Приготовление антисыворотки

Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — антитело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином). На практике используется множество комбинаций, включающих антисыворотки с различными специфичностями, фрагменты антител, гаптены, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антигены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками [88]. [c.125]

Бульонную культуру наносят петлей на чистое предметное стекло и оставляют для высыхания на воздухе без подогревания. (Если в таком же мазке, окрашенном кристаллическим фиолетовым, присутствует более чем 15—25 клеток при просмотре в микроскоп с иммерсией, культуру следует разбавить, так как при слишком высокой концентрации клеток можно получить неточный результат.) К антисыворотке добавляют воду и наносят полученный раствор петлей на покровное стекло. Одну петлю 1 %-ного водного раствора метиленового синего смешивают с антисывороткой и кладут покровное стекло каплей вниз на предметное стекло с высушенным мазком. Смотрят препарат в микроскоп с масляной иммерсией. Положительная реакция капсулы вокруг окрашенных в синий цвет клеток становятся четко очерченными. Всегда следует проводить сравнение с контрольным препаратом, приготовленным с нормальной кроличьей сывороткой вместо антисыворотки. Если резуль- [c.66]

На рис. 19-1 показана относительная эффективность теста при определении ревматоидных факторов IgM- и IgG-классов. Форма кривых свидетельствует о том, что в то время как лизис эритроцитов способна вызывать одна молекула IgM-РФ, для лизиса, опосредованного IgG-РФ, необходимо, чтобы к мембране в тесном соседстве друг с другом присоединились по крайней мере две его молекулы. Ревматоидный фактор IgG-класса будет подчиняться одноударной кривой титрования, если добавить специально приготовленную проявляющую антисыворотку, свя- [c.318]

Перед началом иммунизации отбирают небольшую порцию крови для приготовления нормальной контрольной сыворотки. Кровь отбирают и в ходе иммунизации для наблюдения за ростом содержания иммунных антител. Когда это содержание становится достаточным, из ушной вены берут кровь для приготов ления антисыворотки (40—50 мл). В тот же день можно ввести кролику очередную порцию антигена, а через восемь дней — снова брать кровь. Затем следует дать животному отдохнуть в течение четырех недель. После этого достаточно одной инъекции антигена, для того чтобы содержание в крови нужных антител восстановилось на прежнем уровне. Таким образом, удается использовать одного иммунизированного кролика в течение года. Некоторые исследователи предпочитают брать кровь у кролика прямо из сердца, осторожно вводя в него длинную иглу 18-го калибра. В норме кролик после этого остается жив. [c.107]

Приготовление специфической антисыворотки. [c.297]

Используя специфические связывающие свойства антител, исследователь может выбирать между двумя различными формами реагента, приготовленного на их основе это обычные поликлональные антисыворотки (или иммуноглобулиновые фракции, полученные из сыворотки) и моноклональные антитела (МКА). Препараты и тех, и других получают различными путями с различной целью выбор между ними осуществляется зачастую не произвольно, а в большой степени зависит от соответствия специфических свойств антител требованиям теста. [c.21]

Пробы инкубируют в панелях Терасаки, в лунки которых вносят по 10 мкл соответствующих разведений антисыворотки или перитонеальной жидкости. Параллельно в качестве контроля в лунки вносят такие же разведения нормальной сыворотки, а в две лунки — раствор, используемый для приготовления разведений. Для создания влажной атмосферы по периферии панелей наливают воду, и во время работы стараются как можно реже их открывать, чтобы свести к минимуму испарение жидкости. В лунки добавляют по 5 мкл суспензии бактериофагов в фосфатном буфере с желатиной (состав буфера см. в приложении). содержащем 20% питательного бульона (для того чтобы предохранить фаги от разрушения в ходе длительной инкубации). Число фаговых частиц (в единицах образования зон лизиса) в 5 мкл этой суспензии должно составлять 1000. Закрытую панель Терасаки помещают во влажную атмосферу в стек- [c.498]

Для приготовления иммуносорбента необходимо иметь очищенный антиген. Если речь идет о препаративном получении специфических антител, то без этого, очевидно, не обойтись. Однако при очистке относительно небольшого количества антител можно ограничиться разделением исходного клеточного экстракта, например методом электрофореза, и отделять специфические антитела из антисыворотки по их связыванию с зоной (полосой или пятном) антигена в геле. Удобнее для этой цели использовать не сам гель, а его реплику на диазобумаге [Остерман, 1981], где антигены фиксируются ковалентно. [c.112]

На основании собственного опыта мы считаем, что лучшим способом оценки активности и специфичности конъюгатов может быть пробное окрашивание образцов клеток, их мембран или цитоплазмы. Действительно, классические контроли специфичности окрашивания, такие, как торможение избытком немеченых антител или адсорбция антисыворотки соответствующим антигеном, очень часто практически неосуществимы. В этих случаях однотипное окрашивание фиксированных мазков, приготовленных из клеток какой-либо другой ткани или другого вида, свидетельствуют о неспецифичности конъюгата. [c.172]

Пастеровской пипеткой наносят одну каплю антисыворотки на приготовленный препарат. [c.309]

При иммуноэлектрофорезе сначала разделяют смесь антигенов действием электрического поля (антигены с разной скоростью мигрируют в агаровом геле, приготовленном на соответствующем буфере). Затем заполняют антисывороткой траншею, идущую параллельно движению антигенов под действием электрофореза, и проводят иммунодиффузию. [c.367]

Число линий преципитации на электрофореграмме зависит от используемой иммунной сыворотки. Например, хорошо себя зарекомендовавшая кроличья антисыворотка к белкам сыворотки человека фирмы Behringwerke (ФРГ) и аналогичная лошадиная антисыворотка института Human (Венгерская Народная Республика) позволяют идентифицировать примерно 20 белковых фракций сыворотки. Принципиальная возможность приготовления антисыворотки практически к любому белку значительно увеличивает применимость иммуноэлектрофореза. Кроме того, приготовив антисыворотки, специфичные к какому-либо одному-единственному белку (или небольшому числу белков), можно в смеси белков исследовать составляющие ее отдельные компоненты. Иммунные сыворотки, предназначенные для иммунохимического анализа отдельных белков плазмы человека, уже имеются в продаже. [c.21]

Приготовление иммунной сыворотки требуемого качества нередко встречает серьезные затруднения. Животные-продуценты существенно различаются по способности синтезировать антитела, причем наряду с межвидовыми имеются значительные индивидуальные различия в иммунореактивности животных-продуцентов в пределах одного вида. Поэтому рекомендуется одним антигеном одновременно иммунизировать несколько животных тем самым повышается вероятность получения антисыворотки хорошего качества, дающей необходимое число полос преципитации. [c.148]

Приготовление пластинки агарового геля. 1 %-ный расплавленный агар наливают на дно чашки Петри (см. стр. 131). В затвердевшем агаровом геле при помощи пробойника для пробок или иного подходящего для этой цели инструмента (фиг. 34) делают лунки для исследуемого антигена и антисыворотки, как описано на стр. 131. Центральная лунка в диаметре должна примерно в 4 раза превышать расположенные на равном расстоянии от нее периферические лунки (12—16 п З-е-4 нм соотвехетвеяно). Две соседнйё периферические лунки должны агстоятн -друг от друга дальше, чем от центральной лунки. [c.157]

Приготовление агаровой пластинки, содержащей антитела. Готовят 3%-ный агар на 0,03 М калий-фосфатном буферном растворе pH 8,0, содержащем 0,1 М ЫаС1, и помещают его в водяную баню при 56°С. Соответствующую моноспецифическую антисыворотку разбавляют в зависимости от титра фосфатным буферным раствором (см. примечание 2) и нагревают также до 56 С. 8 мл нагретого 3%-ного агара и 8 мл подогретой антисыворотки смешивают при 56°С и 15 мл смеси наливают на стеклянную пластинку размером 8 X 10 см, расположенную на горизонтальной поверхности. После затвердения агара пластинку помещают во влажную 1<амеру и хранят в холодильнике до использования. (Рекомендуется к смеси агара и антисыворотки добавлять мертиолат в разведении 1 [c.159]

Для того чтобы осуществить скрещивание двух мутантов фага, применяется одновременная адсорбция двух гнтаммов фагов на бактериях. Необходимо создать такие условия, чтобы различные частицы фага произвели инъекцию своей ДНК в одну и ту же клетку. С этой целью берут значительный избыток числа частиц фагов над числом клеток в миллилитре и, кроме того, в среду, в которой происходит заражение, добавляется агент, тормозящий синтетические процессы в клетках (K N). Это делается для того, чтобы инъекция ДНК первой частицей фага не помешала вторичной инъекции следующим фагом. Когда метаболические процессы в клетке не остановлены, подобное взаимное влияние имеет место. Когда стадия заражения прошла, культура бактерий осво--бождается от избытка фагов с помощью центрифугирования или с помощью имунной антисыворотки и переносится на нормальную питательную среду, на которой идет созревание и лизис клеток. Последний этап — нанесение культуры на чашки Петри, специально приготовленные для отыскания рекомбинантов. Вся процедура достаточно проста. В процессе созревания одного поколения фагов рекомбинационному процессу подвергается практически каждая хромосома фага, а часто происходят и тройные рекомбинации (Херши),которые обнаружатся, если провести заражение клеток тремя типами мутантов, отличающимися по трем разным локусам. Последний факт показал не только, что в процессе генетической рекомбинации участвуют все молекулы ДНК фага, но более того, — что рекомбинация повторяется многократно с каждой молекулой в течение одного цикла созревания. [c.368]

Агаровый или агарозный гель является наиболее подходящей средой для иммунодиффузии, В классическом варианте иммуноэлектрофореза и электрофорез, и иммунодиффузию осуществляют в одном и том же геле. Однако во многих случаях иммунодиффузию приходится проводить уже после того, как макромолекулы были разделены в другой среде, менее подходящей для иммунодиффузии. Паулик [1027] еще в 1852 г. применил иммунодиффузию для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза на бумаге. Хотя иммунодиффузию можно осуществлять и на ацетате целлюлозы (см. ниже), Кон [695] предложил переносить антигены с ацетата целлюлозы в агаровый гель вместо того, чтобы проводить весь иммуноэлектрофо-ретический анализ на ацетате целлюлозы. Пленку из ацетата целлюлозы, на которой антигены подвергали электрофорезу, разрезают на две половинки одну из них окрашивают, а из другой вырезают полоску шириной 1 см (на расстоянии 1 см от центральной линии) и помещают ее на поверхность заранее приготовленного агарового геля, следя за тем, чтобы под ней не образовывались пузырьки воздуха. Можно также быстро окрасить одну половинку полоски, а вторую разрезать на кусочки, так чтобы каждый из них содержал отдельную электрофоретическую фракцию. Эти кусочки пленки помещают на поверхность агарового геля, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Пропитанные соответствующей антисывороткой полоски фильтровальной бумаги шириной 2 мм кладут на гель параллельно кусочкам пленки и на оптимальном расстоянии от них. Это расстояние определяется теми же факторами, что и в случае иммуноэлектрофореза в агаровом геле. После завершения иммунодиффузии с поверхности геля удаляют полоски бумаги и кусочки пленки, а затем фотографируют полученную картину преципитации. Для приготовления стабильных препаратов гель высушивают и окрашивают по методике, предназначенной для иммуноэлектрофореграмм в агаре. Удаление лишних белков перед высушива1нием геля, как правило, не является обязательным. [c.243]

Выделяемые таким образом препараты вирусов не содержат пигментов ра-стення-хозяииа и характеризуются типичным для нуклеопротеидов спектром поглощения в ультрафиолетовом свете (максимум прн А,= 260—265 нм, минимум при А,=247 нм). Соотношение Егво/Егао составляет для ХВК 1,2 УВК—1,15— 1,20 МВК и 5ВК—1,2—1,25. Коэффициент седиментации в зависимости от вируса и растворителя находится в пределах 115—200 5. Очищенный препарат не должен реагировать с антисывороткой, приготовленной к экстракту из здоровых растений в электронном микроскопе должны обнаруживаться в препаратах только нитевидные вирионы. [c.277]

На нерастворимом носителе (сефароза, целлюлоза) могут быть иммобилизованы антитела, так что с помощью такого сорбента можно извлечь из смеси антигенов определенный антиген. Ковалентное связывание антител с носителе.м производят по возможности в мягких условиях, чт )бы исключить их денатурацию. В связи с необходимостью фиксировать большие количества белка для приготовления иммуносорбеита крайне редко используют очищенные антитела. Обычно используют выделенные из антисыворотки иммуноглобулины. [c.242]

Большое разнообразие макромолекул, изучаемых с помощью антител, включает не только естественные продукты животных н растений, но, и продукты микробного происхождения, и синтетические вещества. Приготовление поликлональной антисыворотки к определенным молекулам может включать предварительную очистку, если нельзя получить очищенный коммерческий препарат. Для компонентов клеточной поверхности современный подход — это получение моноклональных антител требуемой специфичности при этом решается проблема очистки иммуногена (см. гл. 3). С другой стороны, с помощью уже существующих антител можно очистить компоненты клеточной поверхности, а также проводить обогащение клеток, экспрессирующих антиген-мишень. Эти подходы обсуждены в гл. 5. Метод экстракции имеет большое значение в тех случаях, когда необходимо получить полиспецифическую антисыворотку к смеси иммуногенов, например экстрагированных клеточных мембран, гомогенатов тканей, разрушенных ультразвуком бактерий, вирусов и паразитов. Невозможно в этой главе привести детальное руководство по экстракции и очистке огромного разнообразия иммуногенов. Существует специальная литература, посвященная методам получения углеводных, бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных антигенов [21]. Очистка с помощью аффинной хроматографии описана в гл. 5, а приготовление иммуноглобулинов [c.50]

Описанный выше метод применяется для разделения экст-рапированных бактериальных и паразитарных антигенов, а также компонентов сыворотки человека. Он позволяет получать хорошие полосы бел ков с мол. массой от 150 до 10 кДа. Для ограничения этого диапазона можно изменить концентрации акриламида. Известны наборы для приготовления минигелей см. приложение). В них. входят специальные кассеты для заливки гелей. Они более экономичны с точки зрения расхода реагентов и требуют меньше времени, но одновременно снижается разрешающая способность при разделении очень сложных смесей. Компромисс состоит в использовании мини-гелей с различными концентрациями акриламида. Рис. 2.4 иллюстрирует разрешающую способность 14%-ного геля шириной 14 см при разделении экстрагированных из мембран и разрушенных белков Е. oli и микобактерий. Последние служат исходным материалом для получения как моноклональных антител, так и кроличьей полиспецифической антисыворотки. Белки Е. соИ получают следующим образом [27]. [c.62]

Приготовление панелей для типирования. Чтобы предотвратить испарение, в каждую лунку корнуэльским шприцем не-прерывного действия вносят минеральное масло. В соответствии с протоколом опыта в лунки в нужной последовательности вносят далее по 1 мкл каждой типирующей антисыворотки, пользуясь гамильтоноаским шприцем на 50 мкл. При этом расположение лунок, содержащих данную антисыворотку, нп всех панелях должно быть совершенно одинаковым этот момент чрезвычайно важен. Капли сыворотки могут поплыть по поверхности масла и собраться у краев лунки, вместо того чтобы находиться в ее центре. Добиться правильного положения капли легче, еслн подкрасить сыворотки, добавив 0,001% фенолового [c.196]

Разумеется, для получения надежных результатов необходимы высокоактивные и высокоспецифические флуоресцирующие реагенты. Многие из широко используемых реагентов, например антисыворотки к иммуноглобулинам человека, имеются сейчас в продаже, однако выбор их, конечно, весьма ограничен. В настоящей главе мы рассмотрим приготовление, очистку и контроль препаратов антител, меченных флуорохромами, и применение таких антител для анализа мембранных антигенов живых клеток и внутренних антигенов фиксированных клеток. Читатель не найдет здесь полного обзора методов иммунофлуоресцеиции, а познакомится с практическими рекомендациями, помогающими в их освоении. [c.165]

Мы не касаемся здесь вопросов приготовления аитисывороток и выделения чистых антител. Антисыворотки конкретной специфичности, которые могут понадобиться при работе методом флуоресцирующих антител, настолько разнообразны, что их трудно даже перечислить. Отметим только, что главное условие приготовления антиглобулиновых реагентов и чистых антител — это предварительное выделение высокоочищенных аитигеиов. [c.165]

Клетки суспендируют в растворе, обогащенном белком, например в ЗФР с 3% БСА или 50% СПК- Концентрация клеток в суспензии может быть различной в зависимости от их типа. При изучении иммуноглобулинов в плазматических клетках, которые составляют лишь малую долю клеточной популяции селезенки, лимфатических узлов или других лимфоидных органов, обычно готовят густую суспензию с плотностью 4-10 клеток в 1 мл. Напротив, если ожидаемая доля клеток, несущих иммуноглобулины, значительно выше (как, например, в суспензии клеток солидной плазмоцитомы или костного мозга при множественном миеломатозе, а также в случае перевиваемых лимфобластов и стимулированных культур лимфоцитов), концентрация клеток не должна превышать 10 в 1 мл. Для приготовления мазков очень удобно пользоваться цитоцентрифугой. Центрифуги этого типа (например, фирмы ЗЬап(1ап, Лондон) позволяют собрать клетки в монослой на участке диаметром 5—7 мм и окрасить их небольшим объемом (10—20 мкл) меченой антисыворотки. [c.177]

Другой подход в приготовлении моноспецифических реагентов состоит в иммунизации животных очищенными HLA-антигенами (Ferrone et al., 1973). Однако получаемые таким способом ксеногенные антисыворотки не свободны от указанных выше недостатков и, кроме того, содержат различные гетерофильные антитела, реагирующие с лимфоцитами человека. [c.237]

Для выявления какого-либо поверхностного клеточного антигена нужно иметь специфичные к нему антитела и метод, позволяющий подсчитать, какое число клеток в данной популяции связывает эти антитела. Приготовление антисывороток к поверхностным клеточным антигенам подробно описано в гл. 13. Существуют два основных способа выявления клеток, несущих такие антигены. Один из них состоит в том, что антисыворотку обрабатывают флуорохромом, и в результате этого соответствующие клетки флуоресцируют в ультрафиолете (см. гл. 9). Вместо этого можно обрабатывать клеточную популяцию антисывороткой и комплементом при этом клетки, связавшие антитела, погибают, и их можно обнаружить с помощью витального красителя, например трипанового синего. В настоящей главе описан метод определения поверхностных клеточных антигенов, в котором клетки, связавшие антитела, выявляются с помощью особым образом обработанных бараньих эритроцитов (БЭ). Преимущество этого метода состоит в том, что, обладая высокой чувствительностью, он позволяет достаточно быстро исследовать большое число клеток антитела при этом используются в немодифи- [c.273]

Метод включает обработку клеточной популяции антисывороткой к искомому поверхностному антигену, а затем индикацию клеток, связавших антитела, с помощью бараньих эритроцитов. Если лимфоидная клетка имеет на своей поверхности соответствующий антиген, эритроциты скапливаются вокруг нее и образуется легко различимая под микроскопом розетка. Клетки, ие содержащие искомого антигена, не связывают антитела и поэтому не привлекают индикаторные БЭ. Для приготовления индикаторных БЭ их нагружают стафилококковым белком А. Это белок с мол. весом 42 000, который входит в состав клеточной стенки Staphylo o us aureus и специфически связывает F -фраг-мент иммуноглобулинов класса G некоторых видов животных (Sjoquist et al., 1972). [c.274]

Антисыворотку удаляют, тщательно промывая клетки PBS. К клеткам добавляют суспензию S. aureus, штамм owan, приготовленную по методу Прингла и Парри [23], или коммерческий препарат стафилококков и инкубируют 5 мин при 37 °С (время инкубации на данном этапе имеет решающее значение и должно быть подобрано экспериментально). [c.149]

Антисыворотка. Антисыворотку к Т4 получают иммунизацией кроликов препаратом Т4 в комплексе с бычьим сывороточным альбумином, приготовленным по методике Гариба и др. (Gha- [c.265]

Приготовленный таким образом иммуносорбент переводят в 0,01 М фосфатный буфер (pH 7) с 0,15 М Na l, заполняют им небольшую колонку, на которую и наносят антисыворотку или иммуноглобулины, растворенные в том же буфере. Колонку хорошо промывают фосфатным буфером, но с удвоенной концентрацией соли, а иногда и с добавкой 1—2% неионного детергента Тритона Х-100 —все это для снятия неспецифически сорбированных белков. Элюировать антитела с колонки можно 0,1 М уксусной кислотой или 4,5 М раствором Mg b. Затем следуют завершающие операции нейтрализации, диализа и, если надо, концентрирования раствора очищенных антител. Колонку регенерируют, хорошо промывая посадочным буфером, и хранят на холоду с добавкой 0,1% азида натрия. [c.111]

Одновременно с приготовлением лунок прорезают скальпелем продольные стороны канавок для антисыворотки, так чтобы ближайшая к будущему треку белков сторона канавки была от него на расстоянии 5—10 мм. Ширина канавки составляет 2— 3 мм. До окончания электрофореза гель из канавки лучше не удалять в интересах сохранения однородности электрического поля во время электрофореза. Лунки и канавки удобно вырезать по шаблону из плексигласа (рис. 32). Показанные на шаблоне три отверстия в каждом треке предусмотрены для обоснованного вьние выбора положения лунки для препарата. Использование шаблона позволяет обеспечить стандартность исходного положения лунок и ориентации канавок, что существенно для со- [c.135]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология