Деструкция ферментативная

Автор данной книги весьма скептически оценивает приложения статистической ферментативной кинетики к анализу экспериментальных данных по деструкции полимерных субстратов на базе представлений о характеристических аффинностях индивидуальных сайтов активного центра, или об аддитивности сродства индивидуальных сайтов к мономерным остаткам субстрата. Возможно, этот скептицизм обусловлен определенной приверженностью автора к классической ферментативной кинетике, где четкий математический аппарат, играя лишь вспомогательную роль, не заслоняет красоту логических построений, направленных на выявление все новых кинетических особенностей игры фермента и субстрата. Но дело скорее не в этом, а в том, что постулат о неизменности показателей сродства сайтов, независимо от того, заняты или нет соседние связывающие участки, и независимо от строения (степени полимеризации) субстрата в корне противоречит современным представлениям о динамической структуре фермента и его активного центра. Вообще деление активного центра на определенное и жестко фиксированное число сайтов, тем более с постоянным сродством, не согласуется с обилием данных в современной физико-химической энзимологии о флуктуирующей структуре активного центра, о тонких механизмах регуляции активности и субстратной [c.106]

Наконец, во многих случаях растворимые продукты ферментативной деградации биополимера могут адсорбироваться на поверхности своего же исходного субстрата, практически ие выходя при этом в раствор вплоть до определенной продолжительности реакции. Это может приводить к ложным лаг-периодам реакции и соответственно к ошибочным выводам о кинетике и механизмах ферментативной деструкции полимеров. [c.4]

Каждая молекула полимерного субстрата фактически представляет собой целый спектр субстратов (реакционных центров) с различной реакционной способностью. При этом реакционная способность полимеров, как правило, убывает в ходе его ферментативной деструкции. Это приводит к своеобразным эффектам в кинетике ферментативной деградации полимерных субстратов, которые трудно (а часто невозможно) отличить от эффекта ингибирования реакции продуктами ферментативного гидролиза. Поэтому, прежде чем на основании кинетического изучения реакции делать окончательный вывод о наличии значительного ингибирования продуктами и, более того, давать рекомендации по поводу соответствующей конструкции ферментного реактора для практических целен, необходимо проверить ингибирующую способность продуктов с помощью прямых методов, добавляя продукты гидролиза непосредственно в реакционную систему. [c.35]

СПОСОБЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ ПОЛИМЕРОВ. МНОЖЕСТВЕННАЯ АТАКА [c.77]

Немалая сложность кинетического описания ферментативной деструкции полимеров обусловлена тем, что, в отличие от простых субстратов (содержащих лишь один реакционный центр на молекулу), полимерные субстраты предоставляют ферментам широкие возможности для способов атаки. [c.77]

Естественно, что разные способы ферментативной атаки на полимерный субстрат описываются различными кинетическими уравнениями, которые будут рассматриваться в следующей главе. Здесь же уделено внимание лишь одному, и наиболее спорному, на взгляд автора, понятию в кинетике и механизмах ферментативной деструкции полимеров — множественной атаке. [c.78]

Чтобы сразу обозначить свою позицию, автор подчеркивает, что ни в одной из известных ему работ не дано четких доказательств существования множественной атаки и практически во всех случаях можно привести альтернативные объяснения наблюдаемых эффектов, базирующиеся на более привычных понятиях. Так, при ферментативной деструкции нерастворимых биополимеров [c.78]

Таким образом, при изучении множественной атаки возможность повторной ферментативной деструкции субстрата тривиальным способом (в результате диссоциации комплекса фермента с образующимся продуктом и повторная ассоциация с последующей атакой) должна быть полностью исключена. Подобное проведение столь чистого эксперимента было бы возможным лишь при очень сильной зависимости скорости ферментативного гидролиза от степени полимеризации субстрата в широком диапазоне последней. Тогда после первого же расщепления олигомерного субстрата скорость гидролиза должна настолько замедлиться, что реакция фактически остановится. Не исключено, правда, что она остановится и для процесса множественной атаки. [c.79]

Вообще говоря, логично было бы сделать предположение о том, что ферментативная деструкция промежуточных олигосахаридов вплоть до малых фрагментов 0(, Ог легче происходит при низких pH, в то время как при высоких pH легче атакуются длинные олигосахариды, чем короткие (см. пример 5). Если бы последую-щ lя экспериментальная проверка этого предположения показала, что р11-зависимость начальной скорости гидролиза исходной мальтозы смещена в щелочную сторону по сравнению с рН-зависи-мостью гидролиза, например, тетра- или пентамеров, то подтвердилась бы именно такая трактовка, нежели предположение о рН-зависпмости эффективности множественной атаки . Однако авторы работы [9] не предусмотрели этой достаточно вероятной возможности (см. пример 4) и вместо этого постулировали наличие множественной атаки при pH 6,9. Обработка экспериментальных данных [9] в рамках механизма множественной атаки показала, что субстрат проскальзывает вдоль активного центра а-амилазы на два глюкозных остатка и максимальная степень множественной атаки при pH 6,9 составляет 2,2—3,5. [c.84]

В продуктах ферментативной деструкции поли- или олигомера (в ходе гидролиза) не обнаруживают промежуточных высших олигосахаридов (как правило, 64—О ), и в системе накапливаются лишь малые олигосахариды (О]—Оз). Этого авторам [c.102]

Для анализа экспериментальных данных (распределение продуктов ферментативной деструкции полимера в зависимости от степени полимеризации, или средняя степень полимеризации продуктов гидролиза) используют теоретические модели ферментативной деструкции полимеров — обычно весьма детализированные, но, как правило, содержащие сильные (и неочевидные) допущения, лишающие смысла всю детализацию. К ним относятся допущения об аддитивности показателей сродства индивидуальных сайтов, о постоянстве гидролитического коэффициента независимо от способа связывания субстрата и степени его полимеризации, о постоянстве инкремента свободной энергии активации действия фермента при последовательном заполнении его сайтов и т. д. Несоответствие теоретических данных, рассчитанных с помощью подобных упрощенных моделей, с экспериментальными нередко трактуется как доказательство в пользу существования таких неординарных механизмов, как множественная атака. При этом в работах, как правило, отсутствует критический анализ ограничений модели, и в частности анализ альтернативных механизмов действия фермента без априорного привлечения неординарных механизмов. [c.103]

Главное содержание кинетических подходов к описанию процессов ферментативной деструкции полимеров, разработанных к настоящему времеии, состоит в том, чтобы связать макроскопические кинетические параметры, определенные из эксперимента, с микроскопическими, характеризующими взаимодействие субстрата и его фрагментов с активным центром фермента и его сайтами. [c.105]

Видимо, будущее развитие кинетики ферментативных реакций СО СЛОЖНОЙ стехиометрией покажет, насколько статистическая кинетика в ее современном варианте оказалась полезной для анализа конкретных экспериментальных данных. Автор, со своей стороны, полагает, что главное достоинство статистической ферментативной кинетики заключается не столько в ее значимости для расчета формальных эмпирических коэффициентов и количественного анализа экспериментальных кинетических кривых или в ее формулах, показывающих связь микроскопических и макроскопических параметров, сколько в ее общих выводах, иллюстрирующих принципиальные закономерности ферментативной деструкции полимерных субстратов во времени. Именно на эти закономерности будет обращаться основное внимание при изложении кинетики ферментативных превращений полимеров. В заключение данного раздела будут изложены кинетические подходы к деструкции полимерных субстратов, разработанные автором с коллегами, в которых сделана попытка уйти от формализованных статистических методов математического анализа и главное внимание уделено аналитической ферментативной кинетике. [c.107]

При описании кинетики ферментативной деструкции полимерных субстратов к настоящему времени разработан целый ряд подходов статистической кинетики, которые отличаются друг от дру- [c.134]

Накопленный к настоящему времени опыт теоретического рассмотрения кинетики ферментативной деструкции полимеров позволяет утверждать, что иа экспериментально определяемую величину константы Михаэлиса должны влиять гетерогенность состава полимерного субстрата (по типу мономерных звеньев), различия в типах статистического распределения полимеров по степени полимеризации, конкурентное самоингибирование субстратом (или его фрагментами), множественная атака. Конкурентное самоингибирование уменьшает величину эффективной константы Михаэлиса. Напротив, возрастание степени множественной атаки (если последняя вообще имеет место) приводит к возрас- [c.135]

Согласно этой схеме на первой (медленной) стадии происходит образование затравки по механизму диспропорционирования, на второй — трансгликозилирование с образованием мономера и олигосахарида с более высокой степенью полимеризации и на третьей стадии — относительно быстрый гидролиз олигосахарида. По-видимому, на третьей стадии может также происходить перенос гликоновой части субстрата на имеющийся в реакционной системе акцептор (G2, G3 или G4), что, в свою очередь, приведет к образованию продукта переноса еще более высокой степени полимеризации и т. д. В итоге в реакционной системе будет одновременно происходить множество самых разнообразных процессов ферментативного гидролиза и синтеза олигомеров с постепенной деструкцией их до мономера, конечного продукта гидролитической реакции. Медленный переход реакционной системы в подобный режим и должен характеризоваться индукционным периодом реакции. [c.189]

Крахмал легко поддается ферментативному расщеплению (деструкции) вплоть до глюкозы. Далее, путем простой механической обработки можно получить модификации крахмала, растворимые даже в холодной воде. Эти свойства практически отсутствуют у клетчатки. [c.239]

Химическое строение основной цепи макромолекулы. Химич. методы определения строения главной цепи макромолекулы основаны на расщеплепии молекулы (гидролитич. расщепление, окислительная деструкция, ферментативное расщепление, пиролиз, действие ионизирующего излучения) и дальнейшей И. получен)1ых продуктов. Методы, связанные с расщеплением молеку- [c.399]

Термин полимерный субстрат обычно означает, что данный полимер служит объектом действия на него фермента. В ряде случаев в роли полимерных субстратов используются и синтетические поли- или олигомеры, но они, как правило, моделируют поведение природных полимеров и их фрагментов. Синтетические олигомеры зачастую более доступны, чем их природные аналоги, и их можно приготовить практически однородными (гомополимер-ными) в отношсиуи химической последовательности, в то время как природные полимеры, выделенные из клеток животного, растительного или микробного происхождения, могут содержать дефекты (в химическом отношении, а не с точки зрения биологической целесообразности). Именно этим вызвано в последнее время все возрастающее применение синтетических поли- и олигомеров для изучения механизма их ферментативной деструкции. [c.6]

Большое разнообразие ферментов-деполимераз, действующих зачастую на один и тот же субстрат, безусловно, затрудняет кинетическое описание путей деструкции полимера. С другой стороны, эта особенность действия деполимераз показывает, что весьма актуальной задачей ири создании общей концепции ферментативной деградации полимеров является разработка кинетической теории действия полиферментных систем. Современное состояние этой проблемы отражено в четвертой главе настоящего раздела. [c.8]

Каждая молекула полимерного субстрата фактически представляет собой целый спектр субстратов (реакционных центров) с различной реакционной способностью, которая, как правило, убывает в ходе ферментативной деструкции полимера. Это обусловлено, во-первых, закономерным уменьшением эффективности ферментативного гидролиза при уменьшении степени полимеризации субстрата (см. табл. 1), которая наблюдается для всех эндогид-ролаз и для большинства экзогидролаз, и, во-вторых, предпочтительным расщеплением наиболее реакциоппоспособпых и (или) доступных связей полимера (в особенности нерастворимого полимера) на начальных этапах реакции. Именно поэтому определение начальных скоростей ферментативного превращения полимера в большинстве случаев не является особенно информативным. [c.29]

Субстратами полисахаридгидролаз в природе служат несколько групп полисахаридов структурные, резервные и гелеобразующие. Однако закономерности их ферментативной деградации достаточно сходны и определяются главным образом надмолекулярной структурой субстрата и организацией активных центров гли-козидгидролаз. В настоящее время нельзя с определенностью сказать, одинаковы или нет основные закономерности ферментативной деструкции нерастворимых природных полисахаридов и их [c.34]

Если ко — константа скорости гидролиза потенциально расщепляемой связи в продуктивном фермент-субстратном комплексе, то ката,1итическая констапта ферментативной деструкции полимера может быть определена как [c.42]

Р — степень множественной атаки). Однако из данных других работ тех же авторов следует, что скорость ферментативного расщепления О5 равна или даже превосходит скорость расщепления О7 (см. табл. 10) и дополнительное количество мальтозы в систе ме (помимо продукта прямой декстрз кции О7) должно неизбежно возникать в результате последующей (и немедленной) деструкции образующейся Оз. Поправки на этот эффект (которые могут быть весьма значительными) в работе [8] не вводились. [c.83]

Напротив, если бы ферментативный гидролиз гтроходил исключительно по неупорядоченному механизму, то сразу после начала реакции и по мере последующей деструкции исходного полимера спектральный максимум должен был последовательно смещаться в сторону более коротких длин волн. В последнем случае положение медианы, соединяющей все максимумы на спектральных кри- [c.90]

Ясно, что эти данные могут быть интерпретированы более простым образом, а именно что способ действия фосфорилазы (априорно принятый в цитируемой работе [16] как канонический для неупорядоченного действия фермента) несколько отличается от способа действия р-амилазы, что приводит к различному распределению продуктов деструкции полимерного субстрата по молекулярным массам (степени полимеризации). Как неоднократно указывалос . выше, это наиболее характерный признак действия деполимераз, и в рамках кинетики и субстратной специфичности действия ферментов он обусловлен различной зависимостью кинетических параметров ферментативной реакции от степени полимеризации (длины цепи) олигосахаридов. С точки зрения термодинамики действия деполимераз этот характерный признак объясняется различным числом сайтов в активном центре фермента, различным их сродством к мономерным остаткам субстрата и положением каталитического участка в активном центре. Как видно, и в этом случае введение гипотезы о множественной атаке было излишним и преждевременным, так как экспериментальные данные, полученные авторами работы [16], не были подвергнуты тщательному анализу. [c.91]

Отсюда видно, что скорость ферментативной деструкции полимера при малой концентрации субстрата зависит от обоих показателей множественной атаки — эффективности гидролиза, г/ , или доли расщепленных связей за продвижение субстата на одну мономерную единицу, и среднего числа единичных продвижений за время жизни фермент-субстратного комплекса, т1 . В то же время максимальная скорость ферментативной деструкции (при насыщающей концентрации субстрата) определяется только эффективностью гидролиза, так как величина ta., предполагается постоянной. Левая часть выражения (77) в соответствии с уравнением Михаэлиса — Ментен (при [5]о<С/(т) равна йкат [5]о//Ст, а выражения (78) — кат) СЛСДОВЗТбЛЬНО [c.100]

Автор допускает возможность существования множественной атаки при действии деполимераз. Более того, он убежден, что этот механизм может играть важную роль в ферментативной деструкции нерастворимых биополимеров, где продвижение адсорбированного фермента по поверхности субстрата происходит с участием периферийных частей белковой (гликопротеиновой) глобулы, что легко представить условно как перекатывание фермента по поверхности нерастворимого субстрата. Наконец, при гидролизе нерастворимых биополимеров важную роль играет своеобразный клеточный эффект , когда молекула фермента последовательно действует на один и тот же участок субстрата, не успевая диффундировать от него на достаточное расстояние и снова адсорбируясь в определенной близости от места предыдущей атаки. Иначе говоря, автор не против множественной атаки, как и других неординарных механизмов ферментативного катализа. Однако в любом случае они должны быть строго обоснованы, и следует обязательно учитывать альтернативные и более тривиальные механизмы. В противном случае и без того сложная картина кинетики и механизмов действия деполимераз дополнительно усложняется введением надуманн 1х-эффектов и необоснованных концепций. [c.104]

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ СО сложной СТЕХИОМЕТРИЕИ ПРОЦЕССОВ ДЕСТРУКЦИИ ПОЛИМЕРОВ) [c.105]

Поскольку при ферментативной деструкции полимеров схема реакции описывается уравнением Михаэлиса — Ментен, то соответствующие зависимости в координатах Лайпуивера — Берка [6] будут линейными, откуда можно определить эффективные значения Кт и Ут. Это лее относится и к реакциям деструкции гетерополимеров [5]. [c.113]

Как показано в работе [И], при ферментативной деструкции линейных полимерных целей по механизму неупорядоченной атаки молекулярно-весовое распределение продуктов реакции в любой момент времени (при л>/г) близко к наиболее вероятному (или экспоненциальному) и олигомеры с длинами цепей л<Л не вносят заметного вклада в кинетику накопления мономеров. Пренебрегая отличием распределения от экспоненциального на этом участке, запипгем [c.120]

К сожалению, в литературе пока пе проведен хотя бы приблизительный сравнительный анализ, в какой степени разные подходы статистической кинетики могут быть применимы для описания одних и тех же экснериментальных даггных и как при этом будут отличаться смысл и числеиные значения микроскопических параметров ферментативной реакции (при использовании различных детализированных подходов, с одной стороны, и упрощенных подходов — с другой). Поэтому реальная значимость разработанных подходов статистического анализа к описанию кинетики ферментативной деструкции полимеров остается до настоящего времени неясной. Вместо этого аналитическое рассмотрение иробле-,мы обычно подменяется массированной компьютерной обработкой данных па базе целого ряда формализованных подходов и неоправданных допущений. При этом часто создается иллюзия взаимной согласованности экспериментальных данных и теоретических расчетов, хотя обычно теоретические расчеты корректируются с помощью тех же исходных экснериментальных данных, которые впоследствии и обрабатываются с помощью скорректированных эмпирических коэффициентов. [c.135]