Белки клонирование

После конструирования вектора рекомбинантные плазмиды смешивают с клетками для трансформации. Например, клетки кишечной палочки со встроенным вектором выращивают на питательной среде, и в процессе этого роста образуются рекомбинантные ДНК, содержащие гены из разных организмов. Поскольку при этом образуются сходные молекулы (клоны), такой процесс называется клонированием. Далее клонированную ДНК вводят в клетки, где и происходит экспрессия генов, т.е. процессы транскрипции и трансляции с образованием необходимого белка. [c.61]

Методами генной инженерии удается объединить в одном геноме антигены многих вирусов, например, гриппа и бешенства, герпеса и гепатита В. Клетки, зараженные одним вирусом, приобретают временный иммунитет к заражению другим вирусом - такое явление называется интерференцией. Это сложный процесс, определяемый многими факторами, в том числе и синтезом в клетке специального белка - интерферона. До сих пор интерфероны выделяли из крови животных или из донорской крови, что являлось сложным и дорогим методом. Генноинженерный способ получения интерферона (выделение его гена и клонирование в плазмидных векторах) позволил практически решить проблему достаточного обеспечения интерфероном больных гриппом даже во время эпидемий. [c.62]

Синтез белка, кодируемого клонированным геном [c.51]

Для скрининга библиотек на основе фага X можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридиза-ция, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами. [c.74]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Необходимость в химическом синтезе нуклеотидной последовательности, кодирующей какой-то конкретный белок, может возникнуть тогда, когда клонирование соответствующего гена затруднено. При этом нуклеотидную последовательность гена находят из данных об аминокислотной последовательности белка. К химическому синтезу прибегают и тогда, когда кодоны, из которых состоит данный ген, плохо считываются организмом-хозяином, и уровень трансляции оказывается очень низким. В таком случае можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), при котором аминокислотная последовательность кодируемого белка остается прежней, а кодоны считываются хозяйским организмом более эффективно. [c.86]

Очень часто чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживаются в гетерологичных хозяйских клетках лишь в минимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодирующих их генов во многих случаях объясняется деградацией чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какому-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название химерный белок , продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов. [c.112]

Рис. 6.6. Протеолитическое расщепление химерного белка фактором свертывания крови Х . Фактор Х узнает аминокислотную последовательность, разделяющую два компонента химерного белка. После расщепления высвобождается функциональный белок, кодируемый клонированным геном.

При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем мал око-пийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды. Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились, и в конечном счете оказываются в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два подхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам, в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов. [c.123]

Стабильность белков, кодируемых клонированными генами, зависит от их клеточной локализации. Например, рекомбинантный проинсулин оказывается примерно в 10 раз более стабильным, если он секретируется (экспортируется) в периплазму (пространство между плазматической и наружной мембранами), а не остается в цитоплазме. Кроме того, белки, секретируемые в периплазму или в среду, легче очистить. [c.126]

Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного количества чужеродного белка и нехваткой питательных веществ или строительных блоков — аминокислот, может произойти запуск стрессовых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеиназ, под действием которых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка. Истощение пула аминокислот может стать результатом эффективной экспрессии не только клонированных генов-мишеней, но и генов самого вектора, кодирующих маркеры устойчивости к антибиотикам. [c.128]

Повышенную копийность клонируемых генов обеспечивают также векторы на основе ДНК фагов. Наиболее подробно в этом отношении изучен фаг Я. При литическом развитии он образует 100-200 фаговых частиц на клетку. Однако из-за лизиса клеток клонированный ген может экспрессироваться лишь в течение ограниченного времени. Чтобы снять данное ограничение, в геном фага Я вводят мутации по гену S, который контролирует лизис клеточной стенки. Мзггантный фаг Я - не способен лизировать клеточную стенку, и при его развитии в непер-миссивных клетках наблюдается образование до 103 фаговых частиц на клетку. Однако пропорционального увеличения продукции белка клонированного гена в этом случае не будет, так как синтезируемые фаговые геномы упаковываются в капсиды. Избежать упаковки ДНК фага Я в белковый чехол можно введением мутаций по гену Q, который контролирует выражение поздних генов фага, ответственных за синтез его структурных белков, а также функции лизиса клеток и упаковки фаговой ДНК (см. 2.2.2). Поэтому MjrraHTH XQ S-, а также в непер- [c.141]

Известно, что в мейозе и в митозе хромосомы упорядоченно расходятся по дочерним клеткам с помощью аппарата веретена, микротрубочки которого обеспечивают растягивание дочерних хромосом или гомологов к разным полюсам. Микротрубочки веретена прикрепляются к специальному участку хромосомы — кинетохору. Это белковый комплекс, который собирается на специализированной последовательности хромосомной Ц.НК — центромере. Молекулярные основы функционирования кинетохора пока не ясны. Методы молекулярного клонирования позволили выделить центромеры хромосом дрожжей. Вставление этих последовательностей в способные реплицироваться молекулы ДНК обеспечивает правильную сегрегацию последних в митозе у дрожжей. В случае дрожжей-сахаромицетов центромеры оказались сравнительно короткими (100—200 п. н.) сегментами ДНК. Центромеры делящихся дрожжей значительно больше (несколько тысяч п. н.) и, видимо, напоминают своим строением центромеры высших эукариот. Механизм упорядоченной сегрегации хромосом эукариот станет понятен, когда выяснится, как связанные с центромерой кинетохорные белки взаимодействуют с аппаратом веретена. [c.72]

Чрезвычайно высокая степень консервативности во взаимодействиях белков транскрипции с гетераюгичными промоторами и энхансерами, а также белков транскрипции разного происхождения друг с другом была показана следующими экспериментами. Добивались экспрессии клонированного гена дрожжей в клетках млекопитающих и следили за функцией продукта этого гена — белка GAL4 (рис. 111, а). Оказалось, что белок QAL4, образующийся в клетках [c.206]

Миллер, Лу и их сотрудники [145а, Ь] с успехом использовали супрессорные мутации и получили с их помощью около 300 мутантных типов Za -репрессорного белка Е. соИ. На первом этапе вводили атЬег-мутации приблизительно в 80 положений гена. Далее с целью клонирования мутантные гены переносили в эписомы (см. следующий раздел). Затем эти вирусоподобные эписомы использовали для заражения пяти штаммов бактерий, несущих супрессорные мутации, благодаря которым считывание кодона UAG (терминирующего) приводило к включению в белок различных аминокислот. Из этих инфицированных бактерий выделяли большие количества мутантных форм 1ас-репрессора. Оказалось, что многие мутации, локализованные вблизи от N-конца, влияют на связывание репрессора с ДНК, тогда как мутации, локализованные в центральной части, влияют на связывание с индуктором. [c.256]

К важнейшим отраслям биоиндустрии (рис. 1.1) следует отнести некоторые отрасли пищевой промышленности (широкомасштабное выращивание дрожжей, водорослей и бактерий для получения белков, аминокислот, витаминов, ферментов) сельское хозяйство (клонирование и селекция сортов растений, производство биоинсектицидов, выведение трансгенных животных и растений) фармацевтическую промышленность (разработка вакцин, синтез гормонов, антибиотиков, интерферонов, новых лекарственных препаратов) экологию — защиту окружающей среды и устранение загрязнений (очистка сточных вод, переработка хозяйственных отходов, изготовление компоста и др.). [c.7]

Процедура вьщеления ДНК в клетки дрожжей довольно проста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии СаС и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая ин( а-ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компонент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку-хозяина придают ей этот недостаюший признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки подобно В. subtilis секретируют большое количество белка во внеклеточную среду, что используется также для секреции чужеродных белков, например интерферона человека (с. 43). [c.125]

Другая важная задача — выведение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все более важное значение приобретает селекция животных по резистентности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Пока результаты селекщш на устойчивость животных к различным заболеваниям невелики, но обнаде-живающи. В частности, созданы популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепаразитарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием вторжению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторжению возбудителей, равно как и их размножению, препятствуют в основном иммунная система организма и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентности у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх -мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх был вьщелен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, экспрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о трансляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Ведутся исследования в целях получения трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лакто-ферина в тканях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели резистентность против аденовируса Н5 (Ads) более высокую на 90 — 98% по сравнению с контрольными линиями клеток. Л. К. Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, к заражению вирусом лейкоза. [c.130]

Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, так как позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака. Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов 1) клонирование генов запасных белков 2) изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и вьювление последовательностей [c.149]

Один из возможных способов увеличения фотосинтеза и, следовательно, продуктивности растений состоит в клонировании хлоро-пластных генов в клетках бактерий и их переносе в растения. Известно, что хлоропласты и прокариотические клетки сходны по ряду признаков. На основании этого возникла симбиотическая гипотеза происхождения хлоропластов, впервые выдвинутая А. С. Фамин-циньпл (1886). Согласно этой гипотезе, клетки прокариот и хлоропласты сходны. В них присутствуют кольцевые ДНК, 708-рибо-сомы синтез белков начинается с одной и той же аминокислоты — N-формилметионина, а синтез белка подавляется хлорамфенико-лом, а не циклогексимидом, как у эукариот. Позже было показано, что ДНК-зависимая РНК-полимераза Е. соН связывается с определенными участками ДНК хлоропластов шпината. [c.150]

Используя технику клонирования ДНК [599] и анализа нуклеотидных последовательностей [600], Наканнши и сотр. foOl] установили нуклеотидную последовательность мРНК-предшественника. Нумерация аминокислотной последовательности положительная справа от N-концевой аминокислоты АКТГ, в левую сторону отсчет идет со знаком минус. Белок-предшественник содержит 8 пар основных аминокислот и одну двойную пару -Lys-Lys-Arg-Arg. В этих местах происходит ферментативное расщепление белка с образованием различных пептидов. /3-Липотропин образует С-концевую область и, вероятно, отщепляется непосредственно от предшественника. Общая схема ферментативного расщепления и вид фрагментации к настоящему времени еще не установлены. В отличие от известных последовательностей /3-липотропинов свиньи и овцы /3-липотропин теленка содержит между 35 и 36 аминокислотными остатками два дополнительных (-Ala-Glu-) этим объясняются различные длины цепей липотропинов (см. схему). Анализ на ЭВМ аминокислотной последовательности отрицательной части предшественника дал интересный результат между позициями —55 и —44 найдена аминокислотная последовательность -Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-, имеющая большое сходство с а- н /3-МСГ. Так как в области аминокислотной последовательности предшественника от —111 до —105 присутствует еще один участок, имеющий структурное сходство с МСГ-пептидами, предполагается существование серии дупликаций гена, аналогично имеющей место в случае иммуноглобулинов. О [c.242]

Больше всего известно об аминокислотной последовательности субъединиц с высокой молекулярной массой, изолированных Филдом и др. [79] (молекулярная масса, определенная с помощью ДДС-Ыа-ПААГ, — 144 ООО, ультрацентрифугированием — 69 600 Да). Действительно, установлена последовательность из 16 аминокислот N-концевой половины цепи она была определена при секвенировании изолированного белка [79]. Кроме того, благодаря клонированию ДНК, кодирующей эту субъединицу, и определению ее нуклеотидной последовательности стало возможным установить последовательность из 101 аминокислоты у СООН-концевой половины цепи [81] (см. табл. 6Б.15). Анализ последовательности N-концевой половины цепи подтверждает предыдущие результаты она не соответствует ни одной из тех последовательностей, которые были предварительно идентифицированы для а-, Р-, 7- и й)-глиадинов или агрегированных глиадинов. Эта аминокислотная последовательность N-концевой половины цепи по составу очень отличается от аминокислотного состава полного белка меньше неполярных аминокислот, глицина, а также глутаминовой кислоты и глутамина. Отмечается также отсутствие серина, тогда как все основные аминокислоты присутствуют. Поэтому такая последовательность не является представительной для первичной структуры всей полипептидной цепи, которая должна содержать зоны, более богатые глицином и бедные глутамином. Наконец, примечательно наличие 2 цистеинов из 5 или 6, которые входят в состав целой молекулы, так как оно с большой вероятностью предопределяет конформацию молекулы, как и возможности образования внутрицепочных дисульфидных мостиков. Опыты с разрывом полипептидной цепи на уровне цистеинов подтвердили, что большинство из них должно располагаться у концов цепи [79]. В самом деле, обнаруживается третий цистеин в положении 13 у С-конца [81]. Эта С-кон- [c.210]

В последующих главах мы детально опишем различные высокоспециализированные биологические системы. В частности, в гл. 7 будет рассмотрена система вирус насекомых-клетки насекомьгх , которая используется для продукции аутентичных белков, кодируемьЕХ клонированными генами, а в гл. 19 -генетическая модификация домашних животных (коров, овец, свиней). В настоящей главе мы дадим краткое описание наиболее значимых для молекулярной биотехнологии систем, которые также будут рассматриваться в последующих главах. [c.24]

Часто некоторые клетки перевиваемых первичных клеточных культур претерпевают генетические изменения, в результате которых ускоряется их рост. Культуры клеток, которые при этом приобретают селективные преимущества, оказываются способными к неофаниченному росту in vitro и называются устойчивыми клеточными линиями. Одни клеточные линии сохраняют основные биохимические свойства исходных клеток, другие нет. У больщинства клеток, способных к неофаниченному росту, имеются значительные хромосомные изменения, в частности отмечается увеличение числа одних хромосом и потеря других. В молекулярной биотехнологии устойчивые клеточные линии иногда используют для размножения вирусов и для выявления белков, которые кодируются клонированными последовательностями ДНК. Кроме того, они применяются для крупномасиггабного производства вакцин и рекомбинантных белков. [c.28]

Цель биотехнологических экспериментов часто состоит в идентификации генов, кодирующих определенные белки (структурньЕх генов). У прокариот кодирующие домены структурных генов непрерывны, а у эукариот кодирующие области (экзоны) разделены некодирующими (интронами). Соответственно при клонировании генов про-и эукариот должны применяться разные стратегии. [c.62]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Эффективность инактивации белка-репрессора и соответственно активации транскрипции зависит от соотношения между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Если концентрация репрессора слишком велика, то транскрипция не инициируется, и наоборот, если молекул репрессора очень мало (даже при том, что их больше, чем копий промотора), то транскрипция может идти и в отсутствие индукции. Про такие промоторы говорят, что они текут . Чтобы осуществлять строгий контроль таких регулируемых систем, разработаны разные стратегии. Например, ген репрессора и соответствующий промотор помешают в две разные плазмиды, присутствующие в клетке в разном числе копий это позволяет поддерживать нужное соотношение между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Обычно ген репрессора находится в малокопийной плазмиде, число ее копий в клетке не превышает 8, а промотор - в мультикопийной плазмиде с 30-100 копиями на клетку. Ген репрессора может быть локализован и в хромосомной ДНК, находясь в ней в единственном числе, что позволяет поддерживать низкую концентрацию репрессора. В системах, использующих /ас-промотор, можно получить /ос-репрессор в значительно большем количестве, если заменить /ас/-ген его мутантной формой /дс/ч, что приводит к уменьшению протекания промотора, т. е. к снижению уровня транскрипции клонированного гена без индуктора. [c.108]

Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соответствующих генов. В самом простом виде векторная система слияния предусматривает включение гена-мишени или его сегмента в кодирующий участок клонированного гена-хо-зяина. Очень важно, чтобы РНК, транскрибируемая с клонированного гена-мишени, имела правильную нуклеотидную последовательность, [c.112]

Расщепление химерных белков В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, причем последний вариант встречается нечасто. Например, из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике, а сам продукт клонированного гена-мишени может оказаться неактивным. Кроме того, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта. Один из таких способов основан на присоединении белка, кодируемого геном-мишенью, к белку клетки-хозяина, содержащему короткий пептид, распознаваемый специфической протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, олигонуктеотид, кодирующий пептид Пе-01и-01у-Аг . После синтеза и очистки химерного белка для отделения белкового продукта, кодируемого клонированным геном, можно использовать фактор свертывания крови Х , который является специфической протеиназой, разрывающей пептидные связи исключительно на С-конце последовательности Ile-Glu-Gly-Arg (рис. 6.6). Более того, поскольку такой пептид [c.112]

Клонируемый ген встраивают в N ol-, Pst -или // иёШ-сайт, расположенный между сайтом связывания рибосомы и сайтами терминации транскрипции. Если его рамка считывания не попадает в ногу с кодоном AUG, то необходимо произвести минимальную коррекцию. В этом случае после индукции и транскрипции происходит достаточно эффективная трансляция клонированного гена. Однако следует иметь в виду, что поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевой участок белка-мищени, у разных клонированных генов неодинакова, нельзя создать универсальный вектор, исключающий одноцепочечное спаривание мРНК при любых обстоятельствах. Поэтому ни одна из областей инициации трансляции, как бы она ни была оптимизирована, не может га- [c.121]

Эффективность синтеза белка зависит от наличия в его мРНК специфических нуклеотидных последовательностей. Чтобы предотвратить разрушение белкового продукта или обеспечить его секрецию, клонированные гены, которые кодируют этот белок, подвергают направленным изменениям. Это может быть присоединение сайта связывания рибосомы перед сайтом инициации транскрипции (который в свою очередь тоже бывает нужно присоединить) или до- [c.130]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология