График для ингибирования субстрата

Для определения типа ингибирования и величины /С широко используется метод Диксона Скорость реакции измеряют при варьирующей концентрации ингибитора и постоянной концентрации субстрата. График зависимости J/vo от [I] представляет собой прямую Если [c.213]

Конкурентное и неконкурентное ингибирование легко различить с помощью графиков Лайнуивера Берка. В присутствии конкурентного ингибитора наклон прямой увеличивается, что соответствует уменьшению скорости реакции (рис. 1.14, д). Однако, несмотря на увеличение наклона, величина отрезка, отсекаемого этой прямой от оси 1/Уо, остается прежней. Другими словами, если провести экстраполяцию к бесконечной концентрации субстрата (т. е. к точке 1/[5] = 0), то окажется, что скорость реакции не зависит от присутствия конкурентного ингибитора. Это объясняется тем, что по мере увеличения концентрации субстрата последний все более успешно конку- [c.37]

Интересная картина наблюдается, если между субстратами обнаруживается конкуренция, так как это может приводить к само-ингибированию, которое обнаруживается на графиках, подобных изображенным на рис. 17. Диксон и Уэбб [49] показали, что такой эффект проявляется при окислении лейцина с метиленовой синью в качестве акцептора водорода и в присутствии оксидазы из змеиного яда. На рис. 18 представлена зависимость обратной скорости от концентрации лейцина при различных заданных концентрациях метиленовой сини. Наклон линий изменяется с концентрацией метиленовой сини, однако линейные участки кривых (указывающие па ингибирование) проходят через общую точку. [c.129]

Описанные эффекты могут наблюдаться по отдельности. В этом случае они вызывают либо конкурентное ингибирование (случай 1), либо бесконкурентное (случай 2). Если же оба эти эффекта проявляются одновременно, то это свидетельствует о неконкурентном ингибировании. Если субстрат или ингибитор соединяются более чем с одной формой фермента, то общая картина представляет собой результат наложения друг на друга разных типов ингибирования. График, отвечающий такой ситуации, может представлять собой прямую или может иметь более сложную форму (парабола, гипербола и т. д.). [c.184]

При графическом представлении зависимости от Л" наклон прямой не связан с членами, содержащими В. Аналогично прямые ио =/(В ) имеют один и тот же наклон при различных значениях А. Таким образом, прямые, выражающие зависимость от обратной концентрации одного из субстратов варьируемый субстрат) при различных постоянных концентрациях другого субстрата фиксированный субстрат) параллельны. Характерность таких графиков для механизмов с замещением фермента показана на большом числе примеров, а существующая в настоящее время строгая теория кинетического анализа в принципе позволяет исключать в таких случаях все другие мыслимые формы механизмов. Было также показано, что, даже если допустить образование тупиковых комплексов (т. е. непродуктивных комплексов В с Е и А с ЕК) в механизме с замещением ферментов, идентификация этой формы механизма не становится менее надежной [11]. Такое характерное двойное конкурентное ингибирование субстратами может даже значительно облегчить обнаружение замещенных форм фермента [12]. [c.132]

Характер ингибирования может быть выяснен путём исследования зависимости скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии ингибитора. По результатам строят график зависимости обратной величины скорости (1/у) от обратной величины концентрации (1/[81). [c.82]

Конкурентное ингибирование проще всего можно распознать экспериментальным путем, определив влияние концентрации ингибитора на зависимость начальной скорости реакции от концентрации Субстрата. Для выяснения вопроса о том, по какому типу-конкурентному или неконкурентному-происходит обратимое ингибирование фермента (дополнение 9-3), весьма удобно преобразовать уравнение Михаэлиса-Ментен в линейную форму. Чаще всего для этой цели используют метод двойных обратных величин. Из графиков, построенных в двойных обратных координатах, можно определить также значение константы диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Для реакции диссоциации [c.246]

По данным кинетического анализа, ингибирование по принципу обратной связи может быть конкурентным, неконкурентным, частично конкурентным или может носить иной характер. Если при высоких концентрациях 8 активность фермента примерно одинакова в присутствии и в отсутствие аллостерического ингибитора, то кинетика внешне сходна с кинетикой конкурентного ингибирования. Однако, поскольку кривая насыщения субстратом все-таки носит сигмоидный, а не гиперболический характер, метод построения графиков в обратных координатах для аллостерических ингибиторов непригоден он предложен для конкурентного ингибирования в каталитическом центре. Поскольку аллостерические ингибиторы связываются с ферментом в другом (аллостерическом) центре, исходная кинетическая модель утрачивает силу. [c.107]

Теперь остается установить, что произойдет, если Q соединяется с А необратимо. В этом случае Л о просто уменьшится на величину, равную истинной концентрации р. Уравнение и график зависимости 1 о от (Ло — Q) будут обычными, но график зависимости о от Ло, если Ло — просто концентрация субстрата, введенная в реакционную смесь, изменится. Равнобочная гипербола, выражающая зависимость vo от Ло, будет смещена по оси Ло, а график зависимости от Ло" станет нелинейным (фиг. 9). Этот случай по крайней мере нельзя спутать со случаем нормального процесса ингибирования. С другой стороны, на основании такого вида кривых нельзя утверждать, что мы наверняка имеем дело с необратимым связыванием субстрата, поскольку нелинейные зависимости этого типа могут появиться по ряду других причин (например, когда в реакционной системе имеется смесь ферментов или ферменты, обладающие несколькими видами активности, или же при действии некоторых нормальных двухсубстратных механизмов) [c.74]

Данные, на основании которых был установлен этот механизм, приведены на фиг. 19. При низких постоянных концентрациях одного из субстратов графики двойных обратных величин для другого субстрата прямолинейны и почти параллельны, как в случае простого механизма с замещением фермента. При возрастании концентрации фиксированного субстрата наблюдается конкурентное ингибирование, вызывающее соответствующий сдвиг графиков. На графиках зависимости от наблюдается картина, характерная для субстратного ингибирования, особенно при низких значениях А. Те же данные, вычерченные в виде зависимости от Л", показывают, что при более высоких значениях В эффект конкурентного ингибирования- накладывается на простое смещение параллельных линий, вызываемое большими концентрациями фиксированного субстрата. [c.149]

Использование графиков, построенных в двойных обратных координатах для анализа данных, полученньк при исследовании ингибирования ферментативных реакций, позволяет легко отличать конкурентные ингибиторы от неконкурентных. Проводятся две серии опытов по определению скорости реакции при одной и той же концентрации фермента. В одной серии концентрация субстрата тоже остается постоянной и соответствующими экспериментальными методами определяется влияние повышения концентрации ингибитора на начальную скорость реакции Го. В другой серии, наоборот, концентрация ингибитора поддерживается постоянной, но используются разные концентрации субстрата. На основе данных, полученных в опытах той и другой серии, строят графики в координатах 1/И [c.247]

После того как уравнение записано в терминах кинетических констант Ка, Кр, Kq, Keq, Kip и Др.), последние можно вычислить на основе экспериментальных данных. Константы Михаэлиса, максимальные скорости и константы ингибирования можно рассчитать измеряя начальные скорости реакций. В некоторых случаях для определения констант ингибирования необходимо исследование ингибирования продуктом. Анализ начальных скоростей обычно подразумевает варьирование одного из субстратов при фиксированных концентрациях других субстратов и вычисление наклонов и пересечений с осями на графиках обратных величин или других способах представления данных, например на графиках v/S от v или S/v от [c.27]

Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера—Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора. [c.38]

Из этого уравнения ясно видны особенности ингибирования уравнение имеет тот же самый вид (линейность графиков сохраняется), максимальная скорость реакции не изменяется, но кажущаяся константа Михаэлиса возрастает по сравнению с Кт для неингибиро-ванной реакции в (СЯд-ЬО раз. На этом основании значение Кд можно определить экспериментально, поскольку определение в отсутствие Q дает Кт, а в присутствии Р получается /(т(<Э/Сд1)4 Если Р = 0 или /С<з очень мала, что указывает на низкое сродство р к ферменту, то ингибирования не наблюдается и кажущаяся Кт имеет нормальное значение. Далее, если Ао настолько велико, что определяет значение знаменателя в уравнении (17), т. е. если концентрация субстрата достаточна для достижения максимальной скорости реакции, то член QKQ опять-таки не влияет на величину знаменателя и максимальная скорость реакции не изменяется. Таким образом, ингибирование носит конкурентный характер оно выражено в наибольшей степени при высокой концентрации ингибитора или низкой концентрации субстрата и исчезает при очень низкой концентрации ингибитора или очень высокой концентрации субстрата. Это весьма наглядно видно на графиках, изображающих кинетику нормальной и конкурентно ингибированной ферментативных реакций (фиг. 8). [c.69]

На рис. 2.1196 дан график зависимости степени конверсии от скорости потока при равных соотношениях константы ингибирования и константы Михаэлиса. Видно, что степень конверсии субстрата быстро уменьшается с увеличением отношения К /К.. [c.308]

Ингибирование субстратом обнаруживается на графике Лайнуивера—Бэрка по следующему признаку, по мере того как l/[S)o [c.124]

На рис. 6.12 — 6.14 ыожно о1ме1И1ь еще одну де1аль. Поскольку на оси абсцисс отложена величина 1/[5], все точки, лежащие на оси ординат, соответствуют системе с бесконечно больиюй концентрацией субстрата (если 1/[5] = 0, то [5] = оо). При конкурентном ингибировании избыток субстрата снимает ингибирующий эффект, и, следовательно, величина Кшах при бесконечной концентрации субстрата должна быть одной и той же для обеих систем, т. е. как контрольный график, так и график ингибирования будут иметь общие точки пересечения с осью ординат. График, приведенный на рис. 6.13, иллюстрирует такой случай. При неконкурентном ингибировании контрольный график и график ингибирования обычно изображают так, что они (Пересекаются на оси абсцисс, где откладывают значения —1/[5]. Однако необходимо указать, что такая ситуация имеет место только в особых случаях неконкурентного ингибирования, и тогда его называют простым линейным неконкурентным ингибированием . Если неконкурентное ингибирование не относится к этому случаю, то соответствующие линии могут пересекаться выше или ниже оси —1/[5] (рис. 6.12). [c.354]

Чтобы выявить наличие кон курентного ингибирования, обыч-но строят графики зависимости u/[S] от V, описываемые уравнением (6-45), или 1/и от 1/[S] [уравнение (6-46)] для реакций, протекающих в отсутствие ингибитора и в его присутствии при одной или нескольких фиксированных концентрациях. 1ри наличии конкурентного ингибирования получают семейство прямых, пересекающихся с одной и осей в точке 1/Утах (рис. 6-6). Иначе говоря, максимальна скорость не изменяется в присутствии конкурентного ингибитора. Если взять достаточно высокую концентрацию субстрата то всегда можно насытить фермент субстратом и ПОЛНОСТЬЮ -исключить связывание ингибитора. Из изменения наклона с ростом концентрации ингибитора нетрудно при помощи уравнений (6-45) или (6-46) рассчитать величину Kl. [c.28]

Ингибирование продуктом реакции (разд. А, 9) также дает ценную-информацию о механизме ферментатив ного процесса. Например, если построить графики зависимостей 1/v от 1/[А], то в случае выполнения механизма с упорядоченным присоединением субстратов (6-34) мы обнаружим. что продукт конкурирует с А, и получим семейство прямых,, характерное для конкурентного ингибирования. В то же время зависи-иости l/t от 1/[В] в отсутствие и в присутствии продукта Q будут иметь [c.31]

ГЛУТАМАТ - ОКСАЛОАЦЕТАТ-ТРАНСАМИНАЗА Хорошей иллюстрацией применения аналитического метода стационарной кинетики служит работа Хенсона и Клеланда [1] по изучению глутамат — оксалоацетат-трансаминазы. Кинетический механизм этой реакции относится к типу механизма с замещением фермента. Графики двойных обратных величин, построенные для каждого субстрата при разных концентрациях другого субстрата, имеют вид параллельных прямых. При изучении этой легко обратимой реакции как в прямом, так и в обратном направлениях результаты оказываются одинаковыми. Было исследовано также ингибирование процесса продуктами реакции с целью выяснить кинетическую значимость обоих возможных двойных комплексов. Оказалось, что обе кетокислоты строго конкурируют друг с другом и обычно не конкурируют с аминокислотами, и наоборот. Было также показано, что при высокой концентрации а-глутарата фермент образует тупиковый комплекс с этим субстратом. [c.147]

Обычный график зависимости активности фермента от концентрации субстрата — гипербола, асимптотически приближающаяся к Утах (рис. 8.11,Л), — Не соответствует кинетическому поведению ферментов, для которых характерны аллостериче-ские эффекты или явление субстратного ингибирования . В случае аллостерических ферментов условия определения выбирают так, чтобы в смеси присутствовали все необходимые активаторы, а концентрация субстрата была высокой. В этих условиях аллостерические эффекты часто не наблюдаются. Термин субстратное ингибирование означает, что фермент проявляет пониженную активность при высоких концентрациях субстрата. Если активность малатдегидрогеназы (см. выше) определи- [c.281]

Для определения сульфидов, цианидов и иодидов предложен энзиматический метод [80], основанный на ингибировании некоторыми ионами металлов каталитического действия энзима Р-фруктофуранозидазы (инвертазы) в реакциях гидролиза таких субстратов, как сахароза. Если в анализируемом растворе содержатся анионы, например сульфиды, образующие прочные комплексные соединения с этими ионами металлов, то эти анионы замещают энзим в координационной сфере металла, что приводит к уменьшению эффекта ингибирования. Этот метод позволяет определять (1—2,5)-10- М сульфидов. Скорость реакции контролируют по вращению плоскости поляризации. Калибровочный график для определения сульфидов необходимо строить ежедневно. [c.577]

Значения констант можно сравнивать только в том случае, если они устанавливались в точно соблюдаемых условиях, т. е. при определенной температуре, pH, продолжительности инкубации и реакции, концентрации фермента и субстрата. Так, например, в электрометрическом методе фермент инкубируют 30 мин при 25 °С, исходное значение pH 8,0 реакцию с ацетилхолином проводят в течение пОмин при концентрации последнего 7,3-10" лголь/л. Для определения значения I50 измеряют активность ингибитора при различных его концентрациях. По полученным результатам строят график, в котором процент угнетения (отношение ингибированного фермента к неингибированно-му) сопоставляют с отрицательным логарифмом концентрации ингибитора. Пример такой обработки опытных данных представлен на рис. 7. Истинное значение piso искажается побочными реакциями, протекающими в зависимо- сти от свойств ингибитора и фермента, а также условий опыта. Такими побочными реакциями, конкурирующими с ингибированием фермента, являются спонтанный гидролиз субстрата, гидролиз ингибитора, вызываемый содержащимися в ферменте фосфорилфосфа-тазами, адсорбция на стенках стеклянного сосуда при работе с очень разбавленными растворами, реакция с другими активными группами присутствующих белков. Кроме того, в случае слабого ингибитора одновременно протекают и угнетение, и реактивация фермента. Некоторые авторы считают, что для бимолекулярной реакции между ингибитором и ферментом [c.164]

Эта реакция также легко обратима. При ее исследовании в обоих направлениях установлено, что графики двойных обратных величин пересекаются, как того требует механизм с тройным комплексом, независимо от того, концентрация какого субстрата варьирует. В таких случаях, однако, необходимо дальнейшее уточнение относительных величин различных констант скоростей, поскольку пересечение кинетических прямых характерно также для механизма Теорелла —Чанса, т. е. для случая, когда время жизни тройного комплекса ничтожно мало с кинетической точки зрения, а реальное значение имеет только образование двух двойных комплексов— начальных фермент-субстратных комплексов для двух направлений реакции. Моррисон и Джеймс исключили возможность механизма Теорелла—Чанса для креатинкиназы, опираясь на полученные ими данные об ингибировании прямого й обратного процессов продуктами реакции. Они показали, что кажушиеся ингибиторные константы, характеризующие некоторые реакции конкурентного ингибирования продуктом (нуклеотид — нуклеотид или гуанидинсодержащее соединение — гуанидинсодержащее соединение), зависят от концентрации фиксированного субстрата. Этот результат согласуется с механизмом, при котором все реакции, кроме взаимопревращения двух центральных тройных комплексов, быстро достигают равновесия, но не согласуется с механизмом Теорелла — Чанса. [c.148]

Кинетическим доказательством механизма двухтактного замещения фермента мы считаем параллельность прямых на графиках двойных обратных величин. Можете ли Вы привести качественные аргументы в пользу обязательности такой формы графика Следует ли из них, что такие графики должны быть получены для обоих субстратов, и объясняют ли они причину этого явления При бесконкурентном ингибировании (предполагается, что оно возникает вследствие взаимодействия ингибитора с (ЕА), но не с Е и А порознь) и при ошибочной ориентации субстрата графики двойных обратных лвеличин также имеют вид прямых, параллельных прямым для нормальной системы. Как можно было бы объяснить это явление на основе Ваших аргументов [c.259]

Электростатическая модель мицеллярного эффекта при гидролизе моноэфиров фосфорной кислоты подтверждается также результатами опытов по ингибированию мицеллярного катализа [136, 139]. Показано, что катализ гидролиза дианионов динитрофе-нилфосфатов БЦТА подавляется низкими концентрациями многих солей (рис. 9). Простые электролиты, такие, как хлористый натрий, фосфат натрия, динатрийборат, мало влияют на каталитические свойства мицелл. Однако соли с объемистыми органическими анионами, такие, как п-толуолсульфонат натрия и натриевые соли арилкарбоновых и арилфосфорных кислот, сильно подавляют мицеллярный катализ БЦТА. По уравнению (14) и рис. 10 были рассчитаны константы ингибирования Ki [139], представленные в табл. 9. Линейность графиков на рис. 10 подтверждает предположение о конкурентном ингибировании, т. е. о вытеснении молекулы субстрата из мицелл при связывании ингибитора (разд. П1). [c.286]

В соответствии С уравнением (8.3) зависимость i/ln(So/s) от (s — s)/ /ln s(,/s) графически представляется прямой с наклоном, равным 1/F эта прямая отсекает на оси ординат отрезок, равный Km.IV. Таким образом, данная линейная анаморфоза подобна графику зависимости s/v от s при анализе начальных скоростей. Аналогичным образом могут быть построены линейные анаморфозы, соответствующие уравнениям (8.4) и (8.5) и сходные с графиками зависимости v от vis и ilv от 1/s соответственно. Во всех трех случаях можно в принципе определить параметры V и Км иа одной кинетической кривой. Чтобы это определение было надежным, необходимо, с одной стороны, использовать начальные концентрации субстрата s , заметно превышающие Км., и с другой — наблюдать за реакцией до тех пор, пока величина (Sq—s) не станет заметно больше, чем Км- Кроме того, чтобы применять подобные подходы, необходимо быть уверенным в том, что ингибирование продуктом реакции практически отсутствует. При измерении начальных скоростей ингибированием продуктом, как правило, можно пренебречь, если следить за реакцией на протяжении небольшого промежутка времени, когда концентрация продукта практически равна нулю. Если же за реакцией наблюдают длительное время, то исключить ингибирование продуктом уже не удается. Кроме joro, располагая единственной кинетической кривой, нельзя отличить замедление реакции, связанное с расходованием субстрата, от любого торможения процесса, обусловленного-конкурентным ингибированием накапливающимся продуктом. Об этом удивительном свойстве подобных линейных анаморфоз никогда не следует забывать. Подробнее данный вопрос будет рассмотрен в следующем разделе. [c.200]

На рис. 8.20 приведен типичный случай конкурентного ингибирования, представленный в форме графика Лайнуивера—Бэрка. Скорость реакции (р) измеряется при разных значениях концентрации 8 и при фиксированной концентрации ингибитора. Прямые, проведенные через экспериментальные точки, пересекаются в одной и той же точке на оси у. Длина отрезка, отсекаемого от оси у, равна это означает, что при бесконечно большой концентрации 8 (1/(81 = 0) у будет такой же, что и в отсутствие ингибитора. Однако длина отрезка, отсекаемого от оси. V (а эта величина определяет значение К ), в присутствии ингибитора уменьшается (— < — 1/ ). Таким образом, конкурентный ингибитор повышает кажущееся значение (А м) Для субстрата. Для простого конкурентного ингибирования длина отрезка, отсекаемого от оси х, будет равна [c.89]

Принципиальной особенностью системы с ингибированием избытком субстрата в проточном режиме является существование двух устойчивых стационарных состояний. Это следует из анализа уравнений (5.145). Рассмотрим его графическое решение (рис. 5.55). Прямые, параллельные оси S, представляют собой функции ц = onst = D. Пересечения этих прямых с графиком ц( дают значения представляющие собой корни уравнения (5.145). Из рисунка видно, что система может функционировать в трех принципиально разных режимах. [c.643]

Измерение скоростей катализа при разных концентрациях субстрата дает возможность отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном ингибировании на графике, где 1/Иотложена против 1/[5], прямая пересекает ось ординат в одной и той же точке независимо от присутствия ингибитора меняется только угол наклона прямой (рис. 6,17). Это показьюает, что при конкурентном ингибировании не изменяется. Особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что при достаточно высокой концентрации субстрата ингибирование может быть преодолено. В самом деле, субстрат и ингибитор конкурируют за один и тот же участок. При достаточно высокой концентрации субстрата почти все активные центры заняты субстратом и фермент проявляет полную активность. Увеличение угла наклона прямой на графике зависимости 1/Уот 1/[8] указывает на прочность связи конкурентного ингибитора. В присутствии конкурентного ингибитора уравнение (16) заменяется следующим [c.116]