Карбоксипептидаза активный центр

Рис. 62. Схема активного центра карбоксипептидазы А (остаток Туг 198 на схеме не изображен) фермента, катализирующего гидролитическое отщепление С-концевого аминокислотного фрагмента от полипептидов. Фермент абсолютно специфичен к Ь-конфи-гурации отщепляемого аминокислотного остатка и резко преимущественно катализирует отщепление остатков гидрофобных аминокислот. Гидролиз в этом случае протекает по механизму электрофильного катализа и требует участия иона цинка — в белке какие-либо группы, способные выступать в роли электрофиль-ных катализаторов, отсутствуют. Ион цинка фиксирован в активном центре фермента путем координации тремя аминокислотными остатками — двумя остатками гистидина 1118-69 и Н18-196 и одним глутамат-ионом С1и-72. Четвертая координата (для ионов цинка характерна тетраэдрическая зр -конфигурация координационных связей) направлена в комплексе фермент — субстрат на карбонильную группу гидролизуемой пептидной связи. Фиксация С-концевой части гидролизуемого пептида в активном центре обеспечивается в первую очередь взаимодействием с двумя остатками аргинина — Aгg-145 и Arg-127 и кластером гидрофобных

Рис. "5. Расположение аминокислотных остат ков в активном центре карбоксипептидазы А со встроенным атомом цинка [1

На рис. 15.15 приведена структура протеолитического фермента карбоксипептидазы А. Полипептидная цепь этого фермента образована 307 аминокислотными остатками и содержит один ион цинка. В цепи имеется несколько а-спиральных участков, а также несколько искривленных участков складчатого слоя (около центра молекулы). Каталитически активный центр фермента расположен рядом с атомом цинка. Пространственная структура части молекулы лизоцима (этот фермент, обнаруженный в слезах и яичном белке, защищает организм от инфекций, гидролизуя полисахариды клеточных стенок бактерий) вместе с [c.445]

Аналогичная ситуация реализуется, по-видимому, также и в ферментативных реакциях. Взаимодействие с субстратом одной функциональной группы белка может быть усилено за счет участия в реакции какой-либо другой, рядом расположенной группы нуклеофильного или электрофильного характера. Так, например, при гидролизе пептидной связи на активном центре карбоксипептидазы А см. схему на стр. 19) нуклеофильная атака молекулой воды усилена за счет общеосновного катализа со стороны карбоксильной группы остатка 01и-270 (а возможно и под действием гидроксильной группы остатка Туг-248). Общекислотный катализ осуществляет, по-видимому, Туг-248. Кроме того, расщепление пептидной связи субстрата может быть существенно облегчено в результате электрофильной атаки атомом 2п. [c.65]

РИС. 7-3. Строение активного центра карбоксипептидазы А, содержащего связанный пептидный субстрат (по Липскому [44—46]). [c.115]

Теория индуцированного соответствия [108—ПО] предполагает, что подобные конформационные изменения, происходящие при связывании субстрата ферментом, могут играть важную роль в катализе. Последнее может иметь место, если конформационные изменения, индуцированные связыванием субстрата, влияют на относительную геометрию каталитических групп активного центра, подобно описанному выще случаю с карбоксипептидазой. Поскольку ясно, что каталитические группы в реагирующем фер-мент-субстратном комплексе должны находиться в оптимальных положениях, то в указанных выше случаях в нативных ферментах эти положения не оптимальны. Те же рассуждения приЛо-жимы и к геометрии связывающего центра, который в процессе связывания также должен подстраиваться для наилучшего соответствия субстрату. [c.516]

В отличие от карбоксипептидазы большая часть природных белков не содержит ионов металла в активном центре. Ионы металлов часто образуют с белками обратимые комплексы. Бычий сывороточный альбумин (БСА) связывает до 20 ионов переходных металлов на молекулу. В соответствии с данными фиг. 78 можно ожидать, что при физиологических pH происходит связывание с имидазолом или карбоксильными группами, расположенными благоприятно для образования комплексов, что, по-видимому, и имеет место в данном случае. Однако из фиг. 78 следует также, что единственная сульфгидрильная группа в БСА должна быть местом преимущественного связывания металла. Так, каждый третий ион меди, приходящийся на молекулу БСА, по-видимому, связывается с сульфгидрильной группой. На высокую специфичность связывания с ионами металлов указывает также возможность получения для целей рентгеноструктурного-анализа производных гемоглобина и миоглобина, содержащих тяжелые атомы. [c.414]

Рнс. 7. Связывание глицил-/.-тирозина (строение его молекулы показано жирно) в активном центре карбоксипептидазы А (сравни с рис. 5) [15] [c.20]

Карбоксипептидаза — это металлофермент, содержащий один атом цинка на молекулу белка. Карбоксипептидаза катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи в белках и олигопептидах и сложных эфиров а-оксикислот. Кинетический изотопный эффект растворителя равен 2 при гидролизе сложноэфирного субстрата О-(гранс-циннамоил)-ь-р-фениллактата и всего лишь 1,33+0,15 при гидролизе пептида Ы-(N-бeнзoилглицил)-L-фенилаланината [11]. По данным рентгеноструктурного анализа карбоксипептидаза представляет собой глобулярный белок, в котором содержится один атом цинка, координированный двумя остатками гистидина. Кроме того, в состав активного центра входят карбоксильная (01и-270), фенольная (Туг-248) и гуанидиновая (Aгg-145) группы. Последняя образует ионную [c.149]

Рассмотрим характер конформационных изменений, возникающих при комплексообразовании карбоксипептидазы А с субстратоподобным ингибитором [15]. В активном центре свободного фермента (см. рис. 5) имеется система водородных связей (пунктир), которая простирается от Aгg-145 через амидные связи полипептидной цепи (01и-155, А1а-154, 01п-249) и молекулу воды (она не указана на рис. 5) до фенольного гидроксила Туг-248. При контакте этого же фермента с квазисубстратом глицил- -тирозином (см. рис. 7) электростатическое взаимодействие свободной карбоксильной группы квазисубстрата с гуанидиновой группой Aгg-145 (пунктир) вызывает смещение последней на 2 А (по сравнению с ее положением в свободном ферменте). Более того, это смещение одного остатка влечет за собой нарушение всей системы водородных связей, что приводит к повороту боковой цепи Туг-248 с перемещением ее фенольного гидроксила на 12 А. В результате между ней и амидным атомом азота в молекуле квазисубстрата образуется водородная связь (пунктир на рис. 7). [c.24]

В случае карбоксипептидазы А аминокислотные остатки апофермента, как и в случае рибонуклеазы, обеспечивают отбор и нужную ориентацию субстрата относительно активного центра. Кроме того, специальные остатки аминокислот участвуют в связывании кофактора — иона цинка. [c.207]

Наличие предуготовленной для субстрата полости обнаружено рентгенографически и у других ферментов. При этом выявляются группы активного Рис. 6.8. Схема активного центра центра. Прямое подтверждение карбоксипептидазы идеи об индуцированном струк- [c.190]

Пенициллин имеет структурное сходство с конформацией субстрата, т, е. D-Ala-D-Ala фрагментом (рис. 12, 9), поэтому может занимать на активном центре карбоксипептидазы место, предназначенное для субстрата. Такое блокирование [c.426]

В качестве примера фермента, работающего с участием кофактора, на рис. 62 приведена схема активного центра карбоксипептидазы А — пищеварительного [c.205]

ПРОНАЗА КОМПЛЕКС, частично очищенная от балластных белков смесь протеолитических ферментов, продуцируемых штаммом Streptomy es griseus К-1 содержит эндопептидазы, аминопептидазы и карбоксипептидазы. Осн. компоненты П.к.-сериновые протеиназы А-Е (содержат в активном центре остаток серина). Ферменты П. к. стабилизируются добавлением Са " . Мол, массы компонентов П.к. 16-27 тыс. для протеиназ А, В, D, Е установлена первичная структура, а для А и В-пространств, строение. [c.101]

Взаимодействию фермента с субстратом предшествует сближение и ориентация субстрата по отношению к активному центру фермента. Затем образуются фермент-субстратные комплексы, реальное существование которых может быть зафиксировано различными способами. Наиболее наглядным и эффективным является метод рентгеноструктурного анализа. В качестве примера можно привести идентификацию фермент-субстратного комплекса карбоксипептидазы А и ее субстрата глицил-ь-тирозина. Метод дает возможность не только установить сам факт образования комплекса, но и определить типы связей. Более простым, но достаточно эффективным методом является спектральный анализ фермента и соответствующего фермент-субстратного комплекса. Таким образом, бьши, в частности, идентифицированы фермент-суб-стратные комплексы для ряда флавиновых ферментов. В последние годы широкое распространение получило применение синтетических субстратов, благодаря которым можно моделировать ряд стадий ферментативного процесса, в том числе и связанных с образованием фермент-субстратного комплекса. [c.69]

Приводимые иногда в литературе схемы гидролиза, в которых каталитический процесс обусловлен только воздействием на субстрат ионов металла, явно не соответствуют современному уровню знаний о механизмах гидролитических реакций и прямым рент-геноструктурньш данным, полученным в последнее время для карбоксипептидазы. Активный центр последней, изученный почти так же хорошо, как для а-химотрипсина, содержит в своем составе [c.255]

Наиболее полную информацию сг строении активных центров принесли рентгеновские исследования структуры кристаллических ферментов и их комплексов с субстратоподобными ингибиторами [18—20]. В результате для многих ферментов были получены трехмерные модели их молекулярной структуры при высоких разрешениях (порядка 2А). На рис. 7 показано встраивание молекулы квазисубстрата в активный центр карбоксипептидазы А. Для более глубокого понимания этой молекулярной структуры полезно сопоставить ее со схемой [c.19]

Обнаружено, что существенная для связывания карбоксильная группа субстрата образует солевой мостик с гуанидиновой группой аргинина-145, тем самым, а также предпочтительными положениями связывания боковых радикалов, приводя подлежащую расщеплению амидную связь в контакт с атомом 2п. Теперь единственными другими функциональными группами, близкими к этой амидной связи, являются карбоксильная группа глутаминовой кислоты-270, которая (как и аргинин) сдвигается на 0,2 нм по сравнению со свободным ферментом, и фенольный гидроксил тирозина-248. Последняя группа не является одной из пяти групп, которые, как полагают, обычно участвуют в ферментативном катализе. Имеются также химические доказательства важности тирозина в карбоксипептидазе. Примечательно наблюдение, что эта группа не содержится вблизи цинка активного центра нативного фермента. Связывание глицил-тирозина, однако, вызывает весьма существенный конформационный сдвиг, в процессе которого фенольная группа тирозина-248 сдвигается не менее, чем на 1,2 нм с поверхности белка к новому положению вблизи пептидной связи субстрата. В результате этого движения происходит закрывание углубления, в котором находится активный центр, так что последний, по-видимому, не находится более в равновесии с растворителем. [c.502]

Металлофермеиты характеризуются точной локализацией иона металла в активном центре, которая не меняется при замещении одного металла другим. В карбоксипептидазе особенно велика активность 2п и Со. В то же время по своим константам связывания металлы сохраняют порядок, обычный для модельных систем [c.413]

Этим функции белка как фермента или апофермента скорее всего не исчерпываются. Все рассмотренные ме-чанизмы предполагали достаточно статичное расположение функциональных групп белка в активном центре Это не совсем верно. Взаимодействие с субстратом нередко сопровождается изменением конформации белковой молекулы, и согласно теории, выдвинутой Кошландом, направленные конформационные изменения белка являются важным фак1чэром ферментативного превращения. В отдельных случаях такие изменения зарегистрированы с помощью рентгеноструктурного анализа. Например, карбоксипептидаза А была подвергнута рентгеноструктурному анализу как в отсутствие субстрата, так и в комплексе с глицил-1/-тирозином. Полость, в которой находится активный центр, существенно сужается при связывании этого субстрата, т.е, наблюдается отчет ливый конформационный переход. Кроме того, широко дискутируется и имеет в отдельных случаях убедительные подтверждения гипотеза, согласно которой фермент фиксирует субстрат в конс юрмации, существенно более близкой по своей геометрии к активированному комплексу реакции, чем конформация субстрата, преобладающая у несвязанных молекул. Это, естественно, должно приводить к снижению активационьюго барьера реакции и способствовать существенному ускорению превращения. [c.208]

Aj Требования, которым удовлетворяют активные центры ферментов. Активный центр фермента обычно представляет собой карман на поверхности фермента, выстланный боковыми цепями аминокислот, необходимыми для связьшания субстрата и катализа его химического превращения. Молекула карбоксипептидазы, последовательно отщепляющей С-концевые аминокислотные остатки от субстратов (пептидов), состоит из одной полипептидной цепи (307 аминокислотных остатков). Три главные каталитические группы в активном центре-это аргинин 145, тирозин 248 и глутаминовая кислота 270 (номер указывает положение аминокислоты в аминокислотной последовательности фермента). [c.269]

Такие направленные изменения в белках (белковая инженерия) стали важным инструментом для установления роли отдельных аминокислотных остатков в формировании пространственной структуры белка и выполнении им своих функций. В качестве примера можно привести результаты исследования роли остатка тирозина-248, входящего в активный центр карбоксипептидазы А (см. 6.1). После установления пространственной структуры этого фермента с помощью рентгеноструктурного анализа высказывалась точка зрения, что гидроксигруппа этого остатка принимает участие в подаче протона на атом азота гидролизуемой пептидной связи и одновременно в удалении протона от молекулы атакующей воды. Однако, когда методом сайт-специфичного мутагенеза была осуществлена замена этого остатка тирозина на фенилаланин, оказалось, что каталитичесюш свойства фермента практически не изменились. Таким образом, роль гидроксигруппы тирозина-248 в катализе не подтвердилась. [c.306]

Шульман н сотр. [ИЗ—115] исследовали активный центр карбоксипептидазы А путем измерения релаксации малых молекул, связанных с этим ферментом. Карбоксипептидаза является протео-литическим металлсодержащим ферментом, который катализирует расщепление С-концевой пептидной связи в пептидах и белках. Она имеет молекулярную массу 34600 и содержит 1 атом цинка на молекулу, который обусловливает каталитическую активность, но фермент остается активным при замене 20 + на ионы Мп + или Со2+ [116]. Кристаллическая структура фермента известна [117, 118]. С атомом металла координированы три белковых лиганда, и имеются свободные положения по меньшей мере еще для двух лигандов. Связывание растворителя (НгО) [ИЗ], ингибиторов [114] или фторид-иона [115] на активном центре Мп2+-фермента влияет на релаксацию связанных ядер не только потому, что белок имеет длинное время корреляции, но также вследствие наличия парамагнитного иона металла. Уширение резонансных сигналов растворителя было объяснено тем, что одна молекула воды связывается с ионом Мп2+. Как следует из измерения уширения пиков метильных или метиленовых протонов конкурирующих ингибиторов — индо-лилуксусной, г/7ег-бутилуксусной, бромуксусной и метоюсиуксус-ной кислот — и одновременного определения времен корреляции взаимодействия протонов ингибитора с металлом, релаксация определяется главным образом временем обмена комплекса белок — ингибитор. Используя известные константы Михаэлиса — Ментен и эти данные, можно определить константы скорости всех отдельных стадий реакции фермента с субстратом. [c.393]

В разд. 14.3.6 мы указывали на использование фторид-иона как метки активного центра карбоксипептидазы А. Из других ионов наибольшее применение для этой цели получил хлорид-ион [120— 122]. Ядро имеет спин Va и вследствие этого обладает квад-рупольным моментом (см. разд. 1.10). Как и для (см, [c.394]

Полоса поглощения 360 нм (s=2790 М- см ) неионизован-ной формы N-ацетил-З-нитротирозина смещается в слабо кислой среде в область 427 нм (е = 4100 М см" ), становясь при ионизации более интенсивной (рК = 7,0) изобестическая точка находится при 381 нм (б = 2200 М см" ). При обработке карбоксипептидазы 64-кратным молярным избытком ТНМ нитруются 6,7—7,1 из 19 остатков тирозина. Однако при 4-кратном молярном избытке нитрование идет лишь по одному остатку, при этом пептидазная активность снижается до 10%, а эстеразная возрастает до 170% [49]. При действии ТНМ в присутствии р-фенил-пропионата, ингибитора карбоксипептидазы, ферментативная активность не изменяется. На основании этого было сделано предположение об участии остатка тирозина в работе активного центра. [c.354]

Взаимодействие со свободным ферментом. В активных центрах многих ферментов присутствуют ионы металлов. Карбоксипептидаза и карбоангид-раза содержат ионы (или Со +), еполаза и фосфоглюкомутаза — ионы [c.181]

Хотя трудно ожидать, чтобы эти результаты были непосредственно применимы ко всем металл-белковым системам, они помогают объяснить структурные особенности, благодаря которым активные центры некоторых ферментов, таких, как карбоксипептидаза и карбоангидраза, могут связывать ионы металлов с весьма различными координационными свойствами. Например, тетраэдрически координированный ион 2п(П) в карбоксипептидазе легко замещается многими ионами переходных металлов [84, 85] (разд. 3.3.2), причем двумя из четырех лигандов являются атомы гистидиновых остатков [29, 67[. Хорошо известны изоструктур ные тетраэдрические комплексы Со(П) и 2п(И), поэтому легко представить себе замещение ионов 2п(П) на Со(И). Однако связывание иона Сс1(П) является довольно неожиданным, учитывая его большой ионный радиус и предпочтительно гексакоординацион-ную структуру комплексов [86], поскольку для сохранения структурной целостности белка необходима строго определенная взаимная ориентация аминокислотных остатков. Из данных табл. 4 следует, что углы между связью металл — азот и плоскостью имидазольного кольца в тетраэдрическом комплексе 2п(П) и октаэдрическом комплексе Сс1(И) различны, хотя кристаллические структуры соответствующих бис-(ь -гистидинато)металло-комплексов сходны. Простой тригонометрический расчет в этом случае показывает, что для обоих комплексов величины смещений [c.30]

Принципы, использованные при определении групп, образующих координационные связи в цистеинате цинка, могут быть применены для аналогичных целей и в случае белков. Карбоксипептидаза А — протеолитический металлсодержащий фермент — имеет в своем активном центре ион цинка, который может быть замещен различными двухвалентными ионами переходных металлов. Константы стабильности комплексов всех этих ионов с белком были определены. На фиг. 79 показана корреляция величин логарифмов констант стабильности для комплексов карбоксипептидазы и для комплексов ряда модельных соединений. Модельные соединения подобраны так. что они моделируют [c.411]

Смотреть страницы где упоминается термин Карбоксипептидаза активный центр: [c.345] [c.261] [c.17] [c.61] [c.325] [c.413] [c.561] [c.352] [c.142] [c.164] [c.283] [c.190] [c.411] [c.164] [c.207] [c.215] [c.223] [c.374] [c.369] [c.372] [c.31] [c.89]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология