Белки мечение

В целом, несмотря на неясность некоторых аспектов поведения в живом организме белка, меченного при помощи бифункциональных комплексонов радиоактивными метками, накопленный опыт убедительно свидетельствует о перспективности этого направления химии комплексонов [28, 84, 86, 1008— 1011], [c.504]

II. Получение белков, меченных радиоактивным иодом [c.207]

Чтобы окончательно доказать, что заготовки белка, меченные радиоактивной серой, в рибосомах являются предшественниками растворимых белков клетки, опыты несколько видоизменялись. После 12 сек. контакта культуры с радиоактивным сульфатом добавлялся большой избыток нерадиоактивной серы и после дополнительных 30 сек. инкубации культура быстро охлаждалась до 0°, клетки разрушались и их содержимое фракционировалось в ультрацентрифуге. Результаты опыта представлены на рис. 148, В. [c.459]

Второй метод, при помощи которого можно изучать синтез белка в живых организмах или культурах тканей, основывается на использовании аминокислот или белков, меченных изотопами. [c.388]

Этот процесс (обновление аминокислотного состава) вероятно представляет одну из промежуточных фаз реакций синтеза белков заново. Вне обмена веществ нет ни синтеза, ни обновления белков клеток. Между тем иногда на основании результатов опытов с добавлением к отдельным выделенным из организма белкам, а также к препаратам денатурированных белков меченых аминокислот приходят к выводу, что обновление аминокислотного состава свойственно индивидуальным белкам, находящимся вне биологической системы. При этом смешивают процессы химического и физико-химического характера — реакции адсорбции, конденсации и другие реакции химического взаимодействия между белками и аминокислотами с процессами вклю- [c.431]

Установлено, что с помощью парентерального питания можно в течение продолжительного времени при отсутствии белков в пище поддерживать состояние азотистого равновесия в организме и даже создать условия для положительного азотистого баланса. Прн этом содержание белков в плазме крови сохраняется на обычном уровне. Опыты с парентеральным введением человеку и животным белков, меченных радиоактивной серой (3 ), радиоактивным йодом (J ) и другими изотопами (для получения меченых белков в организм вводят те нли иные меченые аминокислоты, а затем выделяют белки для получения меченных йодом белков плазму крови йодируют в присутствии J ), показали, что после внутривенного введения белков они через [c.432]

На рис. 2.2 показано, что метка была связана с оболочками фага. Большая же часть метки Р оказалась внутри инфицированных бактерий. В потомстве фага, образованном после инфицирования, было найдено примерно 30% исходной метки Р. А от исходного белка, меченного в фаговом потомстве было обнаружено всего лишь менее 1%. Этот эксперимент прямо показывает, что родительская фаговая ДНК проникает в бактерию и затем становится частью фагового потомства. Именно так должно происходить наследование генетического материала. [c.23]

Для заражения бактерий используют фаги с ДНК, меченной 32Р( ), и белком, меченным ) [c.24]

Белки, меченные флуоресцентными маркерами, изучают обычно методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, так как в этой системе подвижности меченых и немеченых белков практически одинаковы. [c.184]

Для регистрации положения в геле белков, меченных тритием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он находился в непосредственном контакте с радиоактивными белками в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит [c.113]

Чтобы изучить образование белков в динамике и установить, например, изменения белковых структур в процессе их хранения, можно ввести в органы или ткани предшественник белка, меченный тритием или углеродом " С, и с помощью радиоавтографии выявлять радиоактивные соединения. При световой и электронной микроскопии биологический материал обрабатывают с таким расчетом, чтобы получить тонкие или сверхтонкие срезы, которые затем покрывают подвижной ядерной эмульсией, как, например, эмульсия Ильфорсд Г5 или Л4 (1Иог5с1 Оз или Ь4) по методу Ларра и Дроза [52]. После удаления эмульсии местонахождение радиоактивных участков определяется по присутствию зерен восстановленного серебра, которые задерживают фотоны или электроны. - [c.128]

Изучение белков, меченых Fe, посредством этого метода показало, что подвижность их составных частей отлична от подвижности молекул в обычных кристаллах и жидкостях. О том же свидетельствуют исследования рэлеевского рассеяния мёссбауэ-ровского излучения (Гольданский). Конформациопная подвижность в белках сохраняется и при низких температурах. [c.140]

Кроме обычного окрашивания, белки, меченные радиоактивным изотопом, после разделения зональным электрофорезом можно выявлять радиоавтографически. Большое значение имеет также тот факт, что с помощью соответствующих субстратов можно непосредственно в поддерживающей среде тестировать ферментативную активность полученных белковых фракций. [c.12]

Известно более 40 производных аминокислот, при помощи которых можно определять Ы-концевые остатки аминокислот в пептидах и белках. Однако эти соединения редко идентифицируют методом жидкостной хроматографии обычно удовлетворяются качественным анализом при помощи тонкослойной хроматографии. При этом с целью облегчения детектирования стремятся использовать окрашенные флуоресцирующие или радиоактивно меченные реагенты. В качестве примера можно привести 3,5-динитрофенилизо йоцианат [32—34] и 4-дИметила-мино-3,5-динитрофенилизотиоцианат [32—35]. Много внимания было уделено вопросу применения в аналитической химии белка меченого иодбензол-п-сульфонилхлорида (пипсил-хлорида) [36, [c.384]

Как было показано Описи, Бойенсом и Мак-Коннеллом 157), изучение. юнокристаллов белков, меченных иминоксильными радикалами,. может дать уникальную информацию о структуре исследуемых молекул. Основные результаты были получены авторами на оксигемоглобине лошади с применением малеимидных спин-меток. [c.174]

Исследование методом ЭПР монокристаллов белков, меченных стабильными иминоксильными радикалами, позволяет находить некоторые элементы симметрии, возникающие тогда, когда люле-кула белка составлена из двух или более субъединиц. К числу таких элементов симметрии следует отнести парные оси вращения. Поскольку для белков характерно только левое направление закручивания спирали, центра симметрии и плоскостей зеркального отражения у белков быть не может. [c.174]

Гистограммы, полученные при измерении только радиоактивных зон, легче интерпретировать, чем гистограммы, полученные при разрезании всего слоя геля на участки шириной 1—2 мм. Это иллюстрируют рис. 5.4 и 5.5, где приведены электрофоретограммы белков, меченных Ш и С. [c.139]

Одно из первых сообщений о применении авторадиографии в электрофорезе на гелях принадлежит Фербенксу с сотр. [46], которые проводили разделение белков, меченных С, на дисковых электрофоретограммах. Гель в форме диска разрезали с использованием системы проволочек из нержавеющей стали. Срез геля помещали на влажную фильтровальную бумагу, накрывали пластиковой пленкой и подсущивали в аппарате для фильтрации под вакуумом. Были приняты меры, чтобы исключить усадку геля в процессе сушки, так как в противном случае получались ошибочные результаты. Высушенные срезы геля для получения авторадиограмм скрепляли с рентгеновской пленкой. [c.145]

Если указанные условия не соблюдаются, то для определения значения 5 можно воспользоваться косвенными методами. Мартин и Эймес [16] использовали в качестве маркеров ферменты с известными коэффициентами седиментации, Стэнворс с сотр. [17] — белки, меченные красителем, а Черлвуд [18] — белки, меченные радиоактивным изотопом. Если присутствие такого маркера мешает движению исследуемого компонента, его седиментацию можно наблюдать в отдельной контрольной пробирке. [c.69]

Запасные, коллоиднорастворимые белки зеленых частей растений обновляются значительно медленнее, чем конституционные белки. Меченый азот обнаруживается в составе конституционных белков в более ранние сроки, чем в составе запасных белков, что дает основание считать, что первоначальный синтез белка начинается с образования конституционных белков. [c.199]

Температурные зависимости / и ДГ. Их изучение дает информацию о характере подвижности мёссбауэровских ядер и свойствах их окружения. Важнейшее преимущество данного метода заключается в возможности определять также и амплитуды движений атомов. В этом состоит его отличие от других резонансных методов, где определяются лишь частотные характеристики движений. На рис. Х.20 приведены кривые температурной зависимости / Т) для препаратов белков, меченных изотопом Ге. Для увлажненных белков вероятность эффекта слабо меняется в области низких температур, однако резко падает при температурах, превышающих —(60-30) °С, без уширения ГР-линии. Уширение мёссбауэровских спектров наблюдается только при температурах выше — 20 °С на конечных участках кривой / (Т), где вероятность эффекта уже мала (см. рис. Х.19). Сухой белок характеризуется слабой температурной зависимостью фактора / и постоянной шириной ГР-линии, что характерно для колебаний ионов Ге в твердой матрице. Зависимость / от относительной влажности образца Р/Ре) носит пороговый характер, что свидетельствует о кооперативном характере конформационной подвижности водно-белкового комплекса при степени гидратации Р/Ре 0,4 (см. 4 гл. IX). [c.293]

Секретированная форма НА оказывается отличной от белка связывания мембраны дикого типа только в одном отношении — в скорости его гликозилирования. Добавка углевода к белкам происходит в две стадии. Как только образующийся белок появляется на открытой просвету потока стороне грубого эндоплазматического ретикулума, преформированные богатые сахарозой олигосахариды переносятся от липидного носителя к определенным аспарагиновым остаткам [13, 21]. Это первоначальное котрансляционное гли-козилирование кора является только первым шагом в тщательно разработанной программе реакций, которые происходят в грубом эндоплазматическом ретикулуме и позднее в аппарате Гольджи, где сахара упорядочены и добавлены к образующемуся белку [13, 26]. Во время биосинтеза НА переход от гликозилированной по кору молек5щы к полной молекуле можно наблюдать при анализе методом SDS-гель-электрофореза белка, меченного S-метионином, или меченных тритием предшественников сахаров в экспериментах с пульсовой меткой. Конечный состав олигосахаридных боковых цепей на завершенных белках штамма дикого типа и А -бел-ках оказывается одинаковым. Однако в противоположность белку связывания мембраны дикого типа, который быстро и относительно синхронно гликозилирован, популяция секреторных молекул становится терминально-гликозилированной через очень длительный период. Возможно, это различие в некоторой степени отражает относительную эффективность, с которой белки связывания мембраны и относящиеся к просвету потока белки изолируются в транспортные везикулы, перемещаемые от грубого эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи. [c.183]

Выявление белков с помощью флуориметрии. Полиакриламидный гель флуоресцирует при длинах волн возбуждающего света 280 или 340 нм. Близкие длины волн возбуждают флуоресценцию соответственно нативных белков (максимум испускания 340 нм) и белков, меченных дансилхлоридом или 8-анилино-1-нафталинсерной кислотой (АНС спектр испускания при 460—520 нм). И хотя максимум спектра флуоресценции геля находится при 415 нм, т. е, довольно далеко от максимального испускания флуоресценции как нативных, так и меченых белков, его широкая полоса в значительной степени перекрывает спектры флуоресценции белков. Для приготовления нефлуоресцирующего геля необходимо добавить к смеси мономеров ди-тиотреитол или заменить ТЕМЭД сульфитом [463]. [c.183]

I2.6A.L Отщепление по Эдману с применением меченого реагента, В литературе описано несколько методик, использование которых может существенно снизить расход образца, В одной из таких методик применяется радиоактивно меченный ФИТЦ [6, 8, 9, 27]. Следует работать только с чистым реагентом, так как примеси, присутствующие в исходном ФИТЦ, а также образующиеся в ходе отщепления, делают идентификацию ФТГ-производных аминокислот ненадежной. Уровень радиоактивного фона зависит также от того, насколько плотно подтянуты уплотнения клапанов и резьбовые соединения. Гораздо чище проходит анализ структуры пептидов и белков, меченных in vivo. Трудности, связанные с использованием метки в белках или реагентах, обсуждаются в работе [44]. [c.402]

Последующие процедуры лучше всего проводить в холодной комнате. Нерастворимый материал осаждают с помощью настольной центрифуги. Раствор вносят в колонку с L H-сефаро-зой. Скорость потока должна составлять 0,5 мл/мин. После нанесения образца колонку промывают десятикратным объемом (примерно 50 мл) L H-буфера. Если в пробе присутствуют белки, меченные то элюцию материала с колонки можно контролировать на сцинтилляционном счетчике. После промывания колонки с нее снимают адсорбированные гликопротеины с помощью 2%-ного а-метилманнозида и фракции с максимальной активностью объединяют. Полученный материал диализуют 3 ч против буфера для реассоциации (состав буфера см. в разд П1, Г). [c.152]

Фиксированные, отмытые от красителя и высушенные пластины гелей экспонировали с пленкой 5AR (Kodak). Для гелей с белками, меченными 8-метионином, флуорографическое усиление не использовали, так как это приводило к снижению чувствительности и потере разрешения пятен, соответствуюш.их отдельным белкам. [c.189]

Гели с белками, меченными иодом, фиксируют, промывают три раза в воде, высушивают и радиоавтографируют, применяя отражающие экраны для усиления сигнала. [c.495]

Рис. 6.7. Электрофорез вирусных РНК и белков, меченных радиоактивной меткой, как описано в разд. 7. а — вирус метили >[ Р]-ортофосфатом в течение 24 ч и из очищенных вирионов экстрагировали РНК б — ФЭК метили [ 5]-метионином в течение 30 мин на разных сроках после заражения вирусом чумы птиц (штамм 34/Росток). Клетки разрушали кипячением в содержа щем ДД -Na буфере для нанесения проб и анализировали белки электрофо резом в 15%-ном полиакриламидном геле. К — белки из незараженных клеток Цифры под остальными дорожками обозначают время (в часах) после зара жения, когда вносили [ З]-метионин

Рис. 8-7. Турбидиметрический иммунный анализ С-реактивного белка в сыворотке человека, основанный на активации фермента. Антитела против С-реактнв-ного белка, меченные с помощью 2 мкг -галактозидазы, инкубировали с С-ре-

Высокая чувствительность метода флюорографии позволяет в сочетании с авторадиографией производить сортировку пятен или полос в ПААГ по содержанию в них двух долгоживущих изотопов— и С. Таким образом можно обнаружить различия в составе двух сложных белковых смесей, например генетических вариантов. Белки одной смеси метят Н, а второй — С. Обе смеси объединяют и подвергают двумерному фракционированию в ПААГ по методу О Фаррелла (см. часть I). Пластинку можно высушить, импрегнировать сцинтиллятором и путем флюорографии зарегистрировать суммарную радиоактивность ( Н-)- С) на пленку Kodak XR-5 . С негатива удобно сделать контактный отпечаток — пятна радиоактивности будут белыми на темном поле. С того же высушенного геля путем авторадиографии на пленке Kodak NS-5T при комнатной температуре регистрируют практически только С. Накладывают вторую пленку на первую. Не закрытые черным белые пятна указывают белки, меченные [c.232]

С помощью Хлорамина Т за счет Na I в 0,1 н. НС1 при 0° можно иодировать анилин. Затем действием нитрита натрия аминогруппу анилина можно заменить на диазониевую группу, по которой иодированное производное анилина в щелочной среде присоединяется к белку. Меченный таким образом белок легко очистить гель-фильтрацией [Hayes, Goldstein, 1975]. [c.241]

Более изящное использование щелочной фосфатазы как метки продемонстрировано Дойлом и др. [3, 4]. В качестве модельного антигена авторы использовали оросому-коид из сыворотки крови человека, представляющий собой небольшой гликопротеин (молекулярный вес 41 ООО), который имеет отношение к различным злокачественным образованиям [4] и, по-видимому, связан с карциноэмбриональным антигеном. В этот белок вводили метку щелочной фосфатазы. В системе проходила конкурентная реакция между антителом к белку оросомукоида, иммобилизованным на поверхности кюветы, и белком, меченным ферментом. Через соответствующий промежуток времени кювету промывали и добавляли раствор субстрата-фенилфосфата, который под действием [c.59]

Чтобы выяснить, концентрируются ли вещества в везикула при конститутивном пути, вы заражаете клетки вирусом везикулярного стоматита (VSV) и следите за появлением вирусного G-белка. Ваша смелая идея заключается в том, чтобы сравнит концентрацию G-белка в полости стопок Г ольджи с его концентрацией в транспортных везикулах, не покрытых клатрином. Вн хотите измерить концентрацию G-белка, приготовив тонкие срезн клеток, инфицированных вирусом VSV, и проинкубировав их со специфическими антителами к G-белку, меченными частицам золота. Частички золота видны на электронных фотомикрографиях как маленькие черные пятнышки, поэтому довольно просто подсчитать их в полости транспортных везикул (как полностьи сформированных, так и отпочковывающихся) и в аппарате Г ольджи. Вы определяете концентрацию G-белка двумя способами 1) по числу частиц золота на поперечном срезе и 2) по числ) частиц золота на линейном участке мембраны. Эти результат представлены в табл. 8-5. [c.126]

Syne ho o us способен расти при температурах ниже оптимальной температуры роста, хотя и с меньшей скоростью. Электрофорез в геле клеточных белков, меченных с " С гидролизатом белка, из обработанных ХОЛОДОВЫМ и тепловым шоком клеток, обнаружил различия в уровнях синтеза ряда белков. Молекулярный вес индуцируемых холодом (10-22 0) полипептидов был определен как 74, 64.5, 23, 17 и 14.7 кДа. Изучение синтеза белков во времени показало прогрессирующую индукцию некоторых белков холодового шока ( SP) при 13 0. Тепловой шок вызвал немедленную репрессию синтеза большинства нешоковых белков. Результаты исследований показали, что фотосинтетическая активность и области критических температур у Syne ho o us зависят от температуры выращивания. Уменьшение потребления О2 колебалось в пределах изученной низкотемпературной области от 37% до 47%. Нри температуре [c.64]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология