Лиганд концентрация на сорбенте

Если названные обстоятельства не лимитируют концентрацию лигандов в сорбенте, то естественно, что с позиций полноты использования матрицы следует увеличивать эту концентрацию вплоть до максимума, обусловленного плотностью расположения активированных групп на матрице (для 4%-ной агарозы и ц/.люлозы — до 0,1 М). [c.401]

Подбор можно вести в пробирках, тем или иным способом оценивая эффект освобождения вещества из комплекса с сорбентом.. Для статической хроматографии такое освобождение должно быть полным уже при одном суспендировании сорбента с веществом в растворе конкурентного элюента. Для осуществления динамической хроматографии на колонке достаточно, чтобы равновесие сорбции искомого вещества заметно сдвинулось в пользу жидкой фазы. Этого обычно удается добиться, используя относительно небольшую концентрацию конкурирующего агента — того же порядка, что и концентрация лиганда на сорбенте, т. е. нередко менее 10 мМ. [c.407]

Однако кажущаяся простота метода и отсутствие у новичка представления о возможных трудностях, сопровождающих его применение на практике, могут привести к обескураживающим неудачам. Действительно, трудно заранее предугадать, какой аффинный лиганд полезнее выбрать — с высоким или низким сродством, какова наиболее благоприятная концентрация этого лиганда в сорбенте, какую роль должна играть матрица, какие носители подходят и какие не подходят для иммобилизации аффинного лиганда. Например, отлично зарекомендовавшие себя с точки зрения иммобилизации ферментов носители на основе кремнезема оказываются в ряде случаев совершенно непригодными для использования в аффинной хроматографии из-за высокой неспецифической сорбции. [c.5]

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

I, ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИГАНДА НА СОРБЕНТЕ [c.100]

С увеличением исходной концентрации белкового лиганда абсолютное количество связавшегося материала медленно увеличивается, но доля связывания снижается ввиду стерических помех, которые создают друг для друга крупные молекулы белка при связывании с близко расположенными активными центрами матрицы. Кроме того, излишне высокая исходная концентрация лиганда стимулирует повышенный уровень неспецифической сорбции, что снижает избирательность сорбента. [c.376]

При синтезе аффинного сорбента (если считать, что все его ком-поненты выбраны обоснованно) перед экспериментатором встают практические вопросы количественных соотношений, и в первую очередь задача выбора оптимальной концентрации (плотности пространственного расположения) лиганда на матрице. Для этого в описанных выше процедурах посадки лиганда он может варьировать соотношения количеств лиганда и матрицы, а также условия реакции, в частности ее продолжительность. Хотя подбор оптимальной концентрации лиганда в конце концов ведется эмпирически, имеет смысл провести некоторое общее рассмотрение этого вопроса, с тем чтобы прояснить хотя бы порядки величин, с которых следует начинать такой подбор в каждом конкретном случае. [c.400]

Нуклеиновые кислоты в качестве лигандов широко используются для очистки белков функционирование которых связано с образованием белково-нуклеиновых комплексов. Эти комплексы удерживаются в первую очередь действием электростатических сил, поэтому элюцию с таких сорбентов ведут повышением концентрации соли. [c.424]

В качестве модификаторов применяют вещества с комплексообразующими свойствами (лиганды), ионообменники, неорганические и полимерные сорбенты, хроматографические фазы, экстрагенты и др. Избирательность определений достигается не только подбором соответствующего модификатора, но и регулированием pH, концентрации реагентов, состава пасты, природы связующего. [c.486]

Различия второй категории связаны главным образом с тем, что реальные сорбенты не вполне соответствуют модели идеальной неполярной поверхности по нескольким причинам. Во-пер-вых, степень модификации силанольных групп может быть различной, и не всегда допустимо пренебрегать возможностью прямой сорбции на силикагелевой матрице. Так, в [97] указано, что концентрация силанольных групп на поверхности силикагеля составляет 8—9 мкмоль/м , в то время как из-за пространственных затруднений плотность модификации алкильными группами не превышает 4 мкмоль/м . Во-вторых, влияние может оказывать структура частично упорядоченного слоя органических лигандов. Этот слой не плоская неполярная поверхность, а скорее разрыхленная приповерхностная зона, заполненная, наряду с модифицирующими лигандами, молекулами растворителя. Способность молекул разделяемых веществ сорбироваться на ее поверхности либо внедряться между отдельными радикалами лигандов, очевидно, будет зависеть от структуры последних. К сожалению, явления такого рода плохо предсказуемы, так что целенаправленно создать обращенно-фазовый сорбент, отличающийся по селективности в желаемом направлении, нелегко. Исследования в этом направлении тем не менее проводятся. Остановимся на некоторых достигнутых результатах. [c.59]

Рис. 3.4. Емкость сорбента с иммобилизованным нуклеотидом (№-(-6-аминогексил)-5 -АМР—сефароза) в зависимости от концентрации лиганда [4].

Отсюда следует важный практический вывод для полноты связывания необходимо выполнение условия [L] К . При выборе концентрации лиганда в сорбенте надо опираться на значение константы диссоциации аффинного комплекса. Здесь следует проявлять осторожность в отнотиении использования значений Къ, известных из взаимодействия аффинных пар в растворе их сродство на сорбенте, как уже упоминалось, может быть слабее, а значение — соответственно больше. Тем не менее для оценки порядка величии эти цифры использовать можно. [c.400]

Снижение избирательности сорбента при выделении макромолекул после превышения некоторой критической концентрации лиганда (когда сорбент начинает действовать как неспецифический ионообменник) впервые описано Кальдероном и др. [16]. При выделении ацетилхолинэстеразы аффинный сорбент теряет свою специфичность, если концентрация лиганда возрастает от 0,15-10" до 1,6-10 моль/л. Критические концентрации лиганда составляют, следовательно, 10 моль/л, что соответствует расстоянию между ближайшими соседними молекулами лиганда, равному 100 А, если предполагается равномерное распределение молекул лиганда внутри геля в узлах кубической решетки. Понятно, что при концентрации < 10 з моль/л молекулы лиганда находятся на достаточно больших расстояниях друг от друга, чтобы предотвра- [c.80]

Изучение оптимальных условий сорбции предполагает, что аффинный лиганд присоединен к нерастворимому носителю с достаточно высокой пористостью и на достаточном расстоянии от его поверхности (разд. 5.1), чтобы сохранить даже после присоединения высокое сродство к выделяемому веществу (разд. 5.2). Емкость специфического сорбента определяется концентрацией доступных аффинных лигандов и их константами диссоциации пз комплекса с выделяемым веществом (рис. 3.3). В разд. 5.3 ул<е обсуждалась оптимальная концентрация им.мобнлизованного аффинного лиганда, которая должна была бы обеспечить достаточную емкость и одновременно позволить освобождаться выделяемому веществу из специфического комплекса с иммобилизованным аффинантом в достаточно мягких условиях, не приводя, однако, к неспецифической сорбции. Свойства пространственной группы, вводимой между аффинным лигандом и поверхностью нераство-рихмой матрицы [6], могут оказывать влияние на свойства сорбента, как и концентрация аффинного лиганда. Специфический сорбент должен быть приготовлен таким способом, чтобы все группы, способные к присоединению, были блокированы (разд. 8.4) и чтобы число групп, способных принимать участие в неспецифической сорбции, было минимальным (разд. 10.3). Однако особенно важно, чтобы все молекулы аффинного лиганда, которые не присоединились к носителю ковалентной связью, были тщательно отмыты (разд. 8.6). [c.258]

Исследование реакций комплексообразования. Определение величины заряда ионов в растворах. Определение состава и констант стойкости комплексных соединений. В литературе описаны несколько методов изучения комплексообразования в растворах с применением синтетических ионообменных сорбентов. Во всех случаях определяют поглощение исследуемого элемента М одинаковыми навесками ионообменников (катионитов и анионитов) из равных по объему порций растворов с переменной концентрацией лиганда Ь Опыты ведут при постоянной ионной силе растворов и при условии, что общее количество М значительно меньше обменной емкости взятой навески ионита. После установле-яия равновесия получают кривые поглощения, аналогичные приведенным на рис. 56. Математически обрабатывают такие кривые различными методами. Рассмотрим наиболее простые из них. [c.208]

В кач-ве комплексообразователей используют ионы Си +, Zn +, d +, Со= +, Fe + и нек-рые другие, комплексы к-рых лабильны. Подвижной фазой м. б. любая жидкость, координирующаяся слабее разделяемых соед., или газ. Сорбентами служат способные удерживать ионы металлов ионообменные смолы с фиксиров. лигандами аминокислотного или иминоднацетатного типа и катиониты. Статнч. обменная емкость С сорбента по монодентатным лигандам определяется концентрацией в нем металла См, координац. числом последнего X и дентатностью фиксиров. лиганда Y Сл = Си(Х - Y). [c.300]

Равновесие обратимой реакции связывания очищаемого вещества (Е) со спепифическим лигандом (L) в нервом приближении определяется соотнощением их концентраций (при условии равномерного распределения вещества по объему сорбента) и константой диссоциации (Кь) комплекса вещество—лиганд (EL) [Е Ь = A l [EL], Можно показать [Turkova, 19781, что если суммарная (исходная) молярная концентрация вещества в объеме геля Е ) заведомо меньше, чем концентрация лиганда, т. е. [Е, ] [1], то равновесная доля связанного с лигандом вещества ( l) с хорошей степенью приближения оценивается соотношением [EiMlE, ] = [Ь] Кь + [ I)- [c.400]

Как указывалось, большинство продажных сорбентов содержит лиганды в концентрации 10 —2-10 М (1—20 мкмоль/мл), а сорбенты на базе ультрагелей — до 8-10" М. [c.401]

Приступая к обсуждению влияния концентрации органического компонента иодвнжной фазы на величины удерживания, целесообразно более подробно остановиться на состоянии ал-кнлсиликагеля, находящегося в равновесии с бинарным водноорганическим растворителем. Уже из самых общих представлений ясно, что молекулы органического растворителя обладают больщим сродством к алкильным лигандам, чем вода. Поэтому следует ожидать их преимущественного концентрирования в приповерхностном слое, адсорбции на органических лигандах неподвижной фазы. При этом в зависимости от состава подвижной фазы и строения сорбента, вероятно, возможно образование как мономолекулярного слоя органического растворителя, так и более толстых слоев неподвижной фазы, состоящих из цепей органического лиганда, пропитанных молекулами органического компонента подвижной фазы. С другой стороны, если концентрация органического растворителя в подвижной фазе мала, сорбент ею не смачивается [350]. В этом легко может убедиться каждый, насыпав на поверхность воды щепотку сорбента. Ряд авторов высказали иредиоложение, что в таком случае радикалы органических лигандов плотно прижимаются к поверхности силикагелевой матрицы или даже образуют своего рода переплетения, микроскопические капельки на поверхности силикагеля. При увеличении концентрации органического компонента цепи алкильных лигандов постепенно распрямляются, слой их становится более рыхлым, пока, наконец, не достигается полное смачивание подвижной фазой. [c.90]

Образец (100 мкл) фермента (5 Е) и бычьего сывороточного альбумина (1,5 мг) наносили на колонку (50x5 мм), содержащую 1.0 г аффинного сорбента, разбавленного до необходимой концентрации лиганда сефарозой 4В. / — лактатдегидрогеназа из скелетных мышц кролика 2 — лактатдегидрогеназа из мышц сердца свиньи 3 — глицерокииаза. [c.25]

Хотя многие выведенные соотношения должны быть уточнены экспериментально, они уже сегодня полезны, поскольку указывают на аспекты, требующие от исследователя внимания. Аффинный сорбент с концентрацией связанного лиганда —Ю ммоль/л следует использовать только для выделения веществ, константы равновесия которых (с закрепленным аффинантом) 10 моль/л. Для систем с более высокими (менее благоприятными) константами равновесия следует использовать сорбенты с соответственно более высоким содержанием связанного аффинного лиганда. Однако на практике этому случаю сопутствуют многочисленные ограничения, которые рассматриваются в гл. 5. [c.34]

Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12] высказали возражения. Данн и Чейкен [7] ограничились случаями, когда [Е]//Сь мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента. Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь- Например, если константа связывания равна 10 моль/л, то рассчитанная константа скорости диссоциации комплекса ЕЬ должна быть очень мала ( 0,042 С ) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта. Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация — мономолекулярный процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях белковый ник настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта. [c.49]

Теоретически выведенная взаимосвязь между количеством сорбируемого фермента, концентрацией аффинного лиганда и константами равновесия лиганд — фермент рассмотрена в гл. 3. Из рис. 3.3 следует, что для систем с низким сродством Кь = = 10 2 моль/л) концентрация привязанного аффинного лиганда представляет собой критический параметр для получения эффективного сорбента. На рис. 5.6 показана аффинная хроматография глюкокиназы на 2-амино-2-дезокси-о-глюкопиранозо-N-(6-амино-гексаноил) —сефарозе при четырех концентрациях связанного аффинанта [15]. Видно, что оптимальная концентрация аффинного лиганда равна 3,75 мкмоль/г (рис. 5.6,6) при более низких концентрациях фермент не отделяется от неактивного материала, в то время как при более высоких концентрациях необходимо увеличить концентрацию глюкозы в элюате и при этом глюкокиназа выходит в большем объеме элюата. При концентрации 10 мкмоль/г глюкокиназа не может быть элюирована даже при высоких концентрациях глюкозы она может быть снята только пропусканием 0,5 М хлорида калия. [c.75]

Смотреть страницы где упоминается термин Лиганд концентрация на сорбенте: [c.379] [c.407] [c.90] [c.90] [c.90] [c.340] [c.366] [c.369] [c.376] [c.380] [c.401] [c.402] [c.404] [c.405] [c.409] [c.413] [c.429] [c.182] [c.158] [c.158] [c.158] [c.45]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология