Электрофорез в растворе сахароз

Проведение электрофореза. После окончания полимеризации буфер с поверхности геля отсасывают и наносят образцы РНК, полученные одним из описанных выше методов, в объеме 0,01—0,05 мл. Раствор РНК разводят электродным буфером до концентрации 2 мг/мл и добавляют равный объем 40%-ного раствора сахарозы. В электродные камеры заливают трис-ацетатный буфер (pH 7,8), разведенный в 3 раза. Для предотвращения денатурационных изменений РНК разделение рекомендуется проводить при 4°С. [c.173]

Образец можно вносить при формировании геля или же наслаивать сверху, как в обычном диск-электрофорезе. В первом случае при подготовке рабочего раствора необходимо ввести поправку на объем образца и несколько уменьшить количество воды. Наслаивание образца производится после сборки всего прибора или даже после создания градиента pH предварительным электролизом. Для этого верхнюю часть трубок заполняют 1%-ным раствором амфолитов-носителей в 5%-ной сахарозе. В электродные камеры осторожно заливают электролиты, а затем с помощью микрошприца или тонко оттянутой пипетки наслаивают образец (в 10%-ном растворе сахарозы) на поверхность геля. [c.325]

Электрофорез проводят в стеклянных трубках длиной около 70 мм с внутренним диаметром около 5 мм. Перед употреблением трубки тщательно промывают смесью хромовой и серной кислот или горячей азотной кислотой, водой и в заключение ацетоном. Сухие трубки держат вертикально и дно их закрывают резиновым уплотнением так, чтобы резина не входила в трубку. В качестве уплотнения можно использовать резиновые крышки к флаконам для сыворотки, перевернув их наоборот. Исходные растворы для приготовления геля (см. табл. 12.6 и 12.7) хранятся при 4°С в темных бутылях, которые выдерживают при комнатной температуре и откачивают водоструйным насосом, чтобы уменьшить содержание кислорода, ингибирующего полимеризацию. Если нижняя часть столбика геля не достаточно ровная, то в каждую трубочку вводят 0,1 мл 40%-ного раствора сахарозы и осторожно покрывают смесью для полимеризации разделяющего геля (табл. 12.7) до заранее отмеченной высоты, например 50 мм, т. е. около 2 мл смеси для полимеризации. Далее этот слой сразу же очень осторожно из шприца с тонкой иглой (по стенке трубки) покрывают 0,1 мл воды. Во время полимеризации трогать трубки не рекомендуется. После завершения полимеризации разделяющего геля воду удаляют ватным тампоном. Сухую поверхность разделяющего геля сначала промывают примерно 0,1 мл раствора для приготовления промежуточного геля (табл. 12.8), затем вводят 5 мм слоя (0,2 мл) раствора для приготовления промежуточного геля и быстро и осторожно покрывают 0,1 мл воды. Трубку освещают сверху флуоресцентной лампой со спектром дневного света, удаленной максимум на 50 мм. После окончания фотополимеризации слой воды удаляют, а поверхность геля промывают либо буферным раствором из верхней электродной камеры (табл. 12.9), если образец наносят в растворе, либо вновь раствором для приготовления фокусирующего геля, в который вместо воды добавляют образец. Если анализируются химически лабильные соединения, например ферменты, образец лучше наносить в виде [c.302]

Для зонного электрофореза вирусов в качестве поддерживающей и стабилизирующей среды используют растворы сахарозы с градиентом концентраций [521]. При электрофоретическом разделении вирусов с помощью непрерывного проточного электрофореза без поддерживающей среды можно использовать капиллярный слой буфера между двумя стеклянными пластинками, находящимися в контакте с двумя боковыми сосудами для электродов. Хорошее разделение штаммов мелких [c.43]

На рис. 9 изображен прибор для зонального электрофореза в градиенте плотности [985]. Основной его частью является J-образная трубка, основание которой заполнено пробкой из полиакриламидного геля. В коротком колене трубки над пробкой геля находится насыщенный раствор хлористого натрия, в который погружен один из электродов. В длинном колене поверх трубки помещают слой забуференного насыщенного раствора сахарозы, а остальную часть этого колена используют как градиентную колонку. Для ее заполнения и опорожнения служит поршень, соединенный с градиентным смесителем или коллектором фракций при помощи гибкого пластмассового шланга. Кроме того, в поршне просверлены отверстия, которые заполняют забуференным полиакриламидным или агарозным гелем для обеспечения электрического контакта с на- [c.30]

После центрифугирования из пробирок с помощью насоса медленно отбирают фракции по 0,7 мл (собирают около 30 фракций с помощью коллектора). По 10 мкл каждой из фракций (№ 1—17) анализируют в 0,3%-ном агарозном геле вместе с маркерными фрагментами ДНК фага К, которые наносят на среднюю и крайние дорожки геля. К маркерным фрагментам добавляют по 10 мкл 40%-ного раствора сахарозы, чтобы концентрация сахарозы и солей в них была такой же, как и в пробах. Длительность электрофореза составляет 16 ч при 40 В. [c.21]

Однако на этом сходство с электрофорезом кончается. Отметим, прежде всего, что трение молекул белков о сетку геля, сефадекс или вязкий раствор сахарозы никакой роли в их фракционировании не играет. С ним приходится мириться в силу не- [c.4]

Гель полимеризуется непосредственно в колонке, которую потом соединяют с сосудами с буфером. Образец суспендируют в концентрированном растворе сахарозы и наносят на поверхность геля в виде тонкого слоя с помощью пипетки. После окончания электрофореза гель извлекают из колонки и затем либо окрашивают для обнаружения зо[1, либо (при использовании радиоактивного образца) разрезают па поперечные части и измеряют радиоактивность в каждом таком срезе, / — образец 2 — буфер — гель. [c.230]

Гели полимеризуются в колонке раздельно, после чего их помещают в сосуд с буфером. Иногда верхний гель не используют в этом случае образец в плотном растворе сахарозы наносят слоем на гель-прокладку, но под буфер. После электрофореза гель извлекают и окрашивают, или, если образец был радиоактивным, разрезают поперек на части и каждый срез анализируют в сцинтилляционном счетчике. В некоторых случаях (рис. 9-13) гель разрезают вертикально и анализируют методом авторадиографии. Устройство для пластинок геля (рис. 9-7) может быть использовано также и для диск-электрофореза. 1 — крышка 2 — образец или область образца 3 — гель-прокладка — разделяющий гель 5 —верхний сосуд 5 — буфер 7 — нижний сосуд — стеклянная трубка. [c.235]

В некоторых случаях в раствор препарата добавляют сахарозу и вносят зтот раствор под слой свободного элюента, как при электрофорезе в вертикальных трубках. Как правило, в этом нет необходимости. [c.77]

Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. [c.145]

При электрофорезе в крахмале зоны размываются гораздо меньше, чем при последующем вытеснении (в целлюлозных колонках это различие не так заметно). Чтобы избежать излишнего расширения, стараются уменьшить по возможности длину участка, пройденного зоной при вытеснении. В пределе можно совсем избежать вытеснения, предусмотрев специальное устройство, позволяющее собирать зоны, дождавшись их выхода из колонки в свободный раствор. Можно, например, поместить полупроницаемую мембрану на небольшом расстоянии от поверхности набивки и с помощью насоса медленно промывать узкое пространство между набивкой и мембраной, собирая фракции. Если промывку вести достаточно медленно, можно значительно увеличить концентрацию в зонах элюируемых белков, так как последние будут накапливаться перед мембраной. Если применяются полупроницаемые мембраны, не следует забывать об изменении концентрации солей и pH, которое может возникнуть из-за неодинаковой проницаемости мембраны для ионов разного знака. Этот эффект аналогичен описанному выше явлению, вызванному резким изменением вязкости раствора (градиентом концентрации сахарозы). Чтобы избежать осложнений, можно поместить специальную компенсационную камеру за мембраной [29]. [c.90]

Стабилизация разделяемых компонентов при работе в периодическом режиме достигается при помощи градиента некоего вещества (сахарозы, фиколла и др.), которое соприкасается с электролитом, находящимся в электродных сосудах (рис. 3.8). Градиент плотности формируют над слоем концентрированного раствора вещества, используемого для создания градиента. Этот слой выполняет роль своего рода прокладки. Охлаждение осуществляется и снаружи (водяная рубашка), и изнутри (охлаждающий цилиндр) циркулирующей водой, температура которой составляет 4°С. Таким образом, поперечное сечение колонки имеет форму кольца, охлаждаемого с обеих сторон. По окончании электрофореза фракции отбирают, выпуская содержимое колонки через отверстие в ее нижней части или высасывая его при помощи насоса через капиллярную трубку в центре охлаждающего цилиндра [87]. [c.117]

ДНК из сахарозных градиентов кажется иногда деградированной. Такой вывод можно сделать, если высокомолекулярные фракции дают заметные полосы в зоне ниже 25 т. н. п. Сходные проблемы касаются солевых градиентов. Для надежности все растворы автоклавируйте (для сахарозы достаточна обработка при 110°С). Нельзя добиться успеха при создании библиотеки, если ДНК подверглась деградации. Иногда деградация ДНК происходит даже в процессе электрофореза в 0,2%-ном геле в течение ночи. Это трудно контролировать — убедитесь, что аппарат для геля чист и растворы свежие и автоклавированные. [c.69]

Раскапайте градиент, проколов дно пробирки иглой, присоединенной к шлангу насоса, и соберите фракции по 0,7—1 мл. ДНК нужного размера должна быть приблизительно в 15—25-й фракциях. 15 мкл из каждой фракции проверьте электрофорезом в 0,2%-ном геле. Не забудьте добавить в лунку с маркерами раствор сахарозы в высокосолевом буфере, использованном в градиенте, так чтобы его концентрация в пробе составляла [c.46]

С поверхности заполимеризовавшегося концентрирующего геля удалить воду и внести образец (смесь изоферментов ЛДГ, разведенную 40 %-ным раствором сахарозы в отношении 1 1) в количестве 0,2 мл. Наслоить раствор лидирующего красителя (0,001 %-ный раствор бромфенолового синего). Эта часть колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером при электрофорезе, поэтому верхнее наслаивание заканчивается электродным буфером. Наслаивание проводят очень осторожно, избегая перемешивания образца с буфером, во избежание потери вещества. [c.272]

Рис. 9. Прибор для электрофореза в градиенте) плотности в начале электрофоретического разделения [985]. А, Л-образная трубка. Б. Составные части поршня. 1 — аппарат для создания градиента плотности 2 — двухходовой кран 5 —трехходовой кран — пластмассовый шприц для вне сения пробы 5 — пропускание воздуха для перемешивания раствора при формировании градиента 6 — ось редуктора, понижающего число оборотов мотора 7—нитка 8 — анодная платиновая спираль Р —градиент —поршень /7 —проба в выбранном положении /2 — насыщенный раствор сахарозы 75 —пробка из полиакриламидного геля 74 — насыщенный раствор хлористого натрия /5 — катод 75 —водяная рубашка для термостатировання 77—пластмассовая трубка 75 —зубчатая насечка 7Р —пробка из полиакриламида или агарозы 20 — уплотнительное кольцо 21 — наконечник для присоединения пластмассовой трубки.

Годоон [444] исггользовал для ИЭФ в градиенте плотности трубки с припаянными боковыми отводами (рис. 55). Такие J-образные трубки помещают в стандартный прибор для диск-электрофореза. Верхнюю часть трубки, содержащую градиент плотности, вставляют, как обычно, в верхний электродный сосуд, а боковой отросток, заполненный этилендиамином и 50%-ным раствором сахарозы, погружают в нижний электродный сосуд. После завершения ИЭФ в колонку снизу накачивают насооом раствор с высокой плотностью, вследствие чего весь градиент плотности поднимается вверх и вытесняется сначала в анализатор (фирма IS O, США), а затем, в коллектор фракций. Описанное устройство позволяет разделять 0,1—1 мг белков в градиенте объемом 10 мл. Помимо простоты конструкции еще одно важное преимущество данного прибора состоит в том, что он дает возможность исследовать одновременно несколько образцов при идентичных условиях. [c.135]

Сузуки и др. [1253] предложили использовать электрофорез для выделения белков из любого типа геля после любого способа их фракционирования. Вырезанный участок геля с белковой зоной помещают в стеклянную трубку поверх слоя предварительно заполимеризованного геля, который не доходит на несколько миллиметров до нижнего конца трубки. Этот гель можно приготовить следующим образом. Сначала, как обычно, закрывают дно трубки н в нее до желаемой высоты наливают концентрированный раствор сахарозы или глицерина, на который затем аккуратно наслаивают забуференную смесь компонентов полиакриламидного геля. После полимеризации сахарозу или глицерин удаляют, дно трубми затягивают диализной мембраной, а образовавшееся между ней и гелем пространство заполняют буферным раствором. Такую трубку с находящимися в ее верхней части кусочками геля, содержащего сфокусированную при ИЭФ белковую полосу, устанавливают в аппарат для диск-электрофореза и проводят электрофорез в соответствующем буфере. Под действием электрического поля [c.151]

Для разделения белков в первом направлении можно использовать не только электрофорез, но и другие методы. Так, например, Пиндер и Гратцер [1008] описали простой и прямой способ последовательного сочетания центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и электрофореза в геле. Белки сыворотки человека центрифугировали в градиенте 0—40%-ного раствора сахарозы, содержащего 5% акриламида (2,5% составлял бас-акриламид), ТЕМЭД, (1 мг/мл) и рибофлавин (50 мкг/ /мл). После центрифугирования пробирки облучали люминесцентной лампой для полимеризации акриламида. Чтобы видеть, результаты центрифугирования, один из параллельных гелей окрашивали амидовым черным. Затем из центральной части неокрашенного геля вырезали полоску шириной 2 мм и использовали ее как стартовую зону для электрофореза на пластине 57о-но-го полиакриламидного геля при pH 8,5. [c.234]

Возможно построить препаративную систему электрофореза с последовательной элюцией белковых полос с нижнего края пластины ПААГ. Фирма Bio-Rad предлагает для этой цели специальные прокладки, используемые при полимеризации геля. Конструкция прокладок позволяет подвести к нижнему краю рабочего геля толщиной до 6-мм по обеим его сторонам две трубочки, через которые потом и осуществляют элюцию белков. Сначала между стеклянными пластинками формы полимеризуют пробку из плотного ПААГ, затем, как раз на уровне трубочекги на высоту их диаметра, заливают слой раствора сахарозы, а над этим слоем уже полимеризуют рабочий гель. Сахарозу потом замещает элюирующий буфер. [c.117]

Отметим также успешное фракционирование до 1 г белковой смеси электрофорезом в градиенте концентрации раствора сахарозы (10—45%) в буфере с pH 8,5. Электрофорез вели в цилиндре диаметром 12 см и высотой 17 см [Waiters, Bont, 1979]. Тонкость метода — в наслаивании препарата на раствор сахарозы с помощью металлического сита, которое поднимается по мере увеличения объема препарата, оставаясь сцепленным с мениском жидкости силами поверхностного натяжения. Это позволяет на- [c.119]

Горизонтальный блочный электрофорез не нашел широкого применения, несмотря на то что он не нуждается в сложной аппаратуре. Вертикальный колоночный электрофорез, особенно-в геле, используется значительно чаще. В отсутствие геля есть два способа стабилизировать жидкость в колонке они используются также при изоэлектрическом фокусировании и изотахо-форезе (см. разд. 5.3). Один из них основан на том же принципе, который используется в горизонтальных системах, — это заполнение большей части объема колонки инертным порошком,, так что миграция белка происходит в эффективном объеме между частицами. Второй способ заключается в гравитационной стабилизации жидкости с помощью градиента плотности сахарозы. Плотный раствор сахарозы помещают на дно колонки, а поверх него наслаивают раствор с равномерно убывающей плотностью, так что в верхней части колонки, куда вводят образец, концентрация сахарозы равна или почти равна нулю. Следует отметить, что сахароза в колонке лишь стабилизирует жидкость, сводя к минимуму конвекционные токи. Она лишь немного влияет на миграцию белка вследствие увеличения вязкости по мере перемещения белка вниз по колонке. Это замедляет движение белка, но вместе с тем снижает его диффузию. Обычный способ удалить белок из колонки после электрофореза — это просто дать жидкости стечь и собрать ее в виде фракций с помощью коллектора. Эту операцию нужно делать медленно, чтобы не перемешать отдельные зоны белка, движущиеся вниз по колонке. [c.220]

Нанесение образца. Раствор с образцом обычно наносят микропипеткой в виде маленького пятна иЛи узкой полосы. Если отдельные компоненты смеси имеют противоположные заряды, они в ходе разделения будут двигаться к разным электродам, и образец в этом случае нужно наносить примерно посередине. Если же все компоненты будут двигаться в одном направлении, т. е. если все они заряжены либо положительно, либо отрицательно, образец нужно наносить как можно дальше от соответствующего электрода, у противоположного конца носителя, чтобы разделяемые компоненты проходили возможно большее расстояние. При горизонтальном электрофорезе пропитанные образцом полоски фильтровальной бумаги вводят в щель или ямку, вырезанные на поверхности геля. При вертикальном электрофорезе образец в 10%-ном растворе сахарозы наслаивают на поверхность вертикального столбика геля. Изредка образец включают в широкопористый гель, называемый гелем образца. [c.125]

Стабилизирующее действие градиента плотности. Электрофорез с применением градиента плотности проводится в вертикальной трубке, в которую предварительно налит буферный раствор с плотностью, возрастающей с глубиной. Это достигается добавлением какого-либо тяжелого недиссоциирующего вещества (чаще всего сахарозы) с переменной концентрацией. [c.65]

Когда влажную бумагу помещают в электрическое поле, неподвижная бумажная фаза, будучи заряжена отрицательно, вызывает эндосмотический поток жидкости по направлению к катоду. Полярность бумаги можно изменить химической обработкой [6], но обычно мирятся с наличием этого потока или нейтрализуют его до некоторой степени наложением противоположно направленного гидростатического течения. Эндосмотический поток приблизительно пропорционален градиенту потенциала и уменьшается с увеличением ионной силы буферного раствора. Его можно измерить при помощи электронейтральных или имеющих очень малую подвижность веществ. В тех случаях, когда требуется внести поправку на эндосмос в величины подвижности, подбирают такое вещество, молекулярный объем которого близок к молекулярному объему исследуемых молекул.В опытах по электрофорезу белков для этой цели используют декстраны, а в опытах по электрофорезу несложных ионов, таких, как аминокислоты или пептиды, используют глюкозу, сахарозу, перекись водорода, о-нитроанилин [6] или 2,4-динитрофенил-этаноламин [7]. [c.248]

Эту смесь дегазируют (раствор 4), смешивают с равным объемом раствора 3, заполняют трубки для электрофореза и дают гелю застыть. Затем готовят концентрирующий гель при кипячении с обратным холодильником 1%-ной суспензии агарозы в буфере Б, разбавленном в восемь раз. После 15-минутного кипячения раствор агарозы охлаждают до 45 С и наслаивают 0,5-сантиметровым споем на сухую поверхность полиакриламидного геля. Трубки выдерживают при комнатной температуре до застывания геля, мРНК растворяют в 0,1 мл раствора, содержашего 10% сахарозы и 0,2% бромфенолового синего в буфере Б, разбавленном в восемь раз. Образец помещают на поверхность концентрирующего геля и проводят электрофорез, как описано выше. мРИК локализуют и экстрагируют, как описано для тРНК, [c.255]

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

Электрофорез в капиллярах, заполненных градиентным гелем. Для приготовления градиентных гелей в капиллярах было предложено [1196] погружать их в раствор с предварительно сформированным градиентом концентрации амриламида (5—25%). Скорость погружения капилляра регулировали, используя специальный держатель, связанный через эксцентрик с электромотором. Чтобы избавиться от капиллярного эффекта и получить требуемый градиент, капилляры сначала снизу наполняли буфером для геля, содержавшим 0,2% тритона Х-100, и лишь затем постепенно погружали в градиентный раствор. Предварительно их устанавливали вертикально в прикрепленную к стальному стержню полиэтиленовую трубку с нижиим отверстием, затянутым нейлоновой сеткой. В конце заполнения в систему добавляли 50%-ную сахарозу, которая вытесняла раствор акрилам ида в капилляры и препятствовала его поли-.меризации на нейлоновой сетке [915]. [c.110]

Еще один вариант препаратив- юго электрофореза в полиакриламидном геле со стоит в том, что макромолекулы, мигрирующие через полиакриламид, переходят в раствор градиента плотности сахарозы, который после окончания электрофореза фракционируют. Из полученных фракций можно легко выделить нужные компоненты [1150, 1160]/ [c.122]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология