулы. Метод основан на специфической реакционной способности фенилизотиоцианата, который в среде пиридина реагирует с концевыми аминогруппами, образуя фенилтиокарбамилпептиды (ФТК-пептиды). Эти производные при нагревании с безводным хлористым водородом в среде нитрометана легко перегруппировываются, образуя фенил-тиогидантоин N-концевого аминокислотного остатка исходного белка. При нагревании со щелочью фенилтиогидантоин расщепляется, образуя свободную аминокислоту, которую можно идентифицировать, например. [c.370]

Гены различных полипептидных межклеточных медиаторов обычно кодируют белки длиной несколько сотен аминокислот, а пептидные медиаторы образуются из них в результате посттрансляцион-ного процессинга. Они могут состоять всего из пяти аминокисло , как, например, два энкефалина, которые действуют на клетки мозга аналогично природным опиатам и регулируют перистальтику кишечника (табл. 1V.3). Обычно продукт трансляции генов всех белков, предназначенных для секреции, содержит N-концевой сигнальный пептид, который в процессе прохождения полипептида в эндоплазматический ретикулум отщепляется (рис. IV. 10). Как правило, остающаяся часть полипептида гликозили-рована. Затем в результате протеолитического расщепления в специфических сайтах из длинного предшественника образуется один или несколько активных пептидных медиаторов. Например, белок из 263 аминокислот, называемый пре-про-энкефалин А, кодируется у млекопитающих единственным геном, и из него образуются шесть молекул те1-энкефа-лина и одна-1еи-энкефалина. [c.357]