Кинетическая кривая для ферментативной

Рис. 9.9. Кинетика ферментативной реакции а—кинетическая кривая субстрата б — скорость убыли субстрата

Если проводить изучение инактивации фермента в фермент-субстратном комплексе в условиях избытка субстрата ([S] Ks), то анализ, всего лишь одной кинетической кривой ферментативной реакции [c.257]

Рис. . Типичные кинетические кривые ферментативного гидролиза, сопровождающегося мутаротацией первичного продукта Р в Р

Преимущества этого метода перед другими состоят в следующем при его применении сохраняется постоянное значение pH и, следовательно, нет опасности изменения активности фермента вследствие изменений его ионизации метод сразу дает постоянную по большому числу точек кинетическую кривую, позволяющую рассчитывать необходимые кинетические константы ферментативной реакции метод позволяет измерять кинетику процесса практически при любых условиях расход времени на измерение скорости реакции весьма невелик при условиях нулевого порядка реакции обычно бывает достаточно проводить титрование в течение 3— 4 мин., зафиксировав 8—10 точек расхода щелочи метод может быть использован для исследования кинетики взаимодействия холинэстераз с ингибиторами. [c.149]

Полученные значения констант Михаэлиса и максимальных скоростей реакций для исходного и промежуточных олигомеров ввели в математическую модель действия глюкоамилазы и с помощью ЭВМ получили кинетические кривые накопления глюкозы прн гидролизе мальтодекстринов (рис. 2). Теоретические кривые близки по характеру к экспериментальным. Отличие заключается в том, что в них не отражается ингибирование продуктами реакции (поскольку ингибирование не вводилось в математическую модель). Тем не менее обработка теоретических кривых в рамках интегральной формы уравнения скорости (рис. 3), которая обычно проводится при анализе кинетических кривых простых ферментативных реакций [21], свидетельствует о наличии сильного ингибирования продуктами реакции в данной системе. На это указывают положительные угловые коэффициенты соответствующих прямых в известных координатах [Р]/ 1//1п ([5]о/[8]а — [Р]) для различных начальных концентраций исходного субстрата (рис. 3) >. [c.32]

Предложить аналитический метод определения константы Михаэлиса, исходя из уравнения касательной к кинетической кривой в начальный момент времени и интегральной формы уравнения кинетической кривой ферментативной реакции. [c.175]

Видно, что при I =0 I = В принципе чем больше членов содержит уравнение подобного типа, тем лучше можно описать кинетическую кривую. Однако на практике при анализе кинетических кривых ферментативной реакции оказывается, что почти вся необходимая информация содержится в первых трех или четырех "членах уравнения (8.13) члены с коэффициентом Р4 и т. д. по порядку величины близки к случайной ошибке. Следовательно, "члены, содержащие в степени выше 3, брать не следует, во многих задачах для достаточно полного описания кривой вполне хватает предыдущих членов (см. [91]). [c.208]

В том случае, когда в распоряжении экспериментатора имеется полная кинетическая кривая (рис. 101), более удобным представляется метод обработки, в котором вместо абсолютных значений параметров реакции (начальной концентрации субстрата, начального времени реакции, абсолютной концентрации продукта реакции и т. д.) используются относительные величины [23]. Это значительно повышает точность результатов эксперимента. Рассмотрим в качестве примера кинетическую кривую накопления продукта ферментативной реакции, удовлетворяющую уравнению (6.134). Откладываемая на оси ординат величина О может соответствовать различным характеристикам системы, которые удобны для прямого измерения (величина оптической плотности количество щелочи, идущей на титрование продукта реакции проводимость раствора и т. д.). В общем случае Р]о = (О — Од), где а. — коэффициент пересчета Од и О— значения, соответствующие началь- [c.248]

Наконец, величину Кр можно определить, если из независимого эксперимента (при использовании начальных скоростей реакции) найти значения V и ЛГт<каж) ферментативной реакции и сопоставить их со значениями эффективных кинетических параметров, найденных из полной кинетической кривой при ингибирующем действии продукта реакции [см. (6.145) — (6.146)]. [c.254]

Предложить метод определения кинетических параметров ферментативных реакций, основанный на определении площади под кинетической кривой в координатах ([S], i). [c.175]

Для обработки полной кинетической кривой (табл. 6) удобно использовать интегральное уравнение скорости ферментативной реакции (8.26). Если принять, что изменение проводимости в ходе реакции пропорционально концентрации продукта, то значение переходного коэффициента а в уравнении (8.26) равно 6,67М-ом-см. [c.179]

На рисунке 90 приведен пример типичной кинетической кривой, полученной при изучении двухстадийного ферментативного процесса в начальный период времени [c.190]

Таким образом, прогрессивное уменьшение реакционной способности фермента в ходе деградации полимерного субстрата практически эквивалентно прогрессивному уменьшению скорости ферментативной реакции из-за ингибирования образующимися продуктами. Как показано в настоящем разделе, эти два случая практически не различимы в интегральных методах кинетического анализа протяженных участков кинетических кривых. Единственным критерием ингибирования продуктами реакции при гидролизе полимерных субстратов является прямой тест на ингибирование самими продуктами реакции, выделенными непосредственно из реакционной системы илн полученными независимыми методами. [c.34]

Видимо, будущее развитие кинетики ферментативных реакций СО СЛОЖНОЙ стехиометрией покажет, насколько статистическая кинетика в ее современном варианте оказалась полезной для анализа конкретных экспериментальных данных. Автор, со своей стороны, полагает, что главное достоинство статистической ферментативной кинетики заключается не столько в ее значимости для расчета формальных эмпирических коэффициентов и количественного анализа экспериментальных кинетических кривых или в ее формулах, показывающих связь микроскопических и макроскопических параметров, сколько в ее общих выводах, иллюстрирующих принципиальные закономерности ферментативной деструкции полимерных субстратов во времени. Именно на эти закономерности будет обращаться основное внимание при изложении кинетики ферментативных превращений полимеров. В заключение данного раздела будут изложены кинетические подходы к деструкции полимерных субстратов, разработанные автором с коллегами, в которых сделана попытка уйти от формализованных статистических методов математического анализа и главное внимание уделено аналитической ферментативной кинетике. [c.107]

Существуют различные методы определения числовых значений кинетических параметров ферментативных реакций (в основном А м, / тах) по результатам измерения скорости реакции при различных концентрациях субстрата [S]. По гиперболической кривой, приведенной на рис. 2.5, а, можно рассчитать однако требуемое для этого значение г ах трудно определить экспериментально. Поэтому используют выражение, обрат- [c.106]

Постоянство оптической плотности раствора реакционной смеси на какой-то длине волны свидетельствует о том, что концентрация вещества, поглощение которого на данной длине волны значительно больше, чем поглощение других компонентов реакционной смеси, остается постоянной в течение опыта. Современные двухволновые спектрофотометры открывают широкие возможности в химической кинетике. Использование их позволяет фиксировать не оптическую плотность на одной длине волны, а разность оптических плотностей на двух длинах волн. Эти длины волн могут быть выбраны таким образом, что вклад остальных компонентов в поглощение будет пренебрежимо мал и вся регистрируемая разность оптических плотностей может быть отнесена к исследуемому компоненту. Если поддерживать постоянной концентрацию поглощающего вещества в условиях, когда остальные компоненты реакционной смеси находятся в избытке, то реакция будет протекать с постоянной скоростью, т. е. кинетическая кривая в координатах расход титранта (поглощающего реагента) — время будет представлять собой прямую с тангенсом угла наклона, равным начальной скорости реакции при выбранной концентрации вещества. Возможность растянуть таким образом начальный период реакции позволяет с большей точностью измерить ее начальную скорость, а следовательно, и константу скорости реакции. Это особенно важно при изучении ферментативных процессов. Пусть в системе осуществляется реакция по уравнению [c.282]

РИС. 6-1. Кинетическая кривая для ферментативной реакции, в ходе которой субстрат 5 превращается в продукты. / — касательная, наклон которой соответствует начальной скорости реакции // — касательная к кривой в точке, соответствующей ненулевому моменту времени наклон этой прямой меньше наклона касательной, проведенной в точке <=0. [c.6]

На рис. 6.2 приведены теоретические кинетические кривые образования целлобиозы и глюкозы при ферментативном гидролизе целлюлозы в реакторе периодического действия, полученные расчетом на ЭВМ в рамках рассматриваемой модели, а также экспериментальные данные. Как видно из рисунка, теоретические зависимости хорошо согласуются с экспериментальными. [c.175]

Математическая модель ферментативного гидролиза целлюлозы в реакторах периодического и непрерывного действия была использована для количественного анализа влияния различных факторов на кинетику гидролиза [57, 58], что в свою очередь дает возможность целенаправленного изменения и оптимизации условий проведения процесса для повышения его эффективности. В качестве примеров на рис. 6.5 показан ряд кинетических кривых накопления продуктов в реакторе периодического действия, а на рис. 6.6 — в проточном колонном реакторе, полученных численным расчетом на ЭВМ в предположении, что какой-либо из возможных факторов не имеет места в реакционной системе, а также приведены экспериментальные данные. Как видно из рисунков, только при учете влияния всех факторов (кривая 2) модель достоверно описывает ход процесса (экспериментальные точки ложатся на теоретическую кривую). С другой стороны, сравнивая кинетические кривые, полученные в предположении отсутствия влияния того или иного фактора, с кривой 2, можно наглядно оценить роль каждого из факторов в процессе гидролиза. [c.178]

Пероксид водорода, образующийся в результате ферментативного окисления глюкозы, реагирует с иодидом в присутствии молибдена (VI) в качестве катализатора с образованием трииодида, который сильно поглощает свет при 360 нм. Спектрофотометрическое контролирование хода реакции при 360 нм дает кинетические кривые, подобные показанным на рис. 19-25. Начальную скорость реакции определяют изме- [c.669]

Наиболее удобно выражать скорость ферментативной реакции для начального момента реакции ( =0), когда концентрации субстратов и фермента, взятые в опыт, точно известны. Такая скорость носит название начальной скорости ферментативной реакции (Уо). Она может быть определена через тангенс угла наклона касательной к началу кинетической кривой, т. е. при = 0. В начальный период времени (вблизи / = 0) изменение концентрации субстрата мало и имеет приблизительно линейный характер. В этом случае начальная скорость может быть вычислена через изменение А[5] за конечный небольшой промежуток времени. [c.220]

Общая форма кинетической кривой (см. рис. 9.9), описывающей ферментативный катализ, имеет 5-образный характер, типичный для реакций последовательного превращения (см. рис. 9.8). Такое сходство наводит на мысль, что в ходе ферментативной реакции субстрат образует некоторый интермедиат. Тщательное изучение кинетики ферментативных реакций подтверждает высказанное предположение во всех ферментативных реакциях субстрат 5 образует с молекулой фермента Е соединение Е5, которое называется фермент-субстратным комплексом. Фермент-субстратный комплекс может распадаться по двум путям. При распаде по одному пути вновь образуется исходная молекула субстрата и фермента Е. При распаде по другому пути образуется молекула продукта Р и регенерируется молекула фермента Е. [c.419]

На рис. 51 показаны результаты исследования зависимости скорости ферментативной реакции ЛДГ, связанной с мембранами эритроцитов, от концентрации пирувата натрия при pH 7,4. Кинетические кривые для свободного фермента и комплекса фермент—мембрана подчиняются уравнению Михаэлиса—Ментен. Величина константы Михаэлиса для ЛДГ в растворе равна 0,25 0,02 ммоль/л пирувата, а для мембраносвязанной — 0,б0 0,04 ммоль/л. Максимальная скорость ферментативной реакции при взаимодействии ЛДГ с мембраной эритроцитов снижается в 1,2 раза. Значит, ингибирование фермента происходит за счет увеличения в 2,4 раза константы Михаэлиса для диру-вата натрия. [c.179]

Наибольший интерес представляют кинетическое описание протяженных кривых ферментативной деградации полимеров и выявление соответствующих кинетических закономерностей. С этим вплотную связана проблема разработки методов оценки биополимеров с точки зрения их атакуемости ферментами, а также в отношении оценки перевариваемости белков протеазами [22—25]. Иэ немногочисленных количественных данных в литературе по ферментативной деградации биополимеров видно, что для них свойственно ингибирование низкомолекулярньши продуктами реакции (см. [22, 26—32]), При этом в большинстве случаев выводы об ингибировании продуктами были сделаны при кинетическом анализе так называемых полных кривых ферментативной деградации биополимера, или протяженных участков кинетических кривых, с помощью известных методов ферментативной кинетики (например, используя интегральную форму уравнения скорости, см. [21]). В ряде случаев не исключена возможность некоторого действия ингибирования продуктами так, в работе [33] выдвинуто и обосновано положение, что формально-кинетический анализ протяженных участков кинетических кривых ферментативной деградации полимеров практически неизбежно приводит к кажущимся эффектам ингибирования продуктами, даже если продукты не связываются с ферментом и ингибирование на самом деле отсутствует. Этот эффект наблюдается для ферментов, реакционная способность которых уменьшается при увеличении степени конверсии полимерного субстрата (за счет уменьшения степени полимеризации субстрата или доли наиболее реакционноспособных (доступных) связей в молекуле полимера). Подобные ферменты составляют подавляющее большинство ферментов-деполимераз (см. табл. 1). [c.30]

Следовательно, наклон прямой, изображающей зависимость lg dpldt) от lg а (при Ь= onst), будет равен 2, а прямой lg (dp/dt от lg Ь (при а= onst) равен 1. Отметим следующее важное обстоятельство когда скорости определяются из наклонов кинетической кривой (т. е. графика зависимости концентрации от времени), происходит изменение концентраций всех реагентов. Поэтому для получения правильных результатов необходимо либо брать начальные концентрации всех реагентов в соотношении, соответствующем стехиометрическому (в зтом случае определяется общий порядок), либо (и это более распространенный вариант) с самого начала реакции обеспечивать большой избыток тех реагентов, концентрацию которых хотят поддерживать постоянной, тогда изменения в их концентрации будут несущественными. Если ни один из зтих вариантов постановки эксперимента осуществить не удастся, то скорости получают из серии измерений наклона в нулевой момент времени, т. е. из измерений начальных скоростей. Этим методом обычно пользуются в случае реакций, катализируемых ферментами, поскольку кинетические кривые ферментативных реакций при выборе достаточно протяженных интервалов времени не могут быть описаны строго простыми уравнениями скорости. Как правило, кинетическая кривая ферментативной реакции описывается более сложным уравнением, чем интегральная форма уравнения скорости полученного для начальной скорости. [c.19]

Резюмируя все изложенное выше, можно сказать, что кинетическая кривая ферментативной реакции обычно сестоит из трех участков, четко разграниченных по времени, как это показано на рис.2.2. Первый, переходный участок описывается уравнениями, сходными с уравнением (2.9) более детально он рассмотрен в гл. 9. Второй участок (участок начальной скорости)- является единственным, для которого скорость процесса Действительно, постоянна. После опубликования работы Михаэлиса и Ментен большая часть исследований была посвящена изучению именно этого участка кинетической кривой. Наибольшее внимание уделено ему и в настоящей книге. Для описания конечного участка, где концентрации субстрата и продукта существенно изменяются и скорость процесса снижается до нуля, требуются уравнения, сходные с уравнением (2.11) обычно они применяются в интегральной форме. Этот участок рассмотрен в гл. 8. [c.42]

Бэн( )илд [21] предложил оригинальный метод определения кинетических параметров ферментативных реакций, основанный на определении площади под кинетической кривой в координатах ([S],/). Повторное интегрирование интегральной ( )ормы уравнения скорости ферментативной реакции (6.134) в пределах (О, [S]o) приводит к уравнению [c.249]

При изучении кинетики гидролиза п-нитроанилида Ь-ала-нина, катализируемого аминоцептидазой М в стационарном режиме протекания реакции было найдено, что зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата имеет вид 5-образной кривой при малых концентрациях п-нитро-анилида [19]. Предполагая, что фермент в условиях реакции претерпевает обратимую изомеризацию с образованием неактивного конформера (Е, схема 6.27), и исходя из данных табл. 16, определить значения кинетических параметров ферментативной реакции и константу равновесной обратимой изомеризации фермента [c.124]

При изучении начального периода гидролиза /г-нитрофе-нилового эфира триметилуксусной кислоты, катализируемого эластазой (см. рис. 91), было найдено, что разность оптической плотности (АО) между наблюдаемой кинетической кривой и экстраполированным участком прямой, отвечающим стационарному периоду реакции, уменьшается со временем согласно кинетике первого порядка [12]. Было показано, что значение эффективной константы скорости реакции первого порядка зависит от начальной концентрации субстрата (табл. 7). Принимая, что ферментативная реакция протекает по схеме (9.8), определить значения констант кц и кг. [c.194]

Концепции Тома и Хироми о миогосайтной структуре активных центров карбогидраз (см. следующую главу), разработанные в последнее десятилетие, и данные по картированию активных центров во многом прояснили взаимосвязь между структурой активного центра и специфичностью его действия. Стало возможным предсказывать ход кинетических кривых гидролитического расщепления олигосахаридов и состава продуктов их ферментативной л,сструкции на основе числа сайтов активного центра и таких их характеристик, как показатель сродства сайтов к моносаха-ридным звеньям полимерного субстрата. Несмотря на определенную условность допущений, принятых в качестве базовых положений это теории (об этом будет подробно сказано ниже), основ- [c.23]

В тех случаях, когда непосредственно измерить концентрацию Р невозможно, кинетическая кривая накопления Р может быть получена как разность кинетических кривых образования Р и Р + Р, определенных независимо [И]. Если же мутаротация в ходе ферментативного гидролиза протекает достаточно быстро (например, при условии, что кинетические эксперименты весьма продолжительны или в системе присутствует специфическая му-таротаза ), то оба описанных выше подхода для определения ано-мерпой конфи урации образуюпдихся продуктов реакции могут ие дать положительных результатов. [c.26]

Известно, что кинетику ферментативных реакций можно изучать с помощью регистрации либо начальных участков кинетической кривой, либо достаточно протяженных ее участков (практически до полного завершения реакции) [21]. В первом случае изучение преврапгений полимеров не отличается принципиально от изучения реакций любых других (простых) субстратов, поскольку в начальный период реакции ферментативной атаке могут подвергаться различные по реакционной способности участки полимера в зависимости от их относительного содержания и относительного сродства фермента к ним. Поэтому соответствующие эффективные кинетические параметры ферментативной реакции (константы Михаэлиса, каталитические константы) являются некоторыми средними величинами и не могут быть использованы для описания и теоретического предсказания временного хода ферментативного процесса на достаточно больших глубинах превращения полимеррюго субстрата. [c.29]

Рис. 6.5. Влияние различных факторов на кинетику ферментативного гидролиза целлюлозы в реакторе периодического действия. Кинетические кривые получены расчетом на ЭВМ 1 — весь субстрат принят за кристаллический 2 — учтены все факторы 5 — не учтено ингибирование глюкозой 4 — не учтена инактивация целлобиозообразующих ферментов 5 — не учтено ингибирование целлобиозой 6 — весь субстрат принят за аморфный о — экспериментальные точки (глюкоза - - целлобиоза). Концентрация субстрата — 80 г/л, активность ферментов из Т.1опдгЬгасЬ.1аЫт — 14 ед. по фильтровальной бумаге на 1 г субстрата, 50° С, pH 4,5

Рис. 6.6. Влияние различных факторов на кинетику ферментативного гидролиза целлюлозы в проточном колонном реакторе. Кинетические кривые получены расчетом на ЭВМ 1 — весь субстрат принят за кристаллический 2 — учтены все факторы 3— не учтена инактивация целлобиозообразующих ферментов 4 — не учтено ингибирование глюкозой 5 - не учтено ингибирование целлобиозой

Преимущество метода автоматической регистрации изменения pH в ходе реакции состоит в том, что он дает прямо кинетическую кривую хода процесса. При этом по желанию может быть избран любой интервал изменения pH, в котором изменение ионизации функциональных групп фермента не сказывается на его активности. Опыг показывает, что этот интервал может быть достаточно узким — в пределах 0,1—0,2 ед. pH. Точно так же по желанию исследователя может быть избрано любое начальное значение pH, при котором измеряется кинетика реакции. Наконец самый метод позволяет осуществить проверку, влияет ли небольшое изменение pH в ходе реакции на активность фермента. Если это влияние обнаруживается, графическим методом всегда можно экстраполировать скорость реакции на начальное значение pH. Экспериментальная проверка показала, что если избраны условия ферментативного гидролиза субстрата так, что реакция имеет нулевой порядок, то в ходе про- [c.146]

Для многих ферментов характерна гипфболическая кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 9-4), постепенно приближающаяся к точке, соответствующей насыщению фермента субстратом. Мы уже видели, что такие кривые имеют две основные точки 1) Км-концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине ее максимальной скорости, и 2) Т ах-максимальная скорость, т.е. предельное значение, к которому приближается скорость реакции при бесконечно большой концентрации субстрата. Михаэлис и Ментен показали, что из гиперболических кривых насьпцения ферментов можно извлечь много дополнительной полезной информации, если перевести их в простую математическую форму, равнение Михаэлиса-Ментен представляет собой алг раиче-ское выражение гиперболической формы таких кривых. Членами этого важнейшего уравнения являются концентрация субстрата 8, начальная скорость Vo, Утах и Км - Уравнение Михаэлиса-Ментен лежит в основе всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как [c.233]

Для определения скорости в данный момент необходимо знать Д [5) за весьма малый промежуток времени, в пределах приближающихся к нулю М - 0. Наиболее удобно выражать скорость ферментативной реакции для начального момента реакции (/ = 0), когда точно известны взятые для опыта концентрации субстратов и фермёнта. Такая скорость называется начал ьной скоростью ферментативной реакции (с/д). При изучении ферментативной кинетики надо построить кинетическую кривую минимум по четырем-пяти временным точкам. Для отыскания начальной скорости достаточно построить только первый участок кривой хода реакции и определить тангенс угла наклона в начальной точке. [c.128]

Уравнение (III. 1.5) называется уравнением Михаэлиса. Из уравнения видно, что при увеличении концентрации субстрата S от О до оо скорость реакции (тангенс угла наклона начальных участков кинетических кривых S(i)) возрастает от нуля до своего максимального значения v = Агг- о. Таким образом, ферментативные процессы — это процессы с насьщением. На рис. III. 1 изображена зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (гипербола Михаэлиса). [c.63]

При изучении ферментативных реакций кинетические исследования проводят, как правило, в условиях, при которых свободный фермент и его промежуточные формы находятся в стационарном состоянии. Это позволяет значительно упростить уравнения для скорости реакций, но приводит к потере значительной части информации о механизме процесса и промежуточных формах фермента. Поэтому более тонкие кинетические исследования включают определение предстацнонарных характеристик системы. Этот подход более сложен технически, и к тому же при его использовании требуется трудоемкий математический анализ кинетических кривых. Исследования предстационарной кинетики значительно упрощают релаксационные методы, которые стали очень популярны в последние годы. [c.41]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология