Дисульфидных групп определение в белках

Структура рибонуклеазы. После того как Сэнгер разработал методы определения последовательности расположения аминокислот в белковой молекуле, другие исследователи также приступили к изучению более крупных молекул белка. Мур и Штейн и их сотрудники в 1960 году определили строение фермента рибонуклеазы. Этот белок с молекулярным весом 13 700 содержит 124 аминокислотных остатка в одной цепочке. Свернутая кольцом цепочка соединена в четырех местах дисульфидными группами цистина так, как эт показано на рис. 218. Последовательность аминокислот была определена и для некоторых полипептидов, обладающих свойствами гормонов был изучен также белок вируса табачной мозаики, содержащий 158 аминокислотных остатков. [c.319]

Дисульфидные группы выполняют важные функции по поддержанию нативной конформации белковой молекулы. Локализация положений дисульфидных связей является обязательным этапом при определении первичной структуры белков. [c.75]

Восстановление дисульфидных групп. Восстановление дисульфидных связей осуществляется в нейтральной или слабощелочной среде с помощью избытка какого-либо тиосоединения (цистеина, глютатиона, р-меркаптоэтанола и т. п.). Реакция максимально специфична и легко обратима за ее ходом можно следить путем определения числа ЗН-групп, возникающих в белке, или количества израсходованного тиосоединения. [c.66]

Для определення числа дисульфидных связей в белке требуется 1) восстановить дисульфидные связн до меркаптогрупп, 2) получить производные этих групп с ДТНБ, 3) провести гидролиз пептидных связей, 4) измерить количество образовавшегося производного ДТНБ. б) Каким еще операциям следует подвергнуть белок для того, чтобы точно определить число дисульфидных связей в нем в) Как это можно осуществить [c.417]

Дисульфидных групп определение в белках. Определение дисульфида в белках проводят с целью установления их структуры. Дисульфидные группы переводят в тиолы, которые титруют раствором нитрата серебра, используя для установления конечной точки титрования сульфидсеребряный электрод 94-16 и электрод сравнения 90-02. [c.36]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ ГРУПП В БЕЛКАХ Принцип метода [c.228]

Весьма ценной разновидностью обычной тонкослойной или бумажной хроматографии является диагональная хроматография. Сначала нанесенный материал хроматографируют в одном направлении, затем в тонком слое на пластинке или бумаге проводят определенную химическую реакцию, после чего осуществляют разделение в другом направлении. Немодифицированные соединения располагаются по диагонали пластинки, тогда как продукты реакции оказываются смещенными по отношению к ней. Этим методом исследовали фотохимические [149] и другие [147] реакции флавинов. Аналогичный диагональный электрофорез применялся для идентификации пар —8Н-групп, образующих в белках дисульфидные мостики [150]. Пептидные фрагменты, содержащие 8—8-мостики, разделяли с помощью электрофореза на бумаге, затем обрабатывали бумагу парами надмуравьиной кислоты, разрывающей мостики [уравнение (2-20)], и после электрофореза в перпендикулярном направлении опрыскивали бумагу нингидрином. Пятна, расположенные вне диагонали, соответствовали фрагментам, которые участвовали в образовании 8—8-мостиков. По положению пятен подбирали [c.180]

Под четвертичной структурой понимают построение олигомерного белка из определенного комплекса нескольких полипептидных цепей. Ассоциация двух или нескольких полипептидных цепей происходит под действием межмолекулярных взаимодействий между полярными, ионизируемыми и неполярными боковыми группами посредством диполь-дипольных взаимодействий, водородных связей, гидрофобных взаимодействий и образования ионных пар. В исключительных случаях четвертичная структура также стабилизируется дисульфидными мостиками. [c.386]

Каждый белок строится из своего набора аминокислот, остатки которых располагаются в полипептидной цепи в строго определенной последовательности. Так формируется молекула или первичная структура белка, специфичная для каждого вида организмов. Фрагменты такой молекулы взаимодействуют между собой, образуя водородные связи, в результате чего цепочечная молекула скручивается в спираль. Каждый виток спирали содержит нецелочисленное количество остатков, также связанных между собой, что делает неповторимой пространственную структуру спирали и придает устойчивость всей системе. Особенности скручивания цепей определяют вторичную структуру белка. Полипептидные цепи белка могут взаимодействовать не только за счет водородных связей. В сшивании и скручивании молекулы участвуют еще и амидные связи, дисульфидные мостики, связи между радикалами, поскольку радикалы могут включать самые разные функциональные группы. [c.434]

Применение боргидрида натрия NaBH4 для этой цели имеет то Преимущество, что его избыток легко удалить, добавив кислоту и ацетон [578]. Харрап и Грюэн [563] проводили восстановление боргидридом натрия при определений дисульфидных групп в белках, взяв в качестве индикаторного электрода AgjS-мембранный электрод (Орион 94-16). [c.194]

Дисульфидные связи можно разрывать гомолитически, с помощью электрофильной или нуклеофильной атаки и окислением [14]. Для определения первичной структуры белков наибольщее значение имеют два последних метода. Например, обработка белка больщим избытком тиола, таким как этантиол или 1,4-дитио-треит, часто в присутствии гидрохлорида гуанидина, переводит дисульфидные группы белка в тиольиые группы, как показано на [c.263]

Применение. В качестве специфического реактива восстановительного рас- щепления дисульфидных мостиков, для стабилизации и регенерации сульфгидрильных групп, В качестве добавки к секвенатррным растворам, повышающей стабильность введенной пробы и способствующей последующему расщеплению дисульфидных связей [2]. Как активатор креатинкиназы в сыворотке крови и как реактив для количественного определения креатинфосфокиназы [3, 4] и расщепления дисульфидных связей в кератине [5], Восстанавливает дисуль-фидные связи в пептидах и белках в жидком аммиаке без каких-либо обна руживаемых побочных реакций [6]. [c.143]

Эту методику можно использовать для определения дисульфидов в белках после предварительного расщепления 5 мл 7%-ного белкового раствора раствором (20 мл), содержащим 0,005% пепсина и 0,05% НС1. После расщепления в течение 1 час при 24 10 мл кипятят в течение 2 час с обратным холодильником в присутствии 2 6 УИ НС1. Сульфгидрильные группы, содержащиеся в неденатурированном белке, в процессе гидролиза окисляются до дисульфидов. Для нативного белка конечная точка соответствует сумме половины содержания сульфгидрилов и всего количества дисульфидов. Содержание —8Н в неденатурированном белке можно определить меркури-метрическим титрованием на вращающемся платиновом электроде. Этот метод успешно применялся для определения дисульфидных групп в нормальной и патологической сыворотках крови и их альбуминовых и глобулиновых фракциях. [c.393]

По-видимому, определенное биологическое значение может иметь и перенос гидридных ионов Н . Этот перенос был постулирован рядом авторов для объяснения особенностей реакции между сульфгидрильными группами белков и красителями, содержащими дисульфидные группы. Предполагается, что перенос электрона из одной точки белковой молекулы в другую совершается по механизму, аналогичному известному механизму Гротгуса, причем фактически по поверхности белковой частицы перемещается гидридный ион. Схема (рис. 4), заимствованная из работы Клотца с сотрудниками [1], поясняет этот механизм. Группа 5Н белка отдает гидридный ион соседней молекуле воды, входящей в состав гид-ратной оболочки белка, одновременно эта молекула отдает ион Н следующей, и так до тех пор, пока Н не присоединится к дисульфидной группе. В результате получается новая сульфидная группа и отрицательно заряженный ион серы. [c.62]

Существенным недостатком этой реакции является то обстоятельство, что ряд белков не выдерживает подоб1 ой обработки, денатурируется и выпадает в осадок даже тогда, когда еще не достигнуто полное дезаминирование. В этом случае количественное определение аминогрупп, равно как и изучение влияния дезаминирования белка на его биологическую активность становится невозможным. Примером таких белков может быть сывороточный альбумин. Вместе с тем при дезаминировании белков в реакцию могут вступать не только аминогруппы, но и индольные, имидазольные, гуанидиновые и дисульфидные группы. Некоторые авторы отмечали также и окисление сульфгидрильных групп. Поэтому весьма вероятно, что денатурация белка связана со вторичными реакциями азотистой кислоты с перечисленными группировками. [c.71]

Полярографический метод, основанный на измерении высоты каталитических волн, был предложен также для определения цистина в гидролизатах белка б°-збз цистина и белка в моче , белка в цереброспинальной жидкости , белка в инсулинезее, 367 дисульфидных и сульфгидрильных групп в природных веществах , белков в элюате после хроматографирования белковых препаратов вэ. Пенициллин в свежеприготовленных растворах (в аммиачно-кобальтовом буфере) не дает каталитической волны, но через некоторое время каталитическая волна появляется . 371 Бензилпенициллин восстанавливается полярографически при рН=4,5, образуя две волны . [c.53]

Вместе с тем число определяемых групп зависит и от природы денатурирующего агента. Так, при тепловой денатурации яичного альбумина в коагулированном белке удается определить только половину SH-rpynn, тогда как мочевина и солянокислый гуанидин освобождают соответственно 80 и 100% тиоловых групп. Следовательно, для оценки количества скрытых SH-rpynn необходимо правильно подобрать метод определения и тип денатурирующего агента. Тем не менее в результате этих многочисленных исследований удалось не только доказать, что в денатурированном белке обнаруживается больше сульфгидрильных групп по сравнению с нативным, но и оценить количество замаскированных групп для ряда белков. Аналогичные данные были получены и для дисульфидных групп белков. [c.189]

ДО полного изменения в расположении пептидных цепей. Развертывание пептидных цепей при денатурации подтверждается тем, что денатурированные белки дают более интенсивные цветные реакции, чем нативные белки. Это было впервые установлено для реакций на сульфгидрильные группы цистеина и на дисульфидные группы цистина [136]. Реакция с нитропуссидом, титрование железосинеродистым калием [39], ацетилирование [137] и полярография [138] — все эти методы определения сульфгидрильных и дисульфидных групп показали, что число этих групп в денатурированных белках больше, чем в тех же белках, находящихся в нативном состоянии. Денатурированные белки дают также более интенсивные цветные реакции на тирозин с фосфорномолибденовой кислотой [139, 140] и с диазореактивом [141], а на аргинин с реактивом Сакагуши [142] и присоединяют большие количества иода [143]. В то время как в нативном лакто-глобулине только 12 -аминогрупп лизина реагируют с динитрофторбензолом, в денатурированном лактоглобулине эту реакцию дает 31 е-аминогруппа, т. е. все содержащиеся в нем е-аминогруппы [144]. Таким образом, все приведенные данные подтверждают ту точку зрения, что при денатурации в связи с развертыванием пептидных цепей становятся доступными те активные группы, которые в нативных белках недоступны для соответствующих реактивов. Подобным же образом можно объяснить меньшую устойчивость ряда денатурированных белков по отношению к действию трипсина. Как известно, многие денатурированные белки гораздо легче расщепляются трипсином, чем те же самые белки в нативном состоянии. Это можно рассматривать как следствие того, что при денатурации разрываются связи, тесно удерживающие пептидные цепи друг около друга, и обнажаются те пункты, на которые может воздействовать фермент [146, 147]. Можно полагать, что трипсин, гидролизуя (хотя и медленно) нативные белки, гидролизует, в сущности, содержащиеся в них следы денатурированных белков. При этом процессе должно происходить непрерывное нарушение равновесия в системе нативный белок—денатурированный белок и смещение этого равновесия в правую сторону. [c.149]

Основными способами залечивания радиационных повреждений является ренативация частично инактивированных ферментов, ресинтез и замена денатурированных белков и других биологически важных молекул. Для возобновления клеточного цикла существенно восстановление дисульфидных групп белков. Устранению последствий облучения благоприятствует определенное сочетание условий культивирования клеток. Восстановлению клеток способствует их экспонирование на "голодных" средах, тормозящих возобновление деления, и условия оптимальные для метаболизма (температура, 0 и др. ). Противоречивые на первый взгляд требования находят объяснение в свете новых данных об условиях синтеза в клетке стресс-белков (Matin, 1990). [c.117]

Сера входит в состав некоторых важнейших аминокислот. Так, в молекуле цистеина содержится группа 8Н. При определенных условиях из двух молекул цистеина образуется цистин — в нем остатки цистеина связаны между собой дисульфидной связью (5 — 8). Эти связи необходимы для придания белковым молекулам определенной конфигурации. Переход 8 — 8 28Н осуществляется в процессах переноса водорода в клетках. Этот обратимый процесс служит организму защитой от радиационного поражения улавливаются радикалы Н и ОН , появляющиеся в клетках при расщеплеьши воды под действием радиации. Цистин образуется при гидролизе белков, образующих покровные ткани (из волос, шерсти, рогов и т. д.). [c.202]

Из вышерассмотренного анализа третичной структуры белковой молекулы можно вывести следующее определение третичной структуры это структура белка, обусловленная взаимодействием цистеиновых аминокислотных остатков, либо это клубок, фиксированный дисульфидными мостиками. Хотя в общем случае не исключено, что отдельные элементы (т.е. петли) клубка могут быть образованы взаимодействием и других аминокислот водородными связями с участием ОН-групп серина и треонина, ионными связями аммонийно-карбоксилатного типа ОСО-) остатков лизина (аргинина) и аспарагиновой (глутаминовой) кислоты. Но такие петли будут нестойкими и легко разрушаться при действии рас-т орителя, изменении pH среды и т.д. [c.99]

В то же время очевидно, что белок может оказаться зафиксированным в определенной пространственной оргаш1зации, только если в пределах его молекулы и ее окружения будут дейепювать силы, стабилизирующие эту организацию. Таковыми являются силы нековалентного взаимодействия между различными, в том числе и достаточно далеко расположе1шыми друг от друга вдоль полипептидной цепи, аминокислотными остатками и пептидными группами. В дополнение к ним, как уже говорилось в 2.1 на примере инсулина, отдельные части одной и той же или двух разных ценей могут быть скреплены дисульфидными мостиками, однако это имеет место далеко не у всех белков и даже там, где такие мостики существуют, роль нековалентных взаимодействий всегда приоритетна [c.69]

ЛИ, которую играют в поддержании структуры те или иные связи, различают несколько структурных уровней. Первичная структура белка определяется числом и последовательностью ковалентно связанных аминокислот. Полипептидная цепь благодаря водородным связям, образующимся между кислородными атомами карбонильных групп и азотными атомами амидных групп, приобретает вторичную структуру она может образовать спиральную конфигурацию (а-спираль) или конфигурацию так называемого складчатого слоя. Третичной структурой называют определенное пространственное расположение пептидной цепи, обусловленное взаимодействием между различными ее боковыми группами. В поддержании третичной структуры участвуют другие водородные связи, ионные связи и неполярные (гидрофобные) взаимодействия. Поперечные связи, соединяюище различные участки полипептидной цепи, могут быть и ковалентными таковы, например, дисульфидные связи, образующиеся при окислении SH-rpynn. И наконец, благодаря взаимодействиям нескольких полипептидных цепей могут возникать надмолекулярные агрегаты. Такое строение (при котором белок состоит из определенного числа полипептидных цепей, или субъединиц) называют четвертичной структурой. При физиологических условиях белок находится в водной фазе. Поэтому между белками и диполями воды тоже имеет место взаимодействие. Полярные группы гидратированы. Факторы, вызывающие изменение заряда белков (концентрации ионов Н, Са , Mg , К и др.), неизбежно влияют также на степень гидратации, а тем самым и на степень набухания белков. [c.43]

Это окисление дисульфидных мостиков и образование сульфоновых кислот ыожет быть очень полезным для определения структуры белков путем исследования получаемых фрагментов. Кроме того, образование ЗОзН-группы и увеличение молекулярного веса позволяют легко определить количественное содержание этих мостиков. [c.404]

В местах локализации дисульфидных мостиков создаются напряжения, ослабляющие водородные связи и нарушающие спиральную структуру. Это подтверждается опытами по определению скорости дейтерации белков. Так, у того же инсулина из 30 медленно обменивающихся при 0° атомов водорода 7 начинают обмениваться быстро при 20°. (Очевидно, что к их числу относятся водородные атомы тех пептидных групп, которые близко расположены к дисульфидным мостикам и потому слабо связаны водородными связями. Таким образом, наличие дисульфидных связей приводит к тому, что наряду со спиральными участками в полипептидных цепях имеются аморфные участки, придающие им определенную гибкость. Вместе с тем эти же мостики связы- [c.92]

Физические свойства 5-сульфопротепнов сходны со свойствами других производных тех же белков, в которых дисульфидные связи расщеплены и превращены в анионные группы. Некоторые сульфо-протеины обладают сильной тенденцией к агрегации и могут удерживаться в растворе только при строго определенных условиях pH и ионной силы. Сравнительно легкое отщепление сульфонатной группы обсуждается ниже в связи с вопросом о регенерации активного инсулина из двух его разделенных пептидных цепей. [c.109]

Отдельными опытами на небольшом числе белков обнаружено, что для обеспечения максимальной биологической активности важное значение имеют определенные группы, входящие в состав аминокислот. Например, для проявления полной активности таких ферментов, как трансаминаза, фосфокиназа, деги-драза янтарной кислоты и многие другие, необходимо присутствие сульфгидрильных групп для инсулина требуется наличие дисульфидных и фенольных групп, а для лактогенного. гормона передней доли гипофиза — наличие свободных аминогрупп. [c.265]

В непрерывной полипептидной цепи рибонуклеазы попарно связаны дисульфидными мостами остатки цистеина, обозначенные одинаковыми номерами. Очевидно, что сама по себе последовательность аминокислот в молекуле рибонуклеазы еще совершенно ничего не говорит о ее каталитическом действии на связь фосфорной кислоты с рибозой в РНК. В высшей степени интересны исследования рибонуклеазы, выполненные Анфинсеном. Если подействовать р-оксиэтилмеркаптаном на раствор рибонуклеазы в водном 50%-ном растворе мочевины (где а-спираль нарушена полностью) и таким образом разорвать все S-S-мосты, то каталитические свойства ферментов полностью исчезают. Однако если полученный белок, содержащий 8Н-группы на месте S—S-мостов и освобожденный от мочевины, окислить воздухом, то все SH-группы попарно окисляются в S—S-мосты, структура рибонуклеазы воссоздается, и вновь приобретается активность. Следовательно, S-S-мосты в данном белке (и это типично) возникают на прежних местах и, несомненно, одновременно воссоздается не только вторичная, но и третичная структура, свойственная рибонуклеазе. Если же окисление производить в растворе мочевины, где обычные водородные связи вторичной структуры нарушены, то сшивание происходит в беспорядке или в ином порядке и активного фермента не получается. Таким образом, как оказалось в этом случае, пе дисульфидные мосты, а водородные связи вторичной структуры предопределяют третичную структуру, сближающую определенные цистеиновые SH-группы и создающие возможность окисления их в цистиновые мосты S—S. Вместе с тем ясно, что за ферментативную активность ответственна совокупность первичной, вторичной и третичной структур. [c.743]

Смотреть страницы где упоминается термин Дисульфидных групп определение в белках: [c.169] [c.163] [c.355] [c.65] [c.278] [c.291] [c.396] [c.34] [c.45] [c.94] [c.224] [c.277] [c.35] [c.55] [c.221] [c.411] [c.106] [c.166] [c.132] [c.274] [c.287] [c.702]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология