Иммунный анализ антитела

Другим перспективным направлением в разработке амперометрических биосенсоров является создание устройств, основанных на иммунологических реакциях. Принцип иммунного анализа заключается во взаимодействии исследуемого вещества, называемого антигеном (АГ), со специфически связывающимся с ним антителом (АТ) с образованием комплекса АГ -АТ. При фиксированной концентрации антитела (антигена) равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена (антитела) зависит от его общей концентрации. Таким образом, неизвестную концентрацию антигена (антитела) можно определить при помощи фиксированного количества меченых антител (антигенов). Для этого антиген или антитело метят ферментами. Разработанные к настоящему времени иммуноферментные амперометрические датчики можно классифицировать следующим образом [c.506]

В Сандвичевом иммунном анализе определяемое вещество из пробы захватывается избытком антител, а количество захваченного определяемого вещества оценивают с помощью второго антитела, образующего, таким образом, сандвич. [c.572]

Эта разработка положила начало развитию твердофазного иммунного анализа, в котором, однако, возникают дополнительные трудности, особенно в аспекте термодинамики взаимодействий. Твердофазный анализ отличается от анализа в жидкой фазе как по реакционной способности иммобилизованного антитела или антигена, так и по различию кинетики реакций в растворе и реакций, включающих твердую фазу (см. также разд. 7.8). [c.574]

В твердофазном иммунном анализе твердая фаза играет роль несущей подложки . Ее, однако, нельзя рассматривать как пассивный компонент. Можно использовать и химическую, и физическую адсорбцию антитела или антигена, хотя большинство иммунных определений основано на физической, нековалентной адсорбции. Как обсуждалось в разд. 7.8, даже физическая адсорбция представляет собой недостаточно изученный процесс. Связывание белков, по-видимому, имеет гидрофобную природу, и все же в естественной конфигурации белков в водном растворе гидрофильные группы стремятся расположиться на поверхности, а гидрофобные группы — внутри полимера. Следовательно, связывание с гидрофобными поверхностями неизбежно вызывает изменение кон- [c.574]

Интересным развитием идеи использовать ферментные метки является контроль соотношения связанный свободный> путем изменения активности фермента в результате связывания в конъюгат с антителом или дополнительного связывания антиферментных антител. Такие способы анализа не нуждаются в этапе разделения, а значит, можно упростить проведение определения. Разработано несколько способов гомогенного ферментативного иммунного анализа (ФИА). [c.595]

Рис. 7.9-17. Иммунный анализ с помощью фермента, меченного кофактором. Антитело, связанное с меченым гаптеном, не принимает участия в ферментативной реакции.

Рмс. 7.9-16. Флуоресцентный иммунный анализ с субстратом-меткой. Антитело, связанное с меченым гаптеном, ингибирует его как субстрат для фермента. [c.598]

К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену (рис. 9.2). Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет [c.185]

Биохимия не только использует в своих целях методы, созданные в рамках других химических дисциплин, но и вооружает химию новыми методами, основанными на применении биополимеров как инструмента химического исследования. Ферменты часто позволяют с уникальной, недоступной обычным химическим приемам избирательностью провести анализ сложных реакционных смесей, осуществить химические превращения в мягких условиях, избегая побочных реакций и побочных продуктов. Большое значение для решения тонких аналитических задач приобрели иммунохимические методы, использующие в качестве инструмента анализа антитела — белки, вырабатываемые высшими живыми организмами в ответ на введение чужеродных веществ. Антитела обладают способностью избирательно взаимодействовать именно с этими, вызвавшими иммунный ответ веществами и могут поэтому использоваться для их определения в сложных смесях. [c.10]

Гомогенный тип и простота метода ЛИКА позволяют использовать его для экспресс-анализа антител, оценки связывающей способности иммунных сывороток. Действительно, тепень ингибирования светового излучения конъюгата кофактор— антиген гомологичной иммунной сывороткой пропорциональна концентрации в ней антител и определяется их константой связывания. Анализируя ряд сывороток в одних и тех же разведениях, можно достаточно быстро оценить и сравнить их связываюш,ую способность. [c.127]

Все белки, изученные до сих пор, обладают антигенными св-вами. У белков различают линейные детерминанты, построенные из аминокислотных остатков, расположенных рядом в одном участке полипептидной цепи, и конформационные, к-рые слагаются из аминокислотных остатков разных участков одной или большего числа полипептидных цепей. Антитела, полученные при иммунизации данного животного определенным белком, могут реагировать, хотя и с небольшим сродством, с нек-рыми пептидами, выделенными из гидролизата зтого белка. Такие пептиды, построенные из 5-7 остатков, часто располагаются на изгибах или выступающих отрезках пептидной цепи и, очевидно, являются детерминантами или их частями. Однако в иных условиях, напр, при иммунизации др. вида животного, могут образовываться антитела к иным участкам молекулы того же белкового А. Практически вся пов-сть белковых молекул обладает антигенными св-вами, она, т. обр., представляет собой сумму перекрывающихся детерминант, каждая из к-рых может вызывать иммунную р-цию или не вызывать ее в конкретных условиях. Последние определяются различиями в строении между белковым А, и собственными белками организма, а также регуляторными иммунными механизмами, находящимися под генетич. контролем. По-видимому, почти все детерминанты белков конформационно зависимы. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, антигенные детерминанты обладают повыш. подвижностью. [c.174]

В принципе возможен систематический анализ любой системы иммуноглобулин — лиганд. Исследование моделей связывания может проводиться систематическим образом, поскольку у млекопитающих, например кроликов или коз, синтез антител может индуцироваться по отношению к любой специально подобранной молекуле (с низкой или высокой молекулярной массой). Используя аффинную хроматографию, получаемые антитела затем очищаются. Как правило, эта процедура приводит к вырожденному иммунному ответу, т. е. к синтезу нескольких видов антител несколькими клонами так называемых клеток плазмы (542]. Эти антитела отличаются константами сродства к лиганду, что проявляется также в химических, спектральных и иммунологических свойствах центров связывания. Последующие анализы аминокислотной последовательности показали, что различия вызваны аминокислотными заменами в гипер-вариабельных областях доменов /ь и Ун [622]. На первый взгляд кажется, что вырожденный ответ должен усложнить пространственную организацию центров связывания. В действительности, однако, в этом случае возможно объединить и взаимно контролировать данные по нескольким центрам связывания, что заметно увеличивает вероятность нахождения правильных моделей. [c.245]

Рис. 7.8-3. Типы иммуносенсоров, а — Moдифициpoвaiшaя антителами поверхность преобразователя б — конкурентный иммунный анализ, [ ] ос l/[Ag] в — сандвичевый иммунный анализ, [ ] ос [Ag] г—гомогенный иммунный анализ, [ ] ос l/[Ag].

В иммунном анализе определяемое вещество не связано с продуктом каталитической реакции, а является меткой, маркирующей наличие комплексного или свободного антигена илн антитела. Основы иммунного анализа обсуждаются в разд. 7.9. Так же, как в ферментативных тест-наборах (например, для определения глюкозы), на основе иммунного анализа создано большое число тест-наборов например, в тесте на беременность — хотя здесь результат рассчитан на наблюдение пользователя за развитием о1фаски и не контролируется автоматически (т. е. детектором служит человеческий глаз ). На такой тест-полоске [c.551]

Устройство ввода на основе решетки позволяет завести свет в световод. Решетка —это периодическая структура (например, треугольная, пилообразная, синусоидальная) (рис. 7.8-21), которая нанесена на поверхность световода. Когда свет падает на решетку он возбуждает в световоде проходящую моду в зависимости от периода решетки. Чтобы усилить эффект изменения показателя преломления на границе раздела, изменения, происходящие на поверхности решетки, надо перенести на световод. Например, на рис. 7.8-21 свет, падающий вблизи устройств ввода, будет возбуждать проходящие моды, зависящие от показателя преломления окружающей среды. В этом варианте поверхность становится чувствительной к тонким изменениям показателя преломления. Этот вариант, следовательно, подходит для проведения безметочного иммунного анализа, поскольку связывание между иммобилизованным антителом и антителом пробы дает большую плотность этих молекул на расстоянии порядка длины волны вглубь от поверхности (заметьте, что глубина проникновения света составляет величину порядка длины волны, уравнение 7.8-34) и, таким образом, приводит к изменению показателя преломления. Например, конкурентный иммунный анализ можно применить для определения пестицидов, при этом на модифицированной аминосиланом поверхности устройства связи ковалентно иммобилизован триазиновый гаптен, а связывание антитела детектируют за счет измерения угла несвязывания [7.8-53, 7.8-54]. Чтобы детектировать присутствие триазиновых пестицидов, пробу следует предварительно выдержать с антителами, а затем — перенести к иммобилизованному гаптену. Очевидно, чтобы обеспечить невмешательство пользователя в эту процедуру анализа, в устройстве должен быть предусмотрен этап выдержки. [c.559]

При разработке иммунного анализа целью является проследить за равновесием между антителом и антигеном. При анализе исследуют связывание антигена с антителом и различают связанный и несвязанный антиген. Поскольку процесс имеет равновесный характер (уравнение 7.9-1), линейной зависимости от концентрации антигена нет. Следовательно, важно знать характеристический отклик связьгеания как функцию концентрации антигена. [c.567]

В конкурентном иммунном анализе устанавливают число центров, не занятых пробой он может иметь различные варианты, но суть в том, что определяемое вещество пробы смешивают с меченым определяемым веществом, и они конкурируют за активные центры (рис. 7.9-4). Метсд требует разделения связанного и свободного антигена или антитела с целью определения их относительных количеств. Если определяют антиген, присутствие меченого антигена позволяет оценить относительное разделение. Как можно заключить из кривых иа рис. 7.9-3, оптимальная чувствительность достигается при уменьшении концентраций меченого антигена и антитела. [c.569]

Из кривых на рис. 7.9-5 очевидно, что изменение сигнала в результате [AAg ] является функцией концентрации антитела, используемой в анализе (рис. 7.9-5,б), и что уровень антител, даюищй максимальную чувствительность, зависит от концентраций меченого и определяемого антигена. Традиционно системы иммунного анализа имеют тенденцию давать погрешность при высокой концентрадии реагента со степенями связывания 0,4-0,5. Действительно, из рис. 7.9-3,а и б, видно, что связывание в этой области (0,4-0,5) слишком велико, чтобы привести к большому изменению степени связывания антигена при низкой концентрации последнего. Однако нельзя игнорировать сигнал, относящийся к неспецифическому связыванию, поэтому чувствительностью поступаются в пользу более низких помех за счет неспецифического связывания при более высоких концентрациях антител. [c.571]

Рис. 7.9-14. Принцип иммунного анализа по поляриза цнн флуоресценции. Связывание антитела с антигеном, мечег1ым флуорофором, увеличивает поляризацию флуоресценции.

Для данного флуорофора изменение поляризации флуоресценции зависит от молекулярной массы антигена и природы комплекса с антителом должно иметь место надлежащее изменение молекулярной массы, а этого нельзя добиться с большими антигенами. В целом, хфинято считать, что иммунный анализ ло поляризации флуоресценции неприменим к антигенам с молекулярной массой выше 20000. [c.592]

Ферменты служат, пожалуй, наиболее широко используемыми в иммунном анализе метками, однако они непосредствшно не участвуют в измерении, в отлнчие от изотопов или флуоресцеьгсных меток. Вместо этого, измерение может включать детектирование расхода ферментного субстрата илн накопления продукта, требуя, таким образом, наличия в анализе другого реагента и привнося в метод дополнительные сложности. Тем не менее, поскольку одна молекула фермента может вызвать превращение многих молекул субстрата, имеется очень высокий потенциал усиления сигнала, и это преимущество перевешивает часто упоминаемый недостаток несовместимой оптимизации условий конечного этапа ферментативного анализа и связывания антитело—антиген. [c.594]

А. Иммуноэлектрофоретический анализ (ИЭА) [41], Антигены вначале разделяют путем электрофореза в агарозном геле, Верхняя часть рисунка демонстрирует классическое расположение ИЭА нижняя часть ИЭА называется тандемной стрелки показывают положение лунок, в которые заливают перед электрофорезом растворы антигенов. После электрофореза в геле параллельно направлению электрофоретической миграции прорезается канавка, которая заполняется иммунной сывороткой. Антитела и антигены диффундируют в гель, встречаются и образуют дуги преципитации, [c.102]

РНП, и полипептиды, общие для нескольких разных РНП. Это показано с помощью иммунного анализа с использованием сыворотки пациентов с некоторыми видами красной волчанки, у которых вырабатываются антитела к белкам мяРНП. [c.222]

Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуно анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитическо активностью, позволяющей с применением соответствующих суб стратных систем регистрировать ферменты в растворе на уррвн( 10-15 д ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло ГИИ принципиально решена проблема введения ферментной метки I молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди нениями с целью получения соответствующих конъюгатов. [c.78]

Если весь процесс иммуноферментного анализа условно разделить на три основные стадии - формирование специфического комплекса антиген — антитело (иммунохимический процесс), введение в него метки и ее визуализация тем или иным физическим способом, то можно заметить, что основное внимание в данной книге фокусируется на второй и третьей стадиях, представляющих преимущественно энзимологический аспект проблемы. В книге рассмотрены практически все известные способы регуляции активности ферментов, как химические (с помощью активаторов, ингибиторов, субстратов, простетических групп), так и физические (путем изменения активности ферментов при образовании комплекса антиген — антитело, с помощью ультразвука, конформационных и диффузионных ограничений). Главное достоинство монографии состоит в том, что в ней, по-видимому, впервые комплексно рассмотрены возможности регуляции активности ферментов, которые могут быть использованы для создания методов иммуноферментного анализа. В этом смысле оправдано английское название книги Enzyme-mediated immunoassay , которое буквально переводится, как Иммунный анализ, опосредованный через ферменты . [c.5]

Рис. 8-7. Турбидиметрический иммунный анализ С-реактивного белка в сыворотке человека, основанный на активации фермента. Антитела против С-реактнв-ного белка, меченные с помощью 2 мкг -галактозидазы, инкубировали с С-ре-

Принцип иммунного анализа прост и основан на взаимодействии исследуемого вещества (лиганда), называемого антигеном (Ag), со специфически связывающимся с ним партнером, называемым антителом (ЛЬ). При этом образуется комплекс антиген/антитело (AbAg) [c.57]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

Извесгно, что в ответ на попадание в живой организм чужеродных веществ (ими могуг бьггь и суперэкотоксиканты) в нем вьфабатьшаются антитела, как отклик иммунной системы организма. Последние в высшей степени специфично взаимодействуют с этими веществами с образованием соответствующих комплексов, что в итоге приводит к их нейтрализации и выводу из организма Именно на использовании данных взаимодействий и возможности получения необходимых антител и базируются иммунохимические методы анализа. Стремление создать специфичные и эффективные методы определения в воде, воздухе и почве остаточных количеств токсичных веществ и снизить их стоимость во многом явилось стимулом к разработке указанных методов Многие иммунохимические методы имеют высокую чувствительность и специфичность, а в ряде случаев позволяют определять высокотоксичные соединения даже без вьщеления из матрицы или после минимальной очистки. [c.297]

Л. а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов, вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген-антитело. При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность метода 10" моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой биолюминесценцией, определяют ферментативную активность (чувствительность метода 10" моль/л). [c.614]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология