Методы определения молекулярного веса белков

Структура рибонуклеазы. После того как Сэнгер разработал методы определения последовательности расположения аминокислот в белковой молекуле, другие исследователи также приступили к изучению более крупных молекул белка. Мур и Штейн и их сотрудники в 1960 году определили строение фермента рибонуклеазы. Этот белок с молекулярным весом 13 700 содержит 124 аминокислотных остатка в одной цепочке. Свернутая кольцом цепочка соединена в четырех местах дисульфидными группами цистина так, как эт показано на рис. 218. Последовательность аминокислот была определена и для некоторых полипептидов, обладающих свойствами гормонов был изучен также белок вируса табачной мозаики, содержащий 158 аминокислотных остатков. [c.319]

Из физико-химических констант белков важнейшая — это молекулярный вес. Сейчас имеется много методов измерения молекулярного веса белков. В частности, химический анализ зачастую дает возможность очень точного определения молекулярного веса. Так, например, в ципк-ннсулине один атом цинка связан с одной молекулой белка, п потому достаточно точно определить весовое содержание цинка в кристаллическом инсулине, чтобы рассчитать молекулярны11 вес. Таким же образом в мио-глобине имеется геминовая группа, т. е. один атом железа на белковую макромолекулу. Иногда белок содержит очень мало какой-либо одной аминокислоты и можно воспользоваться анализом на содержание этой аминокислоты, чтобы рассчитать молекулярный вес. Часто этот метод применяется в сочетании с другими. [c.111]

ГПХ можно использовать для определения молекулярной массы и размеров белковых молекул. По методу Эндрюса [4—6] вначале на основании предварительного анализа нескольких белков с известной молекулярной массой строят калибровочную кривую, выражающую графическую зависимость удерживаемого объема Уе от молекулярной массы М. После этого молекулярную массу и стоксов радиус исследуемого белка определяют путем интерполяции. В отличие от других методов определения молекулярного веса здесь можно работать с мало-очищенными препаратами. Если исследуемый белок обладает какими-либо характерными свойствами, например ферментативной активностью или поглощением при определенной длине волны, его содержание в анализируемом препарате может быть минимальным. [c.425]

Осторожное выделение белков из живых организмов позволило узнать очень многое о их свойствах. Каждый белок имеет вполне определенный молекулярный вес (от 10000 до нескольких миллионов), а отдельные группы белков можно выделить и исследовать благодаря тому, что каждый из них обладает различной скоростью диффузии. Например, определение молекулярного веса белка осуществляется методом измерения осмотического давления. Многие белки удается получить в кристаллической форме, а это позволяет исследовать их строение методом дифракции рентгеновских лучей. [c.482]

Все белки денатурируются под действием кислот или при нагревании, что проявляется в коагуляции и уменьЩенин растворимости, а также в потере специфических биологических свойств. Определение молекулярного веса белков является трудной задачей. Исходя из содержания железа в гемоглобине крупного рогатого скота, было найдено, что молекулярный вес этого белка лежит в пределах 16 000— 17 000. Молекулярный вес казеина, определенный по содержанию легко отщепляющейся серы, равен 16 000 и т. д. Подобные выводы, однако, справедливы лншь прн том условии, что данный белок однороден и содержит в своей молекуле только один атом того элемента, который используется для расчета молекулярного веса. Криоскопическое определение молекулярного веса затрудняется тем, что даже растворимые белки образуют коллоидные растворы наблюдаемое малое понижение точки плавления соответствует большому весу мицеллы. Более подходящими являются методы, основанные на определении скорости диффузии и вязкости. Помимо них практическое значение приобрел предложенный Сведбергом способ определения велич1п-1ы частиц по скорости седиментации в ультрацентрифуге. [c.396]

Зная, нанример, что гемоглобин (белок, переносящий кислород) содержит 0,335 г железа на 100 г белка, мы можем определить его минимальный молекулярный вес он будет равен (55,85/0,335) х 100 == 16 700. С помощью физических методов (см. ниже) было показано, что истинный молекулярный вес гемоглобина близок к 66 ООО. Следовательно, каждая молекула гемоглобина должна содержать четыре атома железа. В аналогичных расчетах с использованием данных по аминокислотному составу выбирают, естественно, ту аминокислоту, содержание которой в белке минимально. Этот метод используется главным образом для проверки результатов определений молекулярного веса с помощью физических методов. [c.61]

Осмометрические определения молекулярных весов соединений, имеющих молекулярный вес ниже 150 000, более точны, чем определения при помощи других методов, так как их результаты менее зависят от формы и гидратации белковых молекул. Осмометрические определения, однако, не дают возможности судить, является ли белок в испытуемом растворе гомогенным или же он представляет собой смесь белков различных молекулярных весов. Если раствор содержит более одного вида белка, то молекулярный вес, рассчитанный из осмотического давления, является средней величиной, равной сумме молекулярных весов всех белковых молекул, разделенной на общее число молекул белка. [c.51]

Таким образом, теория строения белков как полипептидов, обоснованная Э. Фишером, стала прочным фундаментом исследования белков. Неясным оставалось, как при столь однообразном строении различных белков объяснить их весьма разнообразные физические и биохимические свойства. В 20-х годах XX века на примерах каучука, целлюлозы, крахмала были развиты представления о высокомолекулярных соединениях. В то же время были разработаны методы определения молекулярного веса высокомолекулярных соединений и, в частности, белков. Ранее о минимальном молекулярном весе протеидов судили по содержанию в них простетических групп (или каких-либо специфических атомов этих групп, например атома железа в гемоглобине), исходя из предположения, что одна простетическая группа содержится в одной молекуле протеида. Молекулярные веса и таким путем получились огромные, например для гемоглобина 68 000. Применение осмометри-ческого метода определения молекулярного веса (Серенсен, 1917 г.) и особенно разработка ультрацентри(1)угальпого метода (Сведберг, 1926 г.) позволили систематически исследовать молекулярные веса растворимых белков. Оказалось, что их молекулярные веса располагаются в широком интервале величин от 10 000 и ниже для ряда ферментов и гормонов (6500 для инсулина) до 6 600 000 (гемоцианин улитки) и даже до 320 000 000 (белок вируса гриппа). Если принять средний молекулярный вес аминокислотного остатка, входящего в полипептидную цепь белка, равным 115, то окажется, что число аминокислотных остатков в молекулах белков колеблется от нескольких десятков до немногих миллионов. Таким образом, уже по молекулярным весам белки представляют величайшее разнообразие. Простейшие из них вряд ли могут быть отнесены к высокомолекулярным соединениям, между тем как некоторые представляются одними из высокомолекулярных соединений с наиболее громоздкими молекулами. Существеннейшим отличием белков как высокомолекулярных соединений от таких синтетических полимеров, как капрон, полистирол, и таких природных высокомолекулярных соединений, как каучук, целлюлоза, крахмал, является разнообразие элементарных звеньев ( мономеров ), из которых построены белки. Взамен одного мономера (например, остатка ю-аминокапроно-вой кислоты или глюкозы, стирола, изопрена) в белки входит более 20 разных аминокислотных остатков. Это было и вдохновляющим и обескураживающим обстоятельством. Если молекула состоит всего из 20 разных аминокислотных остатков, для нее возможно [c.655]

Найденные таким путем молекулярные веса яичного и сывороточного альбумина и гемоглобина оказались равными соответственно 45, 69 и 72 тысячам, что хорошо совпадает с данными, получаемыми другими методами. К сожалению, осмометриче-ские методы не дают возможности судить, является ли белок растворе гомогенным, или же он представляет смесь белков различных молекулярных весов. В последнем случае мы получаем, как уже упоминалось, так называемое среднечисленное значение молекулярного веса. Кроме того, определение молекулярного веса по осмотическому давлению малопригодно для белков с относительно высоким молекулярным весом (порядка сотен тысяч и миллионов). [c.132]

Гемоглобин. — Этот белок ответственен за перенос кислорода из легких к тканям тела. Механизм дыхания животных может быть продемонстрирован на растворе гемоглобина следующим образом если раствор гемоглобина встряхивать с кислородом, он становится ярко-красным (артериальная кровь) если удалить кислород при помощи вакуум-насоса, раствор гемоглобина становится синевато-красным (венозная кровь). Легко может быть осуществлена кристаллизация окисленного гемоглобина— окоигемоглобина. Для этого раствор гемоглобина обрабатывают небольщим количеством спирта для понижения растворимости и оставляют яа 2—3 недели при 0°С. Последующие кристаллизации требуют все уменьшающихся количеств этилового спирта и меньше времени. Процентный состав оксигемоглобина слегка меняется для препаратов, полученных из различных животных. Типичная эмпирическая формула гемоглобина ( TasHues OjosNzoaSaFe) мини мальный молекулярный вес 16 500—17 000 (определен на основании содержания железа). Так как седиментационный метод дал величину в четыре раза большую, то п, вероятно, равно четырем. [c.671]

Разработаны химические методы определения величины полинептидных цепей белковой молекулы. Эти методы основаны на использовании особого реагента (динитрофторбензола), который соединяется со свободной а-амино-грунной аминокислотного остатка, стоящего на конце нолипептидной цепи, с образованием окрашенного комплекса этот комплекс можно выделить и идентифицировать после того, как белок подвергнется гидролизу на составляющие его аминокислоты (в том числе и на конечную аминокислоту с присоединенной к ней окрашенной группой). Так, лизоцим, белок, содержащийся в слезах и яичном белке и обладающий свойством уничтожать бактерии, имеет, как было установлено ири помощи ультрацентрифуги, молекулярный вес около 14 ООО и состоит примерно из 125 аминокислотных остатков. Применение описанного метода позволило показать, что имеется лишь одна свободная а-аминогруппа, и на этом основании был сделан вывод, что данная молекула состоит из одной нолипептидной цепи. Если эта полипептид-ная цепь была бы растянута, то ее длина составляла бы около 450 А. Однако, как установлено при помощи ультрацентрифуги, дифракцией рентгеновских лучей и другими методами исследования, молекула лизоцима по форме близка к шару с диаметром около 25 А. Отсюда следует, что нолипептидная цепь не может быть вытянутой, а должна быть скрученной, ибо только тогда молекула приобретет сферическую форму. [c.487]

Фермент, выделяемый обычными методами, катализирует не только реакцию (1), но также реакции (2) и (5) однако свободный индол в качестве промежуточного продукта в реакции (1) не образуется. Сейчас известно, что чистый фермент (мол. вес 105 ООО) представляет собой комплекс, который можно разделить хроматографическими методами на две белковые 5 фракции А и В. Белок А состоит из одной полипептидной цепи с молекулярным весом 29 500. Цепь построена из 272 аминокислот (и не содержит триптофана). Остальную часть комплекса составляет белок В. Ни белок А, ни белок В в отдельности реакцию (I) не катализируют реконструированный фермент (молекула которого состоит из одной молекулы А и одной молекулы В) вновь приобретает способность осуществлять свою] функцию. Белок А хотя и слабо, но все же катализирует реакцию (2), а белок В — реакцию (5), что позволяет определять эти компоненты триптофансинтетазы в экстрактах другой, более удобный способ основан на определении недефектного белка А внутриклеточно, с помощью теста на комплементацию, или вне клетки — по ферментативной активности. [c.497]

Наиболее удобной системой ионитов, обладающих различной степенью набухания, дл>[ разделения аминокислот, полипептидов и белко]) оказались сульфосмолы типа СБС, в основе структуры которых лежит сульфостирол [34]. Гак, например, на смоле СБС с коэффициентом набухания, равным 4.5, можно отделить низкомолекулярный белок инсулин от сывороточных альбулина и глобулина, а на смоле с коэффициентом набухания, равным 2, от аминокислот отделяются белки любого молекулярного веса. Различная степень пористости ионитов, играющая столь ажную роль в методе молекулярных сит , может быть достигнута не только введением определенного количества мостикообразую- [c.30]

За последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в дальнейшем установлении точного строения различных белков. Хотя гидролиз белков и последующий анализ гидролизата, который широко использовался раньше, давал возможность получать данные об относительном содержании и природе входящих в состав белка аминокислот, он не позволял сделать какие-либо выводы о распределении аминокислот в полипептидной цепи молекулы белка. Методы анализа и разделения аминокислот до сороковых годов были очень длительными и трудоемкими н требовали сравнительно больших количеств исходного продукта. Разработанные в 40-х годах новые методы анализа и разделения аминокислот и определения концевых групп в молекулах белков и не слишком высокомолекулярных полипептидов создали возможность наметить основные направления решения исключительно важной проблемы выяснения специфической последовательности аминокислот в молекулах некоторых сравнительно простых белков. Первым большим достижением в этой области химии была расшифровка Сангера с сотр. [4] последовательности аминокислот в молекуле инсулина. С момента опубликования этой важнейшей работы, достигшей цели, которая в течение длительного времени казалась неосуществимой, была полностью выяснена последовательность аминокислот у нескольких белков. Установление того факта, что молекулы специфического белка являются однородными по молекулярному весу и содержат строго определенную последовательность аминокислотных звеньев, неизменную для всех макромолекул, явилось одним из наиболее важных достижений химии белка. В число белков, для которых была выяснена последовательность аминокислот, входят инсулин [4], цитохром С [5—7 , белок вируса табачной мозаики [8—10], рибонуклеаза [11 — 13], а- и Р-цепи гемоглобина человека [14, 15], миоглобин кита [16—18], кортикотропин [19—21], глюкагон [22] кроме того, была установлена последовательность аминокислот в некоторых полипептидах более низкого молекулярного веса и частично выяснена последовательность аминокислот у нескольких высокомолекулярных белков [23]. [c.329]

Наличие в белке более чем одной полипептидной цепи устанавливают, определяя его молекулярный вес в условиях, вызывающих денатурацию (например, в 1%-ном растворе додецилсульфата натрия). Для этого определяют молекулярный вес препарата до и после восстановления имеющихся в белке дисульфидных связей (меркаптоэтано-лом или дитиотреитолом). При этом рекомендуется закреплять образующиеся после восстановления 8Н-группы алкилированием с помощью иодоацетата, иодацетамида или этиленимина (фиг. 10). Для определения приблизительного молекулярного веса белка, а также для обнаружения его субъединиц или фрагментов (если вирусный белок состоит из нескольких цепей) — независимо от того, находятся ли они в свободном виде или организованы в более сложную структуру, образованную вторичными или дисульфидными связями (остатками цистина),— можно использовать метод электрофореза в полиакрил- [c.69]

Минибиологи говорят если вы хотите знать, что происходит в клетке, вам следует заглянуть в нее. Так как средняя клетка имеет объем около 1000 мкм (10 м ), а сухой вес около 10 ° г, то методы исследования, как оптические, так и химические, должны быть очень чувствительными . При этом минибиологи используют электронный микроскоп для изучения молекулярного строения, применяют красители, реагирующие со специфическими компонентами клетки и окрашивающие их (белок, ДНК и др.), причем интенсивность окрашивания может количественно характеризовать эти компоненты используют меченые соединения для изучения их синтеза, применяют микрохимические методы для определения концентрации различных ферментов в клетке. [c.71]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология