Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Очистка и фракционирование белков

    Для успешного анализа весьма важно выбрать подходящий метод фракционирования и очистки крупных полипептидных фрагментов. появившихся в результате действия бромциана на белок. Вначале удобно провести предварительное фракционирование по [c.171]

    При кристаллизации используют предварительное фракционирование и диализ для очистки белка от соли. Для получения требуемой чистоты препарата белок несколько раз перекристаллизовывают. [c.43]


    В сравнении с хроматографическими методами все другие способы очистки белков за последние годы начинают несколько отступать на задний план. Все же следует упомянуть здесь о препаративном электрофорезе, который применяется довольно широко в разных исполнениях. Для фракционирования малых весовых количеств белков разделение смеси белков на зоны ведут в том или ином стабилизирующем наполнителе для ликвидации конвекционного перемешивания. Пригодными наполнителями являются волокна целлюлозы, в частности бумага. Бумажный электрофорез белков похож на разделение аминокислот и пептидов на бумаге, о чем мы уже говорили выше. Другой широко употребительной средой является гель крахмала, который разрезается на кусочки после завершения электрофореза, и из каждого куска элюируется содержащийся в нем белок. [c.131]

    Для очистки продукта смесь белка с формальдегидом осаждалась избытком 95%-ного спирта осадок фильтровался, промывался спиртом, растворялся в горячей воде и вновь осаждался спиртом. После промывания спиртом второй осадок был растворен в горячей воде и к раствору прибавлялся спирт до появления постоянной мути, которая затем была вновь растворена прибавлением нескольких капель воды. Из медленно выпаривавшегося при обыкновенной температуре раствора выпали по истечении довольно продолжительного времени маленькие, сильно преломляющие, плоские пластинки и вязкая полупрозрачная масса. Количество осадка было слишком мало, чтобы можно было еще раз очистить его. Более спешная работа заставила меня на некоторое время отложить эти опыты. Недавно я вновь взялся за них, в надежде получить указанным выше методом кристаллический продз-кт. Как известно, Гофмейстеру удалось получить кристаллизованный белок, подвергая его фракционированному осаждению раствором сернокислого аммония он обрабатывает белок полу-насыщенным раствором сернокислого аммония, дает ему осесть при комнатной температуре, вновь растворяет образовавшийся осадок и осаждает его раствором сернокислого аммония той же концентрации эта операция повторяется, пока белок не начнет кристаллизоваться. С. Габриэль ввел в этот метод видоизменение, заключающееся в том, что он обрабатывает белок насыщенным раствором сернокислого аммония до появления постоянной мути, которую затем растворяет в нескольких каплях воды. [c.177]

    Метод изоэлектрического фокусирования — один из наиболее эффективных и широко распространенных методов очистки и фракционирования белков. Он основан на том, что в изоэлектрическом состоянии белок теряет заряд и подвижность в электрическом поле. Трубку с гелем заполняют амфолинами, создающими фадиент pH. В электрическом поле белок будет передвигаться до того значения pH, [c.21]


Рис. 4-47. Типичные результаты, полученные при очистке белка различными методами хроматографии. В данном случае подлежащий фракционированию клеточный экстракт сначала пропускали через колонку, заполненную ионообменной смолой (А). Затем колонку промывали и связавшиеся белки элюировали раствором, содержащим постепенно нарастающую концентрацию соли. Белки с наименьшим сродством к ионообменной смоле проходят через колонку не задерживаясь и собираются со дна колонки в первых порциях элюата. Остальные белки элюируются соответственно сродству к ионообменной смоле. Для элюирования белков, связывающихся со смолой наиболее сильно, требуется наивысшая концентрация соли. Исследуемый белок элюировался в виде узкого пика он был выявлен по ферментативной активности. Фракции с такой активностью собирали и наносили на вторую колонку для гель-фильтрации (Б). Фракцию все еще недостаточно очищенного белка выявляли по ферментативной активности активные фракции собирали и очищали до гомогенного состояния на колонке (В), содержащей иммобилизованный Рис. 4-47. <a href="/info/1896885">Типичные результаты</a>, полученные при <a href="/info/35985">очистке белка</a> <a href="/info/1613800">различными методами хроматографии</a>. В данном случае подлежащий <a href="/info/510941">фракционированию клеточный</a> экстракт сначала <a href="/info/1229022">пропускали через</a> колонку, <a href="/info/481708">заполненную ионообменной</a> смолой (А). Затем колонку промывали и связавшиеся белки элюировали раствором, содержащим постепенно нарастающую <a href="/info/121595">концентрацию соли</a>. Белки с наименьшим сродством к <a href="/info/3715">ионообменной смоле</a> <a href="/info/336204">проходят через</a> колонку не задерживаясь и собираются со дна колонки в первых порциях элюата. Остальные белки элюируются соответственно сродству к <a href="/info/3715">ионообменной смоле</a>. Для элюирования белков, связывающихся со смолой наиболее сильно, требуется наивысшая <a href="/info/121595">концентрация соли</a>. Исследуемый белок элюировался в виде узкого пика он был выявлен по <a href="/info/6448">ферментативной активности</a>. Фракции с такой активностью собирали и наносили на вторую колонку для <a href="/info/15433">гель-фильтрации</a> (Б). Фракцию все еще недостаточно очищенного белка выявляли по <a href="/info/6448">ферментативной активности активные</a> фракции собирали и очищали до <a href="/info/186951">гомогенного состояния</a> на колонке (В), содержащей иммобилизованный
    Следует отметить, что потенциальные возможности гидрофобных адсорбентов до сих пор еще не реализованы. Несмотря на отсутствие у них хроматографической избирательности в отношении сходных компонентов смеси, гидрофобные адсорбенты могут быть очень полезными при грубом разделении белков на очень ранних стадиях очистки или даже на первой стадии. Если гидрофобную хроматографию использовать в качестве быстрого метода адсорбции в объеме , то она может заменить в некоторых случаях фракционирование сульфатом аммония, так как при этом исключается центрифугирование и получается более узкая зона, содержащая нужный белок. Это описано в следующем разделе. [c.185]

    Этот вводный параграф включен в данный раздел, чтобы показать, что очистку фермента можно проводить рутинным способом, совсем не измеряя содержание белка или измеряя его лишь в конечном препарате. Определение количества белка в ходе самого фракционирования нужно делать только в том случае, если знание концентрации белка имеет решающее значение для процесса очистки. Если же это не важно, то можно отобрать небольшие пробы и определить в них белок позже. [c.310]

    Полупроницаемые мембраны высокой прочности из нецеллюлозных материалов с калиброванными порами, через которые проходят низкомолекулярные вещества но не проникают высокомолекулярные белки, используют для очистки белков методом ультрафильтрации. Белковый раствор продавливают через такую мембрану сжатым газом или центробежной силой. Белок, остающийся в процессе ультрафильтрации на мембране, не только очищается от низкомолекулярных соединений и ионов, но и концентрируется. Если подобрать такой размер пор в мембране, что через них будут проходить не очень крупные белки, а большие белковые молекулы будут задерживаться, то ультрафильтрация может служить для фракционирования белков. [c.33]

    Следует отметить, что хроматография в системе ХОФ-5 является мягким способом фракционирования и очистки, по крайней мере в случае РНК. Известно, например, что нативная РНК фага MS-2, кодируюш,ая только три белка (оболочки фага, репликазу и белок А) в опытах in vitro ведет инициацию их синтеза в пропорции 70 25 5. После мягкой тепловой денатурации РНК эти синтезы инициируются уже с одинаковой скоростью, что можно объяснить утратой специфической третичной организации молекулы фаговой РНК. Оказалось, что после очистки в хроматографической системе ХОФ-5 РНК фага MS-2 полностью сохраняла нативные пропорции инициации указанныз выше синтезов. То же самое было показано и для РНК фага QP [ ampbell et al., 1980]. [c.173]

    Значительные трудности возникают при необходимости удаления высокомолекулярных примесей, например, нуклеиновых кислот и полисахаридов. Вообще говоря, все описанные ниже приемы фракционирования белков используются и для отделения их от этих биополимеров. Кроме того, нуклеиновые кислоты и полисахариды могут быть разрушены с помощью соответствующих гидролитических энзимов. Лилиды при выделении и очистке водорастворимых белков обычно не следуют за ними, особенно при многостадийной очистке. Однако их удаление в тех случаях, когда они образуют с белком прочный комплекс, чрезвычайно затруднительно, ибо экстрагенты липидов — органические растворители — могут денатурировать белок. [c.14]

    Большая часть методов выделения основывается на методике Чарльза и Скотта [5], которые использовали бычью печень и бычьи легкие как недорогой источник гепарина. Ткань подвергают автолизу и затем экстрагируют щелочным раствором. Растворимый белок удаляют, разрушая его с помощью ферментов, а жиры извлекают спиртом. Эта методика была упрощена обработке протеолитическими ферментами подвергалась непосредственно ткань [6, 7]. Предложен ряд методик окончательной очистки гепарина. Наибольшую ценность имеет метод, предусматривающий приготовление бензидиновой соли, которую затем превращают в кристаллическую кислую бариевую соль [8]. Кристаллическую кислую или нейтральную бариевую соль фракционируют. Новейшие методы заключаются во фракционировании цетилпиридиниевой соли [9 — 10] (см. также стр. 288) и адсорбции на колонках с различными ионообменными смолами [11 ] и ЭKTEOЛA-цeлJtюлoзoй [12]. Приведенная ниже методика основана на первоначальной методике Чарльза и Скотта [5, 8], и очистка проводится с использованием кристаллической кислой бариевой соли [13]. [c.365]


    В литературе имеются сведения о ряде методов, пригодных для определения углеводов [108], пентоз [109], липидов [110] и других веществ [43] в белках. Если известно, что белок содержит легко обнаруживаемую составную часть, то определение последней часто может служить хорошим средством контроля степени очистки. Например, содержащие медь белки — гемокупреин и гепатокупреин — были выделены путем фракционирования, ход которого контролировался с помощью определения содержания меди [111]. При выделении многих других белков, например белков, в состав которых входят производные тема, а именно фла-вина, тиамина или тироксина, были использованы подобные гке принципы, [c.22]

    Высаливание. Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солями называется высаливанием. Характерной особенностью белков, осажденных в процессе высаливания, является то, что после удаления соли они сохраняют свои нативные биологические свойства. Сушность процесса высаливания заключается в том, что ионы забирают на себя гидратную оболочку белка, одновременно нейтрализуя заряд белковой молекулы. Способность к высаливанию наиболее ярко выражена у многозарядных анионов, в частности у сульфатов. На практике для высаливания чаше всего применяют сульфаты натрия и аммония. Помимо солей для осаждения белков могут быть использованы органические водоотнимаюшие (гидрофильные) растворители — этанол, ацетон, метанол и др. Высаливание достаточно широко применяется для разделения и очистки белков. Для каждого белка существует своя зона высаливания, т. е. диапазон концентраций соли, позволяющий дегидратировать и осадить белок. После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции. [c.72]

    В последнем десятилетии XIX века было обнаружено, что в крови имеются вещества, содержащие углеводный остаток, химически связанный с белком. Первые попытки исследования химической структуры этих веществ связаны с именами Бьерри, Хьюитта, Римингтона и др. После второй мировой войны интерес к изучению этой проблемы резко возрос. Это было обусловлено в основном успехами в разработке методов фракционирования и идентификации белков. Усовершенствование методов очистки белков заставило химиков многократно повторять уже проведенные опыты со все более и более чистыми препаратами. Некоторые гликопротеины, исследованные в период 1920—1940 гг., например серомукоид, имели степень очистки, по современным представлениям составляющую 60—70%. Однако многие соединения, которые рассматривались в то время как одно или два вещества, впоследствии были разделены на большое число хорошо изученных гликопротеинов. Вещество, описываемое в этой главе, — а -кислый гликопротеин плазмы человека, рассматривается нами как индивидуальный белок. Однако недавно были получены сообщения о возможности дальнейшего разделения его на несколько компонентов, причем нельзя с уверенностью сказать, что каждый из этих компонентов является гомогенным по химической структуре. Следовательно, изучение физических и химических свойств вещества, которое доступно нам в настоящее время, дает возможность получить представление только о некоторой модельной молекуле с усредненной структурой. [c.67]

    Кэчлин [10] с помощью повторной очистки по методу Кона получил кристаллический гомогенный Pi-глобулин, обладающий всеми свойствами, характерными для железосвязывающего компонента сыворотки крови — трансферрина. По многим свойствам трансферрин напоминал соединение, впервые обнаруженное Осборном и Кэмпбеллом [11] в яичном белке. Авторы показали, что это соединение представляет собой индивидуальный белок, и назвали его кональбумином, так как он сопутствует овальбумину в процессе фракционирования. Кональбумин был впервые очищен Лонгсвортом и сотр. [12]. [c.118]

    Часто обнаруживается, что белок или полипептид существует в виде нескольких четко различимых форм, которые (часто по непонятным причинам) разделяются при помощи ОФ-ВЭЖХ. Такие неожиданности, конечно, осложняют фракционирование. Поскольку хроматография даже в наши дни все еще остается экспериментаторским искусством, то остается только посоветовать тщательно подбирать условия очистки образца, позволяющие получить материал в гомогенном состоянии. [c.209]

    Выпущенные фирмой LKB новые голубые колонки пред-иазначались для использования их при высоком давлении, однако было найдено (см. брошюры фирмы LKB), что низкие давления в сочетании с медленными скоростями потока дают значительно лучшее разделение. Главное достоинство этого материала, по-видимому, заключается в том, что он характеризуется очень широким интервалом фракционирования. В заданном диапазоне молекулярных масс разрешение лишь немногим лучше, чем то, которое достигается с помощью ультрагеля или се-факрила, имеющих более узкий интервал фракционирования. Вместе с тем существующие колонки для хроматографии белков с помощью ЖХВД могут быть использованы для разделения нескольких миллиграммов и дают превосходные результаты на заключительных стадиях очистки белков, когда белок составляет лишь небольшую долю количества исходного материала. [c.205]

    Снижение эффективной активности воды, как правило, бывает полезным для ферментов, если оно осуществляется способами, не оказывающими дестабилизирующего действия на белок. Высокие концентрации сернокислого аммония, при которых фермент осаждается, проявляют сильное стабилизирующее влияние, и фактически большинство ферментов, имеющихся в продаже, представляют собой суспензии в 2—3 М сернокислом аммонии. Кроме того, для сох ранеиия активности ферментов, а также для предотвращения бактериального загрязнения используется 50%-ный глицерин или лиофилизация. Во время очистки ферментов обычно необходимо оставлять фракции на ночь или даже на более длительное время, и в данном случае следует уделять особое внимание оптимизации условий хранения. При фракционировании сернокислым аммонием фермент нужно оставлять в системе, содержащей как можно более высокую концентрацию сернокислого аммония, например в виде осадка, а не раствора, полученного после его повторного растворения. Если нельзя избежать хранения ферментного раствора в отсутствие защитных агентов, то следует оценить относительные преимущества кратковременного замораживания этого раствора или хранения его при температуре около 0°С в присутствии протеолитических ингибитаров. Замораживание может инактивировать ферменты. Чувствительность различных ферментов к замораживанию очень сильно варьирует. Потери всегда будут меньше, если начальная концентрация белка высока. Не рекомендуется замораживать раствор с концентрацией белка ниже чем около 2 мг-мл . Следует помнить, что во время замораживания сначала заме рзает чистая вода, что сопровождается повышением концентрации белка и других растворимых веществ. Затем выпадают в осадок наименее растворимые ве- [c.259]

    Выделение вирусных белков так же, как и очистка вирусов, представляет отдельную проблему. Относительно легко удается выделение белков из тех вирусов, которые содержат только белок и нуклеиновую кислоту. Причем предпочтительнее иметь дело с теми вирусами, оболочка которых построена из идентичных белковых субъединиц. Гораздо труднее выделять гомогенные препараты вирусных белков из сложноорганизоваппых вирусов, Так, в обо-лочке бактериофагов доказано существование нескольких белков, различных по своим свойствам. Еще сложнее рабо тать с вирусами животных и человека, а особенно с миксовирусами. Перспектива достичь выделения всех составных субъединиц оболочки в виде препаратов, пригодных к исследованию, еще более ограничена. К сказанному следует добавить, что возникает еще проблема фракционирования вирусных белков, [c.168]


Смотреть страницы где упоминается термин Очистка и фракционирование белков: [c.154]    [c.14]    [c.10]    [c.54]    [c.119]    [c.210]    [c.19]    [c.125]    [c.15]    [c.210]   
Смотреть главы в:

Хроматография белков и нуклеиновых кислот -> Очистка и фракционирование белков




ПОИСК





Смотрите так же термины и статьи:

Очистка и фракционирование



© 2025 chem21.info Реклама на сайте