Лактатдегидрогеназа NAD-зависимая

Зависимость скорости реакции восстановления пирувата, катализируемого лактатдегидрогеназой, от концентрации субстрата. Условия опыта pH в,80 27,5°С 0,05М фосфатный буфер [ АО Н] = 1,29-10-бМ [Е]о = 210-5 мг/мл [c.118]

Изучают ингибирующее влияние оксалата натрия на лактатдегидрогеназу из разных источников. С этой целью исследуют зависимость скорости реакции от концентрации пирувата натрия 0,02— [c.339]

Наличие изоферментов - одна из форм регуляции активности ферментов. Например, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит из двух видов субъединиц мышечных (М) и сердечных (И), и в зависимости от их сочетания активность ЛДГ будет менее эффективной (больше М-субъединиц) или более эффективной (больше Н-субъединиц). [c.35]

Присутствие пирувата увеличивает стабильность комплекса фермента с иммобилизованным коферментом, повышая сродство лактатдегидрогеназы к этому сорбенту по сравнению с другими NAD-зависимыми ферментами. Подобный метод называют аффинной элюцией. [c.247]

Взаимодействующие системы- могут быть исследованы количественно также с помощью аналитической ультрацентрифуги, если за связыванием лиганда можно проследить с помощью абсорбционной оптической системы [105, 107]. На рис. 9 представлены седиментационные диаграммы серии опытов с различными смесями НАД-Н (ДПМ-Н) лактатдегидрогеназы. Диаграмма, относящаяся к раствору НАД-Н (слева), показывает, что весь материал, поглощающий свет при длине волны 340 нм, мигрирует медленно, тогда как после добавления фермента часть или весь кофермент, в зависимости от концентрации фермента, седиментирует с тем же коэффициентом седиментации, что и нативный фермент. Из распределения поглощения света в кювете ультрацентрифуги в процессе седиментации можно рассчитать концентрацию связанного и свободного кофермента на основе этих данных рассчитывается среднее число связанных с ферментом молекул кофермента и по уравнению (3)—число связывающих, участков и константы диссоциации. [c.409]

В организме имеется большое количество НАД-зависимых ферментов, которые не только участвуют в реакциях энергообразования, но и катализируют другие реакции, например реакции биосинтеза веществ. Достаточно изученным НАД-зависимым ферментом является лактатдегидрогеназа, которая катализирует обратимую реакцию окисления пировиноградной кислоты в молочную. От активности этого фермента зависит скорость аэробного и анаэробного окисления глюкозы в мышцах. [c.48]

Рис. 49. Зависимость ферментативной активности лактатдегидрогеназы, связанной с мембранами эритроцитов (2-10" моль/л, 0,15 мг/мл белка мембран), от величины pH (за 100 % принята активность свободного фермента при тех же значениях pH)

Рис. 76. Зависимость между логарифмом молекулярной массы и отношением абсолютных подвижностей белков при двух разных концентрациях геля (/ — 8 и 5,0% //—Юн 5%). Для каждой концентрации геля даны средние величины из трех определений [1483]. / — овальбумин куриного яйца 2 — гемоглобин А человека 3 — сывороточный альбумин человека 4 трансферрин человека 5 — гаптоглобин человека 5 — лактатдегидрогеназа человека 7 —мономер БСА

Из рис. 134, А видно, что за 30 мин высокая степень связывания лактатдегидрогеназы на 5 -АМР-сефарозе достигается лишь начиная с исходной концентрации фермента 1 ед./мл (2 мкг/мл, если считать, что активность фермента составляет ориентировочно 500 ед./мг). Дальнейший ход зависимости полноты связывания от концентрации фермента имеет пологий характер. Процесс связывания фермента при малой его концентрации сильно растягивается во времени (рис. 134, В). Даже при исходной концентрации 0,1 ед./мл связать фермент полностью удается лишь за 16 ч. Очевидно, что такое замедление нельзя объяснить с чисто кинетических позиций соотношения концентрации реагентов (в растворе). Возможно, что имеет место временное задерживание диффундирующих молекул на местах неспецифической сорбции. Свой вклад дает и замедление диффузии белков внутри гранул за счет столкновений с сеткой матргщы. [c.402]

Состав и соотношение форм И. (спектр И.) изменяется в зависимости от их локализации в органах и тканях организмов одного вида и даже в разных субклеточных органеллах одной и той же клетки. На спектр И. оказывает влияние разное физиол. состояние организма и патологич. процессы, происходящие в нем. Поскольку И. различаются по свои.м св-вам (оптимуму pH, активации ионами, по сродству к субстратам, ингибиторам, активаторам, кофакторам), то характер их распределения отражает регуляторные механизмы, контролирующие метаболизм. Так, напр., лактатдегидрогеназа представлена в организме человека и животных пятью формами, каждая из к-рых представляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц двух типов (а и Р) в разных соотношениях. В сердце и печени представлена в осн. форма 04, а в мышцах-Р . Первая ингибируется избытком пировиноградной к-ты и поэтому преобладает в органах с аэробным типом метаболизма, вторая не ингибируется избытком этой к-ты и преобладает в мышцах с высоким урювнем гликолиза. О важной роли И. в тонкой регуляции метаболич. процессов свидетельствует также изменение их спектра под влиянием разл. воздействий и физиол. состояний (охлаждение, гипоксия, денервация и др.). [c.202]

РИС. 6-9. А. Зависимость скорости реакции, катализируемой дрожжевой гексокиназой в равновесных условиях (Ueq), от концентрации глюкозо-6-фосфата при постоянном отношении концентрации глюкозы к концентрации глюкозо-6-фосфата, равном 1/19 [37]. Реакционные смеси содержали 1—2,2 мМ АТР и 25,6 мМ ADP (pH 6,5). Б. Зависимость скорости реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой из скелетных мышц кролика в равновесных условиях ( eq), от концентрации лактата при постоянном отношении концентрации пирувата к концентрации лактата, равном 1/35 [38]. Реакционные смеси содержали 1,7 мМ NAD, 30—46 мкМ NADH (трис-цитратный буфер, pH [c.34]

Даже до того, как стала известна структура кристаллической лактатдегидрогеназы, отсутствие рН-зависимости связывания кофермента в интервале pH от 5 до 10 наряду с наблюдавшейся инактивацией фермента бутандионом позволило предположить, что пирофосфатная группа NAD+ связывается с гуанидиниевой группой бокового радикала аргинина [75]. Рентгеноструктурные исследования показывают, что эту функцию осуществляет Arg-101 (рис. 8-12). Несколько неожиданным оказалось то, что аминогруппа аденина не образует водородной связи с белком. Аденин скорее всего заключен в гидрофобной щели, а его аминогруппа контактирует с растворителем. [c.245]

Определены структуры четырех NAD-зависимых дегидрогеназ лактатдегидрогеназы (LDH) [232], s-малатдегидрогеназы (MDH) 233], алькогольдегидрогеназы печени (ADH) и D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) [230, 231]. Этн ферменты катализируют перенос гидрид-иона из субстрата, по которому они названы, к атому С4 никотинамидного цикла NAD. Каждая субъединица фермента содержит один домен, связывающий NAD. [c.259]

Оптимум действия одних ферментов, например пепсина, наблюдается в кислой среде (pH 2,0), других — в щелочной, а у большинства ферментов — в нейтральной среде. Изменение активности лактатдегидрогеназы культуры Вас. subtilis в зависимости от pH среды показано на рис. 13. [c.34]

Исследование ДОВ лактатдегидрогеназы (ЛДГ) показало колоколообразную зависимость констант в формулах Друде и Моффитта (см. стр. 304, 305) от pH. На рис. 6.24 изображены [c.398]

Лактатдегидрогеназа, катализирующая превращение пирувата в лактат, стереоспецифична. У разных видов она содержится в виде определенных оптических изомеров в зависимости от этого бактерии продуцируют О- или -форму молочной-кислоты. Те из них, которые образуют смесь О- и /-форм, содержат или две формы фермента, различающиеся стереоспецифичностью, или лактатрацемазу. Некоторые признаки, характерные для эубактерий, осуществляющих гомоферментативное молочнокислое брожение, представлены в табл. 15. [c.216]

На рис. 3.4 приведена зависимость количеств связанной лактатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика и мышц сердца свиньи и глицерокиназы от концентрации №-(6-аминогексил)-5 - [c.24]

Сравнивая связывание различных дегидрогеназ и киназ па N - (6-аминогексил) -5 -АМР—сефарозе и Р - (6-аминогексил) -Р -(5 -аденозин) пирофосфат—сефарозе, Харвей и др. [9] выразили силу взаимодействия между ферментом и иммобилизованным нуклеотидом с иомоплью так называемой связываемости . Этот параметр представляет собой концентрацию хлорида калия (мМоль/л) в центре пика фермента при элюировании фермента линейным градиентом концентрации КС1 (рис. 4.6 и табл. 4.2). Для определения константы диссоциации комплекса лактатдегидрогеназы с №-(6-аминогексил)-5 -АМР, связанным с сефарозой, Лоу и др. [11] использовали линейную зависимость между количеством связанного фермента и концентрацией иммобилизованного нуклеотида. [c.58]

Зависимости связываемости р лактатдегидрогеназы от концен-трацпп лиганда в Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе, разбавленной незамещенной сефарозой до требуемой концентрации лиганда, и от той же концентрации в сес арозе, равномерно модифицированной М -(6-аминогексил)-5 -АМР, близки [8]. Более сильная связываемость в случае сорбента, разбавленного незамещенной сефарозой, объяснена присутствием гранул геля, в которых концентрация лиганда остается идентичной той, которая была в исходном неразбавленном геле. В гелях, которые содержали равномерно распределенный лиганд, связываемость р лактатде- [c.78]

Рис. 5.8. Связываемость малатдегидрогеназы (1), лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи (2) и глицерокиназы (3) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе в зависимости от концентрации аффинного лиганда [8].

В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

Связывание лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-б -АМР — сефарозе настолько сильно, что фермент нельзя элюировать даже 1 М КС1 при 40 °С. Однако для элюирования можно использовать линейный градиент концентрации NADH. На рис. 5.12 показан график зависимости концентрации NADH, необходимой для элюирования лактатдегидрогеназы, от температуры. С повышением температуры необходимая концентрация специфического элюирующего агента уменьшается, что отражается линейным графиком Аррениуса. Соответствующая энергия адсорбции составляет 54,6 кДж/моль (13,0 ккал/моль) [9]. [c.87]

Рис. 5.12. Связываемость 5 лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи на К -(6-аминогекснл)-5 -АМР—сефарозе в зависимости от температуры [9].

Среди NAD-зависимых дегидрогеназ, участвующих в углеводном обмене, главную роль играют глицералъдегидфосфат-дегидрогеназа и лактатдегидрогеназа гликолитической системы, локализующиеся в цитозоле, а также пируватдегидрогеназа, находящаяся в митохондриях (табл. 17-2). Три NAD-зависимые дегидрогеназы участвуют в митохондриях в цикле лимонной кислоты изоцитратдегидрогеназа, <х-кетоглутаратдегидроге-наза и малатдегидрогеназа. К числу других важных митохондриальных дегидрогеназ относятся 3-гидроксиацил-СоА-де- [c.517]

Пировииоградная кислота, а-кетопропионовая кислота, СН3СОСООН —конечный продукт гликолитического распада глюкозы. Образуется также при распаде и синтезе некоторых аминокислот. Имеет мол. массу 88,Об. В зависимости от места и условий протекания процесса в организме судьба пировиноградной кислоты различна. В анаэробных условиях при недостаточном снабжении кислородом пировино-градная кислота при участии лактатдегидрогеназы восстанавливается до молочной кислоты. Основным донором электронов при этом служит восстановленный НАД, образовавшийся на одном из этапов гликолиза — окисления глицеринальдегид-3-фосфата. [c.198]

К. Анфинсен обнаружил существование двух доменов у стафилококковой нуклеазы [225]. Они обладают повышенной стабильностью, проявляющейся в большей денатурационной устойчивости. Доменная структура КАО(никотинамидадениндинуклеотид)-зависимых дегидрогеназ, как и у иммуноглобулинов, связывается со слиянием генов. У лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы и глицеральдегид-З-фосфатдегндрогеназы один из структурных доменов везде выполняет одну функцию, являясь NAD-связьгеающим центром. В связи с этим он отличается в ряду перечисленных ферментов большим постоянством в своем химическом и пространственном строении [226]. В два домена складываются также полипептидные цепи фосфоглицераткиназы и гексакиназы [227—229]. [c.308]

Рис. 75. Зависимость между наклоном кривой логарифмов подвижности (см. рис. 30) и молекулярной массой белков [538]. 7 —димер пепсина 2 —оваль-бумин 3 — а-амилаза 4 — мономер альбумина 5 — трансферрин человека 5 — яичный трансферрин 7 — гексокиназа 8 — лактатдегидрогеназа 9 — кетозо-1-фосфат—альдолаза 10—Р-амилаза 11 — никотинамидаза 12 — а-уреаза 13 — каталаза 14 — ксангииоксидаза 15 — мономер апоферритина (ферри-тин) 16 — уреаза, 17 — рибулозодифосфат-карбоксилаза.

Емкость колонки с Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозой по лактатдегидрогеназе при использовании гелей с различными концентрациями ковалентно связанного лиганда меняется по сигмоидальной кривой в зависимости от концентрации лиганда. Эта зависимость отличается от поведения гелей, полученных прямым разбавлением первоначального геля немодифицирован-ной сефарозой (рис. 1). При низких концентрациях лиганда глицерокиназа не связывается с М -(б-аминогексил)-5 -АМР-се-фарозой. Сигмоидальный характер кривой отражает определенную кооперативность во взаимодействии фермента с иммобилизованным лигандом и подтверждает, что при более высоких концентрациях лиганда удерживание фермента на геле происходит благодаря затруднению его диссоциации с матрицы. [c.104]

Рис. 1. Связывание лактатдегидрогеназы из сердца свиньи с М -(6-ами-ногексил) -5 -АМР-сефарозой в зависимости от концентрации лиганда. Образцы (100 мкл) содержали фермент с активностью 5Е и 1,5 мг бычьего сывороточного альбумина.

Рис. 4. Связывание лактатдегидрогеназы с Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефа-розой в зависимости от скорости потока. Образец фермента (100 мл), содержащий 5Е лактатдегидрогеназы и 1,5 мг бычьего сывороточного альбумина, наносили на колонку (34X5 мм) с N -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозой (0,95 г влажного носителя, 0,125 мкмоль Б -АМР/мл). J — изменение ширины пика (10 , мл) в зависимости от скорости тока, определенное по основанию пика 2—высота (мм), эквивалентная теоретической тарелке, измеренная, как описано в работе [6] 3 — прочность связывания оценивалась, как указано в подписи к рис. 1 [6]. (Воспроизведено с разрешения.)

Изучение влияния pH и температуры проведено на адсорбентах, специфичных к группе ферментов 10, 11]. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы с двумя аффинными адсорбентами представлено на рис. 6. Взаимодействие фермента с обоими адсорбентами явно не зависит от концентрации ионов водорода в растворе вплоть до pH 8, но в более щелочной области наблюдалась зависимость от природы адсорбента. В случае б-аминогексаноил-ЫАО+-сефа-розы поведение фермента характеризовалось кажущейся константой рК 8,5, в то время как для Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозы р/С 9,7. Различия между значениями кажущихся констант рК, определенных для двух иммобилизованных [c.109]

Процент связывания глицерокиназы с N -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозой уменьшается при значениях pH>7,0 кажущаяся константа р/С 8. Кроме того, прочность связывания фермента с иммобилизованным лигандом совпадает с соответствующей рН-зависимостью. Уменьшение связывания при изменении pH наблюдалось при взаимодействии лактатдегидрогеназы с 6-aминoгeк aнoил-NAD- eфapoзoй. В идентичных условиях в исследованной области pH бычий сывороточный альбумин не проявлял сродства к этому адсорбенту. [c.110]

В одном из них [14] для интерпретации фосфорилхолинзависи-мого элюирования иммуноглобулина А с сефарозы, содержащей ковалентно связанный фосфорилхолин (иммобилизованный реагент X), был использован приближенный анализ [17] результатов зональной хроматографии. Другие исследования были посвящены фосфатзависимому элюированию альдолазы с фосфо-целлюлозы [18] и с миофибрилл мышц кролика [28] и ЫАОН-зависимому элюированию лактатдегидрогеназы с 10-карбокси-дециламино-сефарозы [32]. Все четыре системы относятся к примеру 3, включающему конкуренцию между 5 и X за положения связывания растворенного вещества. [c.207]

Весьма убедительный пример описал Джонсон (1971) для пурпурного петушка Anoplor hus purpures ens, который живет в скалистой приливно-отливной зоне. Частота аллеля Л в локусе лактатдегидрогеназа меняется от 0,021 до 0,305 в пределах только трех градусов широты около пролива Пьюджета, однако у входа в пролив, где имеется сильная турбулентность и перемешивание воды, обнаружено заметное отклонение от клины. Коэффициент корреляции между частотой этого аллеля и августовской температурой поверхности воды был равен 0,69 между частотой аллеля и концентрацией кислорода летом — 0,71 между частотой аллеля и относительной частотой другого вида А. insignis — 0,96 (почти полная). Зависимость от температуры подтвердилась лабораторными исследованиями смертности при разных температурах. [c.253]

В зависимости от окислительно-восстановительного состояния ткани дальнейший процесс может идти по одному из двух путей. В анаэробных условиях реокисление NADH путем переноса восстановительных эквивалентов на дыхательную цепь и далее на кислород происходить не может. Поэтому NADH восстанавливает пируват в лактат, эта реакция катализируется лактатдегидрогеназой. Описано несколько ИЗОЗИМОВ этого фермента, определение их имеет клиническое значение. [c.185]

Рис. 21-3. Зависимость преципитация лактатдегидрогеназы (ЛДГ-5) от количества добавленной антисыворотки. Различные аликвоты козьей антисыворотки против ЛДГ-5 (разведение 1 20) инкубировали с препаратом очищенной ЛДГ-5 человека в течение 5 мин. После добавления иммобилизованных на нерастворимом носителе ослиных антител против иммуноглобулинов козы и отделения образующихся нммунокомплексов с помощью центрифугирования в супернатантах определяли остаточную активность фермента.

Высокий энергетический уровень в головном мозгу обес печивается наличием потенциальных возможностей ряда ферментов (лактатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, НАД-зависимых ферментов цикла трикарбоновых кислот и др.), активность которых в норме реализуется в предемх 0,5—10%. Однако при определенных условиях в течение некоторого времени активность этих ферментов может повышаться в 10 и бо-лее,41аз. [c.7]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология