Фракционирование ионообменников

При фракционировании белков методом ионообменной хроматографии большое внимание уделяют выбору ионообменника (природе матрицы и емкости ионита) и буферного раствора, при котором осуществляется сорбция белков (величине pH и ионной силы, природе буфера и буферной емкости). [c.108]

В связи с опасностью бактериального прорастания не следует оставлять колонку регенерированного, готового к фракционированию ионообменника при комнатной температуре. [c.208]

При обработке растворов, содержащих различные белки (с разными зарядами), может быть выгодным применение серии из двух колонок (рис. 9.45), содержащих ионообменники разного характера (например, один катионный и один анионный), с целью фракционирования белков. [c.447]

Способы набивки колонки, ее уравновешивания прокачкой исходного элюента, внесения препарата, а также варианты и методы осуществления элюции подробно описаны в хл. . Однако следует отметить некоторые особенности, присущие использованию ионообменников. Главная из них связана с возможностью изменения объема обменника (высоты его столба в колонке) при изменении pH и концентрации соли в ходе элюции, особенно для ионообменных сефадексов типов А-50 и С-50. В связи с этим использование адаптора может оказаться неуместным, так что препарат приходится вносить в открытую колонку. Поверхность ионообменника в таком случае иногда защищают от взмучивания слоем сефадекса G-25 толщиной около 5 мм или кружком фильтровальной бумаги (следует убедиться, что препарат пе сорбируется на нем). В ответственных случаях фракционирования препарат имеет смыс. г подслаивать под буфер, как было описано в гл. 3. Следует помнить, что ионообменные сефадексы типов А-50 и С-50 гораздо мягче, чем сам сефадекс G-50. Их следует набивать в колонку с теми же предосторожностями, что были описаны в гл. 4 для сефадекса G-100. [c.281]

Устройство приборов для хроматографии и осуществление самого эксперимента сравнительно просты. Выбрав подходящую систему ионного обмена и проведя рекомендованную обработку (регенерацию) ионообменника, при идентичных условиях элюирования (скорость потока, температура и т. д.) можно получать хорошо воспроизводимые хроматограммы. Благодаря этому фракционирование белков с помощью ионообменной хроматографии имеет широкое распространение. [c.23]

Для препаративного фракционирования рекомендуется использовать сферические ионообменники. Ими легче заполнять колонку, они быстро оседают при отмывании декантацией и обеспечивают постоянную скорость протекания раствора через колонку в отличие от волокнистых и гранулярных носителей, которые вызывают снижение скорости протекания в процессе хроматографии. [c.214]

Подготовка системы для градиентного элюирования. В качестве смесителя используют колбу на 0,5 л со стартовым буферным раствором (0,02 М фосфатный буфер pH 8,0). Резервуар, образующий замкнутую систему со смесителем, представляет собой сосуд объемом 1 л, заполненный О,ЗМ буферным раствором. Непрерывную подачу буферного раствора на колонку осуществляют с помощью насоса. Открыв выходное отверстие, понижают уровень буферного раствора в колонке до уровня геля. Затем на ионообменник аккуратно, стараясь не взмутить верхний слой геля, наносят фракционируемую сыворотку, которую предварительно в течение суток диализуют против стартового буферного раствора. Нанесенный образец смывают тремя порциями стартового буферного раствора по 2 мл и приступают к хроматографии. Для фракционирования 3 мл сы- [c.216]

Рис. 3.1 Б. Схема проточной гидравлической установки для фракционирования частиц ионообменника [7].

Иониты применяются в виде гранул определенного зернения. Требуемую величину зерна получают фракционированием продукта помола крупных зерен. Для использования в некоторых специальных целях иониты готовят в виде волокон или мембран. Иногда используют и жидкие ионообменники [1]. В качестве ионизующихся групп катиониты могут содержать сульфогруппы, карбоксильные группы или фенольный гидроксил аналогичные группы в анионитах представлены группами основного характера амино-, диметиламиногруппы и т. д. Катиониты, например, представляют [c.22]

В качестве стационарной фазы в ИОХ можно использовать любые ионообменные смолы (см. п. 3.2.2). На практике насадками хроматографических колонок чаще всего служат специально синтезированные и предварительно фракционированные по размерам ионообменные смолы для хроматографии (см. табл. 3.22-3.26). Иониты со слабокислотными, слабоосновными и хелатообразующими функциональными группами применяют для решения частных задач, в основном связанных с предварительным избирательным концентрированием отдельных компонентов из большого объема раствора. Неорганические ионообменники природного и синтетического происхождения не дали значимого толчка в развитии метода, найдя сравнительно ограниченное применение для селективного выделения отдельных компонентов или группового концентрирования [71, 72]. Основной причиной этого является плохая воспроизводимость результатов и замедленность кинетики ионного обмена. Учитывая, что для насадок хроматографических колонок важное значение имеет не только природа сорбентов, но и степень их дисперсности, налажен выпуск специальных ионообменных смол для хроматографии (табл. 3.66). [c.202]

На первых этапах для фракционирования ферментов применяли ионообменные смолы, такие как карбоксильную смолу, амберлит ШС-50 (форма ХЕ-64), дауэкс-50 (НН ), дауэкс-2 (С1 ), амберлит-Ш-4В (ацетат). Некоторые ферментные белки были удовлетворительно очищены при помощи этих соединений, особенно если они имели небольшой молекулярный вес и изо-электрическую точку в слабощелочной зоне. Однако со временем стало ясно, что смолы недостаточно эффективны для фракционирования и очистки большинства ферментов, и тогда были созданы ионообменники, представляющие собой химические производные целлюлозы, в которую вводились ионогенные радикалы различных типов. [c.152]

В начале, по-видимому, всегда целесообразно отделить заметную часть балластных белков путем фракционной денатурации прогреванием или осаждением в слабокислой среде. Наоборот, кристаллизацию выгоднее проводить на заключительных этапах очистки. Основными операциями, выполняемыми на средних стадиях, являются фракционирование органическими растворителями, нейтральными солями, адсорбцией или хроматографическим разделением на колонках, в том числе с применением ионообменников. Очень важно, по возможности, чередовать этапы таким образом, чтобы избежать операции диализа. Так, высаливание, удобное в качестве первого этапа, требует диализа, но фракционирование спиртом позволяет его избежать. Простого прибора для быстрого диализа больших объемов жидкостей пока еще не существует можно полагать, что из всех способов очистки диализ — самый медленный и неудобный. Его легче проводить в заключительных стадиях, когда вещества уже мало и объемы невелики. Во время диализа возможны значительные потери активности фермента. С большими объемами жидкостей неудобно работать и в колонках последние лучше использовать [c.155]

Г и н о д м а н Л. М. Хроматография белков на ионообменниках и фракционирование смесей, содержащих белки на колонках с сефадексом.— В сб. Современные методы в биохимии . М., Медицина , 1964. [c.347]

Поскольку белки являются амфолитами и могут содержать как положительно, так и отрицательно заряженные боковые группировки, оба типа ионообменников пригодны, в принципе, для их фракционирования. Однако анионообменники более эффективны для разделения кислых и нейтральных белков, ибо последние в широком интервале значений pH относительно богаты отрицательно заряженными группами. Напротив, для разделения основных белков удобнее катионообменники. [c.27]

Причиной различной способности белков вытеснять подвижные ионы может быть неодинаковое количество и природа заряженных групп в молекулах разных белков, а также влияние общих размеров и конфигурации белковой молекулы на прочность образующихся связей. Таким образом, уже на этой стадии происходит частичное фракционирование белковой смеси. Однако наиболее эффективным этапом разделения является следующая стадия процесса — элюция белков. Элюция достигается обычно введением раствора с высокой концентрацией солей (хлористого натрия, например). Ионы соли вытесняют связанные белки, причем в первую очередь элюируются белки, обладающие меньшим сродством к ионообменнику. В результате начальный эффект разделения белков резко усиливается. Наконец, можно еще больше усилить фракционирование, производя элюцию раствором с постепенно (или ступенчато) нарастающей концентрацией соли (градиентная элюция). Собирая элюат небольшими порциями, можно весьма полно разделить фракции. Для зтого широко применяют автоматические приемники элюата. [c.28]

Г и н о д м а н ЛТ М. Хроматография белков на ионообменниках и фракционирование смесей, содержащих белки, на колонках с сефадексом. — Сб. Современные методы в биохимии , стр. 73. Изд-во Медицина , 1964. Келлер С. и Р. Блок. Фракционирование белков с помощью адсорбции и ионного обмена. — Сб. Аналитические методы белковой химии , стр. 70. ИЛ, 1963. [c.194]

В силу всего сказаниого для усиошного хроматографического фракционирования крупных амфолитов, например, белков, предпочтительно использовать ионообменники малой емкости и до внесения препарата уравновешивать их растворами соли такой концентрации, которая гарантировала бы образование в основном не более чем двухточечных связей белков с обменником. [c.262]

Можно попробовать разделить все три аминокислоты и прп pH 6 на любом из двух ионообменников. Вопрос лишь в том, достаточно ли глицин отстанет от яаряжоиной одноименно с сорбентом и выходящей в свободном объеме колонки аминокислоты. Можно ожидать, что отставание окажется достаточным, во-первых, за счет дополнительного эффекта гель-фильтрации (нейтральный глицин легче входит внутрь гранул, чем одноименно заряженная аминокислота), а, во-вторых, за счет того, что каждый цвиттерион глицина будет все же иногда цепляться одним из своих зарядов за противоположные по знаку заряды неподвижных ионов обменника. Тем не менее создается впечатление (его можно проверить на опыте), что условия для фракционирования трех аминокислот в этом модельном эксперименте будут более благоприятными при pH 3,5 или pH 8,5. [c.264]

Далее следует сделать выбор между аниона- и катионообменни-ком. При фракционировании определенным образом заряженных молекул такой выбор не представляет труда. Например, очевидно, что олигонуклеотиды следует делить на анионообменнике, а заведомо щелочные белки, например гистоны,— на катпонообменнике. Для амфотерных молекул посредством выбора pH буфера можно задавать знак суммарного заряда и таким образом определять нужный тип ионообменника. Здесь решающим соображением может оказаться учет диапазона pH, в котором препарат (например, белок) сохраняет свою нативность, не склонен к агрегации или неспецифической сорбции. Если такой диапазон pH располагается по обе стороны от изоэлектрической точки очищаемого компонента исходной смеси, то выбор типа обменника может диктоваться оптимизацией условий разделения, как было пояснено выше, в разделе Хроматографический процесс . [c.287]

Эта техника имеет преимущества перед распределительной и адсорбционной хроматографией, когда она используется для фракционирования больших количеств материала, растворенного в воде. Очевидно, что основное использование ионообменной хроматографии состоит в выделении и фракционировании полинуклеотидов и нуклеотидов, но величины рКа гетероциклических оснований таковы, что в интервале pH 4—10 некоторые нуклеозиды могут нести по меньшей мере частичный заряд и, следовательно, могут быть разделены этим методом. Для ионообменника используют два основных типа подложки либо полистирол, либо целлюлозу, и оба типа широко использовались для разделения нуклеозидов. В ероятно, наиболее широко используется метод. [c.73]

ДЭАЭ-целлюлоза благодаря своей функциональной группе — диэтиламиноэтильному остатку — обладает свойствами слабого анионообменника. Ее используют главным образом для разделения природных высокомолекулярных полимеров, особенно чувствительных к резким изменениям pH и температуры, т. е. в первую очередь для фракционирования белков. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе отличается высокой разрешающей способностью. Этот ионообменник пригоден как для аналитического, так и- для препаративного фракционирования белков на колонках соответствующего размера. [c.204]

Подробный анализ процесса хроматографии нуклеиновых кислот и их продуктов гидролиза на ионообменнике был опубликован Коном [14, 22, 23], а также Собером и Петерсоном [81]. Рандерат впервые описал фракционирование низкомолекулярных осколков нуклеиновых кислот (нуклеиновых оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов) на эктеола [68, 69, 73] и на слоях ДЭАЭ [72, 73]. Он установил, что нуклеотиды можно разделить методом ионообменной ХТС значительно быстрее и лучше, чем при использовании других методов кроме того, метод ХТС значительно чувствительнее метода хроматографии на бумаге. [c.447]

Для оптимального фракционирования очень важно правильно рассчитать количество загружаемого в колонку ионообменника. В каждом конкретном случае рекомендуется в предварительных опытах определить оптимальные размеры колонки. Практика показьша-ет, что для получения хороших результатов высота колонки должна относиться к ее диаметру как 10 1. [c.218]

При соответствующих условиях ДЭАЭ-сефадекс связывает все белки сыворотки, за исключением фракции IgQ. Поэтому фракционирование белков сыворотки с помощью этого ионообменника очень удобно для выделения иммунохимически чистого IgG, а также полезно при дальнейшей очистке препаратов IgG, полученных другими способами. [c.218]

ХТС липидов на ионообменниках еще пока не описана. Можно полагать, что ионообменная ХТС может оказаться весьма полезной при фракционировании сильно полярных липидов. Для осуществления подобных разделений, вероятно, пригоден ионофорез в тонких слоях и хроматография и ионофорез в тонких слоях (см. стр. 32). Перспективна также хроматография на Т01ШИХ слоях мочевины или других веществ, способных образовать соединения включения. Вероятно, на слоях мочевины можно отделить неразвет- [c.180]

Новые перспективы в отношении эффективного предварительного фракционирования открывает колоночная хроматография на ионообменниках на основе целлюлозы и декстрана . [c.409]

В 1954 г. Петерсон и Собер [1] предложили ионообменники на основе целлюлозы, которые оказались очень эффективными при разделении белков, нуклеопротеидов, липоидов и других высокомолекулярных соединений, включая даже вирусы. Принципиальным преимуществом целлюлозных сорбентов по сравнению с ионообменными смолами является возможность фракционирования биологически активных объектов с сохранением их активности. Хроматография таких объектов на ионообменных смолах всегда сопровождается денатурационными явлениями, значительной необратимой сорбцией и в ряде случаев гидролитическими эффектами [2]. [c.181]

Недавно две фирмы выпустили на рынок ионообменный порошок для хроматографии в тонком слое. Рандерат [73] использовал продукт фирмы Serva-Entwi klungslabor . Пока нет данных об их особых свойствах ионообменников серии MN и об их применении для фракционирования продуктов расш епления нуклеиновых кислот. [c.447]

Для фракционирования белков используют ионообменники на основе целлюлозы, сшитого декстрана, агарозы с полиакрилатом, реже на основе полиакриламидных гелей. В отдельных случаях хорошие результаты дает хроматография на гидроксиа-патите тонкого зернения, а также в меньшей степени на силикате магния (флорисиле). [c.431]

Фракционирование элёктрофокусированием основывается, по-видимому, исключительно на различии в изоэлектрических точках, Большинство других методов используют различие в одном или нескольких иных свойствах, например растворимости, размерах, форме или заряде молекул. (Исключение составляют элюирование в градиенте pH на ионообменниках [119] и электродекантация [120].) Поскольку при разделении белков электрофокусированием используются различные свойства этих соединений, можно надеяться, что набор разделяемых компонентов в этом случае будет иным, чем при разделении другими методами. Иногда так и получается [30, 88, 94], но не в случае сходных белков, например изоферментов [25, 26, 32]. [c.337]

Ионообменная хроматох рафия. Белки, как и аминокислоты, можно фракционировать на колонках с ионообменными смолами. Особенно удобны ионообменники с гидрофильными боковыми цепями, например целлюлоза. Для очистки белков обычно используют ДЭАЭ-целлюлозу (анионообменник, образующийся в результате присоединения к целлюлозе диэтиламиноэтиль-ных групп) и КМ-целлюлозу (катионообменник, образующийся в результате присоедииения к целлюлозе карбоксиметильных групп). Фракционирование белковых смесей, нанесенных на колонки, осуществляется пропусканием через колонку буферных растворов с возрастающей ионной силой или ке растворов с возрастающей (или убывающей) величиной pH. Разрешающая способность таких колонок весьма высока. [c.80]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология