Нуклеазы в выделении РНК

Нитрат стронция, выделение РНК 56 Ногохвостки 382 Номенклатура вирусов 487—493 Нуклеазы, выделение РНК 54 [c.582]

Полисахариды, в частности гликоген, слабо сорбируются на оксиапатите. Этим можно воспользоваться для существенной очистки НК в ходе их выделения от сопутствующего им гликогена (нередко встречающееся использование для этой цели амилазы рекомендовать нельзя — в ней всегда могут оказаться примеси нуклеаз). [c.244]

Экстракцию РНК из рибосом проводят методом фенольной депротеинизации. Процедуру выделения рекомендуется проводить в присутствии ингибиторов РНКаз, поскольку высокополимерные рибосомные РНК могут подвергаться расщеплению нуклеазами. [c.170]

Примером применения аффинной хроматографии для очистки ферментов может служить выделение стафилококковой нуклеазы (фермен- [c.161]

В-третьих, многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Часто задача состоит в том, чтобы выделить тот или иной биополимер в нативном, т.е. сохраняющем биологическую активность, состоянии. Между тем многие белки и высокополимерные нуклеиновые кислоты при умеренных температурах и незначительных изменениях pH среды подвержены необратимому изменению конформации — денатурации, которая обычно сопровождается потерей биологической активности — инактивацией. Кроме того, в клетках часто находятся ферменты, способные разрушать те или иные вещества. В первую очередь это относится к белкам и нуклеиновым кислотам, так как клетки обычно содержат ферменты, способные катализировать гидролиз этих биополимеров, — протеазы и нуклеазы. В неповрежденных клетках эти ферменты преимущественно сосредоточены в специальных гранулах — лизосомах. Однако при разрушении клеток или тканей, которое всегда предшествует началу работ по выделению интересующих исследователя веществ, лизосомы обычно разрушаются, ферменты выходят наружу, что приводит к быстрому разрушению биополимеров уже в исходной биомассе. [c.231]

Стафилококковая нуклеаза — фермент, исследованный с помощью аффинной хроматографии наиболее широко. Успешное выделение нуклеазы на сефарозе с присоединенным 3-(4-аминофе- [c.368]

Получение препаратов НК из растений, особенно из дифференцированных тканей, осложняется низким содержанием НК. при наличии высокоактивных нуклеаз, обилием углеводных компонентов, полифосфатов, вакуолей и трудностью разрушения клеточных оболочек. При выделении нуклеиновых кислот из растений нео бходимо уделять особое внимание ингибиции нуклеаз, полноте гомогенизации и очистке препарата от сопутствующих примесей. [c.53]

Этот признак — расщепление полимерного препарата до низкомолекулярных соединений под действием РНК-аз или ДНК-аз (нуклеаз, расщепляющих соответственно РНК и ДНК) — имеет решающее значение и при идентификации выделенного из клетки полимера как нуклеиновой кислоты другие характерные свойства препаратов нуклеиновых кислот — это ультрафиолетовое поглощение с максимумом около 260 ммк и присутствие фосфора и рибозы или 2-дезоксирибозы, что можно легко доказать соответствующими колориметрическими реакциями (обзоры — смЛ ). [c.29]

Проферменты протеаз и нуклеаз и ферменты поджелудочной железы быка были выделены, очищены и выкристаллизованы почти исключительно путем высаливания с помощью сульфата магния [14, 248]. На рис. 8 [248] схематически представлены условия, необходимые для разделения восьми белков, содержащихся в кислой вытяжке поджелудочной железы. Так как несколькими методами [14] было показано, что большинство выделенных белков" является гомогенным, становится очевидным, что высали-ваиие может служить превосходным (методом фракционирования. [c.56]

В простом случае, когда объектом поиска является мутантный фермент с измененной субстратной специфичностью, его можно отделить от остальных производных на колонке с иммобилизованным аналогом субстрата, который должен специфически распознаваться этим, но не исходным ферментом. Отбор с использованием ингибиторов, полученных на основе аналогов субстратов, был успешно применен, в частности, для мутантных производных нуклеазы стафилококков с целью изменения ее специфичности. Нуклеаза стафилококков является Са2+-зависи-мой фосфодиэстеразой, гидролизующей ДНК с небольшим предпочтением к остаткам тимидина на 5 -конце расщепляемой связи. Из клонотеки, содержащей мутагенизированный с помощью ПЦР ген нуклеазы, выделяли ферменты с повышенным сродством к иммобилизованным олигонуклеотидам, построенным из фосфоротиоатных аналогов тимидина или гуанидина. Такие производные олигонуклеотидов устойчивы к действию данной нуклеазы. Некоторые производные нуклеазы, выделенные с помощью этого метода на тимидиновом субстрате, обладали аналогичной удельной активностью, что и фермент дикого типа, тогда как удельная активность мутантных ферментов с повышенным сродством к олиго(С) была в 10 раз ниже. Одновременно проис- [c.346]

Нуклеозиды могут быть получены прямым гидролизом нуклеияовы.х кислот, минуя стадию выделения мононуклеотидов и именно этим методом они обычно получаются в препаративных целях. Для этого нуклеиновые кислоты подвергаются химическому или ферментативному гидролизу. Обычно их нагревают с концентрированным аммиаком 3—3,5 часа при 175—180°. Ферментативный гидролиз НК вызывают специальные ферменты, называемые нуклеазами. Ввиду неустойчивости дезоксирибозы и дезоксирибозидов при препаративном гидролчзе ДНК, с целью получения нуклеозидов успеха можно достигнуть только при ферментативном гидролизе. [c.190]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

Ряд примеров применения иммобилизованных ферментов в аффинной хроматографии приведен в гл. 11. В табл. 11.1 перечислены ферменты, функционирующие как аффииные лиганды при выделении ряда веществ. В разд. 11.3 обсуждается использование иммобилизованной нуклеазы для выделения меченых пептидов из ее ак- [c.436]

Первые прямые данные о перестройке ДНК в процессе развития В-клеток были получены в 1976 г. в экспериментах, в которых ДНК из ранних мышиных эмбрионов, неспособных к выработке антител, сравнивали с ДНК из клеток мышиной миеломы, вырабатывающих антитела. Эти два вида ДНК переваривали рестрикционной нуклеазой и полученные фрагменты гибридизо-вали с радиоактивными последовательностями ДНК, приготовленными путем копирования in vitro V- или С-последовательности молекул информационной РНК для L-цепей, выделенной из клеток миеломы (см. разд. 4.5.3). Как показали результаты этих опытов, специфические V- и С-кодирующие последовательности находились у эмбрионов в разных рестрикционных фрагментах ДНК, а в клетках миеломы-в одном и том же рестрикционном фрагменте (рис. 17-39). Таким образом, у зародыша, где гены иммуноглобулинов не экспрессируются, последовательности ДНК, кодирующие V- и С-области той или иной цепи, локализуются в различных участках генома между тем в клетке миеломы, где уже образуются цепи иммуноглобулинов, эти две последовательности соединены вместе. [c.37]

Примером фенольного метода получения является следующая схема выделения ДНК из Euglena gra ilis, разработанная Браверманом и др. [15]. Преимущество этого метода в том, что фенол сразу же останавливает действие нуклеаз, недостаток — незначительный выход ДНК (см. схему). [c.61]

Рядом последователей доказано, что после расслапвания суспензии центрифугированием на 3—4 слоя в верхнем водносолевом слое активность нуклеаз, ингибированная до этого фенолом, восстанавливается и может вызвать деградацию НК. Особенно опасны на данном этапе выделения следы нуклеаз. Нами было замечено, что добавление ДДС и особенно ПАСК создает надежную защиту НК от нуклеаз во всех случаях, в том числе в водной фазе. [c.65]

Для подавления активности нуклеаз применяют различные ингибиторы цитрат натрия, гепарин, поливинилсульфат натрия, натриевые соли фтора, ДДС, суспензию бентонита, ионы серебра, цинка и др. Среди этих ингибиторов наиболее широким спектром действия обладают ДДС, поливинилсульфат натрия и суспензия бентонита. При тотальном выделении препаратов НК применимы все три указанных ингибитора. [c.73]

Некоторые олигонуклеотиды наиболее удобно получать расщеплением соответствующих полимеров. Это относится к гомогенным олигорибонуклеотидам, легко получаемым кратковременным щелочным гидролизом соответствующих гомогенных полирибонуклеотидов, а также к олигорибонуклеотидам типа (Хр) Ур, которые легко получить, расщепляя продукт полимеризации ррХ и ррУ (под действием полинуклеотидфосфорилазы) нуклеазой, специфичной к остатку Ур. (Здесь X и V — остатки нуклеозидов.) Ряд ди-, три- и тетрануклеотидов может быть достаточно легко выделен из продуктов расщепления РНК под действием РНК-аз. [c.103]

Применение акриламидных гелей в аффинной хроматографии в настоящее время весьма ограниченно. Куатреказас [14] показал, что выделение относительно малой молекулы нуклеазы стафилококков можно проводить не только на сефарозе, но и на биогеле Р-300, однако для выделения больших молекул, например р-галактозидазы [84], этот гель мало пригоден из-за низкой пористости. [c.39]

Хотя на данном этапе методы химического гидролиза не позволяют сделать выбора между 3 —5 - и 2 —5 -межнуклеотидными связями, доказательства, по-видимому, исключительного присутствия 3 —5 -структуры были получены на основании исследований ферментативного гидролиза рибонуклеиновых кислот и простых нуклеотидных производных. Из различных источников был выделен ряд нуклеаз, которые катализируют гидролиз нуклеиновых кислот на более мелкие фрагменты. Панкреатическая рибонуклеаза [93] — один из группы ферментов, обнаруживающих высокую специфичность к рибонуклеиновым кислотам,— была тщательно изучена и дано объяснение механизма ее действия. Ранние исследования показали, что фермент действует по пиримидиннуклеозидным звеньям, так как крупные педиализуемые остатки после ферментативного расщепления рибонуклеиновой кислоты значительно обогащены пуринами [94] кроме того, выделяются пиримидиновые мононуклеотиды, но не обнаружено свободных пуриновых мононуклеотидов [75, 95, 96]. Дальнейшие исследования кислотного или щелочного гидролиза продуктов, полученных в результате последовательной обработки рибонуклеиновой кислоты рибонуклеазой и фосфомоноэстеразой предстательной железы, привели к заключению, что специфичность рибонуклеазы такова, что нуклеиновые кислоты расщепляются ею с образованием смеси пиримидиновых мононуклеотидов и пуриновых олигонуклеотидов, содержащих в качестве концевой единицы пиримидиновый нуклео-зид-2 (или 3 )-фосфат [75, 97]. [c.377]

РНК давала после сплавления и отжига пик, лежавший близко к пику ДНК, но не совпадавший с ним. В том же месте оказывается некоторое количество ДНК, которое обнаруживается по метке Р . Стало быть, промежуточный пик, несупщй двойную радиоактивность Р и С ", относится к гибридам ДНК—ИРНК. Ряд контрольных наблюдений показал, что это явление — специфическое связывание. Простое смешение ДНК фага и ИРНК ничего не давало. Необходим был нагрев и последующий отжиг . Замена ДНК фага Tj на ДНК фага Tj обнаружила нулевой эффект, т. е. показала специфичность связывания обоих полимеров. Хотя средний состав цепей ДНК у обоих фагов близок, все же гибридизации цепей не происходило. Интересно, что ни РНК-аза, ни ДНК-аза, ни оба фермента вместе не способны атаковать двойные гибридные спирали ДНК—ИРНК. Хесин использовал эту особенность для выделения ИРНК фага путем сплавления с гомологической ДНК и последующего гидролиза нуклеиновых кислот обеими нуклеазами. [c.472]

Единственная существенная проблема в описанном выше подходе к фрагментации РНК заключается в том, чтобы в каждом опыте получать одинаковые фрагменты. В случае рРНК дополнительную гарантию воспроизводимости фрагментации можно получить, действуя нуклеазами на целую рибосому (Сох, 1969). Было найдено, что при обработке рибосом ретикулоцитов кролика панкреатической РНК-азой теряется 20-30% рибосомной РНК, однако при этом не наблюдается заметного изменения коэффициента седиментации рибосом или их вида на электронных микрофотографиях. Размеры фрагментов РНК, выделенных после нуклеазной обработки рибосом, указывают на то, что в большой субъединице рибосомы имеется около 40, а в малой - примерно [c.154]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

Золотистый стафилококк Staphylo o us aureus) вырабатывает внеклеточный фермент, одинаковый по молекулярной массе с рибо-нуклеазой (около 16500), но имеюш,ий более широкую специфичность. Он способен расщеплять как РНК, так и ДНК. Последовательность аминокислот известна для препарата, выделенного из штамма V8. Мидоус и сотр. [21] описали спектры ЯМР на частоте 100 МГц для препарата из другого штамма, который, подобно рибонуклеазе, содержит 4 остатка Гис, в то время как в ферменте из штамма V8 их только три. В спектре наблюдались отдельные пики от протонов при С-2 гистидиновых остатков. Титрование дало те же результаты, что и для рибонуклеазы. Отличие от последней наблюдается лишь для одного из этих сигналов, который избирательно смещается в область слабого поля под влиянием ионов Са +, если имидазольное кольцо находится в незаряженном состоянии. Известно, что ионы Са + необходимы для проявления ферментативной активности. [c.385]

Чтобы понять природу процесса модификации, обеспечивающего защиту ДНК фага X от действия нуклеазы, необходимо прежде всего внести поправку в то упрощенное рассмотрение химии ДНК, которое проводилось в предыдущих главах. Действительно, до сих пор мы считали, что в полинуклеотидной цепи ДНК встречаются только четыре основания аденин, гуанин, тимин и цитозин (за исключением особого случая ДНК Т-четных фагов, где вместо цитозина содержится оксиметилцитозин). Однако аналитические исследования Чаргаффа и Хочкисса, проведенные в конце сороковых годов, показали, что ДНК, выделенные из самых различных источников, содержат также небольшое количество других. [c.370]

Чувствительность РНК к нуклеазам — явление обычное, а в случае вирусных РНК, соответствуюш,их по размерам РНК ВТМ, когда для инактивации РНК достаточно разрыва лишь одной связи на 6400 нуклеотидов, присутствие даже следовых количеств нуклеаз или фосфоди-эстераз может сыграть решающую роль в том, насколько успешными окажутся опыты с не защищенной белком вирусной РНК. Для устранения этой опасности были предложены различные методы. В результате предварительной обработки ВТМ комплексообразующими соединениями (например, в результате инкубации с цитратом или ЭДТА) происходит освобождение вируса главным образом от таких нуклеаз, которые обычно адсорбируются на его поверхности. Более широкое распространение получило применение в процессе выделения РНК ингибиторов нуклеаз. Бентонит, представляющий собой поли-кислотную глину, является, по-видимому, по крайней мере таким же эффективным ингибитором, как и другие ноликислотные минералы или полимеры, предложенные позже [142, 455]. Суспензию промытого и отмученного бентонита можно добавлять во время фенольной экстракции до 10—30% (относительно веса вируса). Мелкие частицы бентонита остаются суснендированными в водной фазе, однако от них можно избавиться с помощью высокоскоростного центрифугирования раствора РНК после частичного или полного удаления этилового спирта. [c.58]

Трудности, связанные с выделением такого рода ферментов в свободном от нуклеаз виде, впервые были преодолены Харуной и Спигелманом в 1965 г. [186, 187, 464]. (Освобождение от нуклеаз весьма существенно, так как они вызывают деградацию продукта.) После этого, наконец, стало возможным наблюдать репликацию вирусной РНК in vitro и выделить РНК, принадлежащую потомству. Оказалось, что по своим физическим и химическим свойствам она не отличается от родительской РНК, использованной в качестве матрицы. Но самое важное заключалось в том, что вновь синтезированная РНК обладала инфекционностью (фиг. 58). Теперь уже ясно, что ни (—)-цепь, ни двухцепочечная репликативная форма [c.238]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология