Иммуноглобулины очистка

Очистка иммуноглобулинов класса М (IgM) Реактивы [c.316]

Определение классов и подкласс ов антител важно для выбора способа их очистки. Классы и подклассы моноклональных иммуноглобулинов, секретируемых специфическими гибридомами, определяют прямым методом ИФА (рис. 41). [c.322]

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

При иммунохимическом исследовании вирусов растений успешно использовались иммунизированные цыплята и яичный желток как источник антител, а не иммунная сыворотка. Этот метод позволяет в короткое время получать значительное количе--ство антител он облегчает очистку иммуноглобулинов IgG позволяет избежать кровопускание у животных [108]. [c.97]

Аффинная хроматография высокоспецифичный и эффективный метод выделения специфических белков. Вследствие того что молекулы большинства белков легко разрушаются при использовании для их выделения и очистки многих традиционных методов, применяемых в органической химии, таких, как возгонка и экстрагирование различными растворителями, биохимики вынуждены были разработать для этой цели специальные методы. Нередко удается выделить какой-нибудь один белок, присутствующий в смеси, содержащей несколько тысяч других биомолекул, в концентрации 10 -10 М. Один из таких методов, известный под названием аффинной хроматографии, сыграл решающую роль при выделении и очистке ряда ферментов, иммуноглобулинов и рецепторных белков. В основе метода лежит тот [c.163]

Очистка иммуноглобулинов и антител [c.238]

Получение сыворотки представляет собой лишь начальный этап приготовления нужного реагента. Для большинства методов необходима лишь иммуноглобулиновая фракция, остальные компоненты сыворотки могут быть отброшены. Это приводит к снижению отношения общего белка к антителам, уровня неспецифических реакций и к увеличению чувствительности метода. Процесс мечения антител флуорохромом, ферментом или изотопом, а также очистку методом аффинной хроматографии начинают с выделения иммуноглобулинов. [c.34]

IV. Антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и крысы. Для общих целей анти-IgG, получают путем иммунизации животных фракцией IgG, полученной в результате аффинной очистки на колонке с протеинА-сефарозой (разд. 10.6.1). Для удаления антител к другим классам иммуноглобулинов сыворотки сорбируют моноклональными антителами или сывороткой, лишенной IgG. [c.104]

Очистка иммуноглобулинов и субъединиц IgG [c.105]

Несмотря на сравнительную простоту аффинной очистки антител, обратная процедура, а именно очистка антигена на колонке с иммобилизованными антителами, была, как правило, неэффективной. Дело в том, что для получения специфической антисыворотки обычно требуется чистый антиген, а его легче очистить традиционными методами, чем при помощи колонки с иммобилизованными специфическими поликлональными иммуноглобулинами. Одна из причин неэффективности колоночной очистки в данном случае заключалась в том, что специфические антитела составляют весьма незначительную долю всех иммобилизованных иммуноглобулинов. [c.164]

Таким образом, улучшенные матрицы, наличие разнообразных колонок и увеличение их емкостей дают возможность исследователям в области иммунохимии использовать присущие ВЖХ высокую чувствительность, хорошее разрешение и быструю элюцию. В этой главе будут детально обсуждены три типа хроматографических разделений, используемых в нашей лаборатории для очистки иммуноглобулинов и изучения их структуры. Речь пойдет о методах ГП-ВЖХ, ОФ-ВЖХ и ГА-ВЖХ. [c.134]

В нашей лаборатории методы ВЖХ используют для очистки и изучения структуры и функции иммуноглобулинов. Ниже приведены детальные описания применяемых вариантов ВЖХ и примеры их использования. ГП-ВЖХ применяют для разделения легких и тяжелых цепей антител после восстановления и ал-килирования. Этот метод используют также для очистки фрагментов антител после их химического расщепления. ОФ-ВЖХ применяют для пептидного картирования антител. Мы обсудим в этой главе способы улучшения разделения пептидов и повышения чувствительности их детектирования, а также новый вариант очистки моноклональных антител в мягких условиях с помощью ГА-ВЖХ. Этот метод имеет ряд преимуществ, которые помогут повысить чистоту препаратов моноклональных антител. [c.139]

Таким образом можно получить сотни или тысячи гомогенных иммуноглобулинов. Очистка их производится при помощи аффинной хроматографии. Иммуноадсорбенты для этой цели готовятся введением нужного сахарного остатка в молекулы подходящих носителей—сефа-розы, бромацетилцеллюлозы и др. [c.103]

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят pH до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (pH 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500 g. Первый осадок содержит все -у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (pH 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 s. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксперимента по стоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.308]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

Гибридный белок САТ-кальцитонин [20] (табл. 4.11) был сконструирован так, чтобы его можно было очистить субстрат-аффинной хроматографией. Когда обнаружилось, что гибридный белок находится в нерастворимом состоянии, стало очевидным, что этот подход неприемлем. Другие гибридные белки, приведенные в табл. 4.11, были также сконструированы с расчетом на очистку с помощью аффинной хроматографии. Для выделения составного белка -галактозидаза-Х использовали -aминoфeнил- -D-тиoгaлaктoзид (субстратный аналог -галактозидазы [27]) и белок А, специфически связывающийся с фрагментом F иммуноглобулина G [28]. Эти гибридные белки, синтезируемые в клетках Е. oli, растворимы метод их очистки описан в разд. 4.4. [c.113]

Метод очень эффективно работает для всех антител класса IgG мыши, кроме подкласса IgGl. Эти последние антитела обладают очень низкой аффинностью по отношению к белку А. Поэтому для получения хорошего их выхода метод следует модифицировать. Очистка иммуноглобулинов других классов здесь не рассматривается, поскольку подавляющее большинство гибридом, получаемых в результате гипериммунизации и слияния, проводимых в соответствии с описанными методиками, продуцирует антитела класса IgG. Мы не советуем вам получать антитела нз асцитной жидкости (разд. 6.3.8), поскольку такие же количества антител, причем более чистых, могут быть получены прн использовании методов, описание которых приводится выше. [c.198]

Знание того, где находится фитохром в растении, конечно,, помогло бы нам понять механизм его действия, и для получения этой информации было использовано несколько методов. Самые подробные данные о распределении фитохрома на уровне световой микроскопии получены нами с помощью метода иммуноцитохимии— с использованием антител, синтезируемых в организме животного после введения ему в кровь чужеродного белка. Кролики, которым вводят выделенный из растительной ткани фитохром, синтезируют антифитохромный иммуноглобулин. Это вещество после очистки специфически связывается с фитохромоМ в срезах растительной ткани. Присутствие здесь иммуноглобулина можно выявить благодаря связыванию другого его конца с ферментом пероксидазой, при действии которого на субстрат образуется нерастворимый окрашенный продукт. Распределение фитохрома в молодых побегах ячменя, выясненное этим методом, показано на рис. 11.15. [c.349]

Создание эффективного метода отщепления остатка нироглу-таминовой кислоты решило проблему секвенирования белков, блокированных вследствие циклизации N-концевых Gin и Glu [136]. Поскольку благодаря реакции деблокирования , протекающей с высоким выходом, становится доступной а-амино-группа последующего аминокислотного остатка, реакцию циклизации следует рассматривать как удобный способ создания защитной группы на стадиях очистки белка. Снятие защиты осуществляют путем двукратной инкубации с пироглутамат-аминопептидазой печени крупного рогатого скота. Метод был впервые использован при анализе легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, а затем при анализе тяжелой цепи гемаг-глютинина вируса гриппа [181]. [c.72]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

При анализе методов, используемых для выделения клеточных рецепторов, обращает на себя внимание стремление к применению максимально щадящих методов на стадии элюции рецептора с сорбента. Так, применение сорбентов с иммобилизованными лактинами для очистки рецептора инсулина продиктовано прежде всего стремлением избежать воздействия на рецепторный белок растворов с низкими значениями pH, концентрированных растворов амидов (мочевина) или других денатурирующих белок веществ. В то же время в кислой среде (или с применением денатурирующих агентов) производится элюция с иммобилизованных лигандов (антигены или гаптены) различных по специфичности антител, не приводящая к их инактивации. Различие подходов к способам элюции клеточных рецепторов и антител (иммуноглобулины) с иммобилизованных лигандов, выбранных эмпирическим путем, связано с конформационнон лабильностью рецепторных белков. Так, для ряда изученных к настоящему времени рецепторов (например, рецептор для эпидермального фактора роста) характерны выраженные изменения конформации при переходе из нейтральной в слабокислую среду (см. гл. 3). [c.11]

Ионообменная хроматография и гель-фильтрация. Эти методы получили в настоящее время наибольщее распространение. Для ионообменной хроматографии, как правило, используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза) или ДЭЛЭ-сефадекс. Ионообмеини-ки уравновешивают буферными растворами низкой ионной силы (0,005—0,02 моль) при pH 7,2—8,2 с целью выделения IgG. В указанных условиях наименее заряженная часть молекул IgG не фиксируется на ионообменни-ке, в то время как другие иммуноглобулины и сывороточные белки связаны. Фракционирование можно проводить методом колоночной хроматографии или в объеме. С целью экономии ионообменника для очистки IgG целесообразно выделить первоначально из сыворотки общую глобулиновую фракцию осаждением сульфатом аммония при 50%-ном насыщении. [c.240]

При гуморальном ответе животного на эритроциты другого вида образуются IgM и IgG. Затем антиэритроцитарные антитела нагружают на эритроциты-мишени, которые при введении донору эритроцитов, вызывают образование антиглобулинов. Этот простой подход позволяет избежать очистки иммуноглобулинов и дает хорошие результаты. Например, введя кролику внутривенно 1 мл отмытых в физиологическом растворе эритроцитов барана (10%-ная суспензия, объем на объем), можно легко получить соответствующие антиэритроцитарные антитела. При взятии крови через 10 дней после первой инъекции главным образом получают IgM. Повторное введение антигена через 1 нед и 2 раза в неделю в течение последующих несколькнх недель с забором крови через 2—5 дней после последней инъекции преимущественно обеспечивает получение IgG. Сыворотки затем могут быть смешаны. [c.53]

Антисыворотки к иммуноглобулинам -могут быть получены и без предварительной очистки (см. разд. 3.2.3). Например, для получения антисыворотки к кроличьему IgM 0,5 мл IgM-фракцци свободной от комплемента сыворотки к эритроцитам барана 10 мин перемешивали с 5 мл 10%-ной (объем на объем) суспензии эритроцитов. Затем эритроциты 5 раз отмывали PBS, клетки смешивали с ПАФ и вводили в/м. Через 3 нед повторяли введение в три разные точки, а спустя [c.79]

При ЭТОМ достигается степень очистки, достаточная для большинства целей, -Кроме иммунизации. Увеличение объемов си-воротки и анионообменни ка существенно не сказывается на степени очистки и общем выходе иммуноглобулина. Для ус- пешного проведения процедуры выделения IgG необходимы антитела к цельной сыворотке соответствующих видор животных и контрольные антитела, к IgG. [c.107]

Исходным материалом для, очистки служит сыворотка больного миеломой. Предпочтительно отобрать образцы, в которых соответствующий изотип миеломного белка. при ИЭФ медленно перемещается к катоду, поскольку окончательной очистки достигают адсорбц 1ей и элюцией из анионообменни-ка в буферном, градиенте. Иммуноглобулины с низкой подвижностью при элюции в меньшей степени загрязнены молекулами, мигрирующими в -области. Для выделения IgD необходима е-аминокапроновая кислота, ( мг/мл) для предотвращения энзиматического. расщепления Ig данного изоти-iia, чувствительного к действию ферментов. [c.108]

Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]

Аналитическая колонка с гидроксиапатитом, предлагаемая фирмой Bio-Rad, весьма эффективна при получении свободного от протеаз препарата иммуноглобулинов из асцитной жидкости мышей, причем его выделение включает одну стадию очистки и продолжается всего 30 мин (Juarez-Salinas et al., 1984). Фракционирование иммуноглобулинов на этих и других матрицах [c.114]

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

Эту полную среду можно хранить при 4 °С до 6 недель. Одинаково пригодны и среды, npHroTOBviennbie нз 10-кратиого концентрата МСИД нлн порошка, однако исследователи, впервые начинающие работать с тканевой культурой, иногда предпочитают не зависеть от имеющейся у них воды. Лошадиная сыворотка дешевле, чем СПК, и тоже может быть использована с успехом, ио это затруднит определение антигенов и очистку антител из надосадочной жидкости из-за присутствия в такой сыворотке иммуноглобулинов. [c.318]

Ионообменная хроматография оказалась чрезвычайно эффективным методом очистки иммуноглобулинов (Peterson, Sober, 1956). Чаще всего используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭЛЭ-целлюлозу). Белки задерживаются анионообменником в результате ионных взаимодействий и могут быть легко элюированы с адсорбента при повышении ионной силы и (или) изменении pH в сторону их изоэлектрической точки. [c.59]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология