Белки обнаружение по поглощению

В обычных УФ-денситометрах в качестве источника света используется ртутная лампа низкого давления с интенсивной линией при 253,7 нм. Энергия УФ-излучения такой лампы составляет около Э/мин, т. е. примерно 0,09 мкВ. Для обнаружения белков по поглощению при 280 нм УФ-денситометры снабжены флуоресцентным преобразователем света (свинцовое стекло или кристалл). Если специфичность детектирования и достижение высокой чувствительности не существенны, белки можно определять и при 253,7 нм. [c.460]

Свободный йод легко вступает в соединение с белками и щелочами. Для обнаружения солей йода в биологическом материале его подщелачивают едким натром и сжигают. Золу после сжигания извлекают горячей водой, раствор фильтруют, сгущают до небольшого объема, прибавляют раствор нитрита натрия, подкисляют разведенной серной кислотой и нагреванием отгоняют йод в раствор крахмального клейстера или в хлороформ. Крахмальный клейстер помещают в две склянки Дрекселя вторая склянка служит для контроля поглощения. Поглощенный крахмальным клейстером йод титруют 0,1 н. или 0,01 н. раствором тиосульфата натрия, а при малых количествах определяют колориметрически, сравнивая с соответствующими растворами йода. [c.373]

Для количественного определения аминокислот и пептидов по приведенным выше реакциям требуется колориметр или фотометр, с помощью которых обнаруживают изменения в свето-поглощении, связанные с протеканием реакций. Поскольку нингидрин наиболее широко используется для обнаружения аминокислот и белков, он послужит основой для дальнейшего обсуждения колориметра. [c.26]

Необратимое осаждение белков фосфорновольфрамовой кислотой используется в гистохимии для обнаружения белков в тканевых срезах. Присутствие белка обнаруживают измерением поглощения рентгеновских лучей тяжелым атомом вольфрама в высушенных тканевых срезах [32]. [c.19]

Первая задача представляется более простой и является логическим началом приложения метода меченых атомов к изучению фотосинтеза. Две группы исследователей из Калифорнийского университета пытались разрешить ее. С. Рубен и его сотрудники пользовались быстро распадающимся С , а М. Кальвин с сотрудниками применили медленно распадающийся С . Результаты оказались многообещающими. Было обнаружено, что радиоактивная СОг поглощается растениями в темноте. Вначале казалось, что это поглощение сводится к простому присоединению углекислоты к большой органической молекуле с образованием органической кислоты. Однако в последних экспериментах радиоактивный углерод был обнаружен во многих различных веществах, частично или полностью восстановленных, таких, как белки или сахара. Так как поглощенное количество его было намного больше, если растения освещались до помещения в радиоактивную углекислоту в темноте, то Кальвин предположил, что вся группа реакций восстановления происходит в темноте, другими словами, что на свету хлорофилл образует какие-то неизвестные мощные восстановительные агенты, которые затем восстанавливают углекислоту на всем ее пути до углеводов без помощи света. [c.50]

Недавно был разработай и применен для исследования электрофореза [126, 127] и диффузии [128, 129] ряд методов обнаружения и измерения градиентов показателя преломления, основанных на явлении интерференции. Эти методы теоретически и практически более точны и чувствительны, чем методы с использованием темных полос, однако до сих пор они не нашли широкого применения, так как требуют дополнительного оборудования и накопления опыта. Поскольку большинство белков поглощает свет только при длине волны около 280 ту, то обнаружение градиента показателя преломления с помощью поглощения света [114] требует специального оборудования и применяется лишь в особых случаях. [c.25]

Свободный йод легко поглощается белками и щелочами, переходя в соединения с ними. Для обнаружения солей йода во внутренних органах трупов последние подщелачивают едким натром и сжигают. Нормально йод содержится в щитовидной железе и в нез начительных количествах в других органах, но эти количества нельзя смешать с большими количествами солей йода при отравлениях. Золу после сжигания извлекают горячей водой, раствор фильтруют, сгущают до небольшого объема, прибавляют раствора нитрита натрия, подкисляют разведенной серной кислотой и нагреванием отгоняют йод в раствор крахмального клейстера или в хлороформ. Крахмальный клейстер помещают в две склянки Дрекселя, причем вторая склянка служит для контроля поглощения. Поглощенный крахмальным клейстером йод титруют 0,1 или 0,01 н. раствором тиосульфата натрия, а при малых количествах определяют колориметрически, сравнивая с соответствующими растворами йода. [c.379]

Окрашивание белков обычно приводит к их денатурации и не позволяет получать точные количественные данные. В связи с этим были предприняты попытки выявлять белки и нуклеиновые кислоты по поглощению ими ультрафиолетового света. К тому же методы обнаружения нуклеиновых кислот в ультрафиолетовом свете, а белков по флуоресценции, как правило, более чувствительны, чем методы, основанные на связывании макромолекул с красителями. [c.181]

Эту операцию производят через нижнее, снабженное краном отверстие в следующей последовательности. Отключают напряжение и, подняв клапан, запирают электролит в центральной трубке. Во избежание подтекания его лучше из трубки отсосать. Из рабочего объема колонки сверху отсасывают верхний электродный буфер и до предела заполняют верхнюю часть колонки водой. Затем к отростку, ведущему в рабочую камеру, плотно присоединяют выходную трубку перистальтического насоса н открывают сливной кран. Жидкость из колонки будет вытекать только по мере подачи воды от перистальтического насоса в верхнюю часть камеры. Скорость этой подачи можно регулировать. Фирма рекомендует опоражнивать колонку со скоростью 60—80 мл/ч. Элюат из колонки через денситометр направляют в коллектор фракций. Во фракциях измеряют pH (при температуре фокусирования ). Если ультрафиолетовое поглощение оказывается недостаточным, наличие белков во фракциях определяют в аликвотах с помощью окрашивания или других описанных выше методов обнаружения белков. Отобранные фракции объединяют и отделяют в них белки от амфолинов. [c.70]

Использование поляризованного ИК-света для определения ориентации водородных связей в вытянутых пленках белков и полипептидов путем установления ориентации С=0- и ЫН-групп. Возможность таких измерений обусловлена тем, что эти группы поглощают сильнее всего тогда, когда они параллельны вектору Е. Это можно использовать для обнаружения а-спирали, учитывая, что теоретическое отношение величины поглощения для случаев, когда вектор Е параллелен и перпендикулярен оси белка ( дихроичное отношение ), составляет 44 при 3300 см (валентное колебание NH—). Если измеряемое отношение близко к этой величине, велика вероятность а-спиральной структуры. Само теоретическое значение достигается редко, так как ориентация полипептидных цепей в пленке не может быть совершенной. Из измеряемых дихроичных отношений при 3300 и 1660 см (валентное колебание С = 0) можно, кроме того, рассчитать величину максимального угла, который эти группы образуют с осью молекулы. Информация такого типа представляет собой большую ценность при интерпретации рентгенограмм. [c.411]

Пределы обнаружения для этих флуоресцентных реагентов определяются мешающим влиянием фона и квантовой эффективностью. В первом случае собственная флуоресценция пробы, особенно если она содержит, например, сьшороточньш белки, NADH или билирубин, может быть очень высока. Свободный NADH, напрнмер, проявляет максимум поглощения прн 340 нм и [c.588]

ТОД широко применяют для обнаружения в элюатах белков и крупных пептидов, но он недостаточно универсален. Более общим методом анализа, не зависящим от аминокислотного состава пептидов, является измерение поглощения в области 180— 220 нм, где пептиды и белки характеризуются высокими коэффициентами поглощения [1] (например, поглощение при 210 нм в 10—20 раз выше, чем при 280 нм). Однако здесь имеются определенные технические трудности. Кроме того, в этой области интенсивным поглощением обладают почти все известные буферные растворы исключение составляют нелетучие буферы на основе неорганических солей. Можно также вести анализ по флуоресценции ароматических группировок. Этот метод обладает более высокой чувствительностью по сравнению со спек-трофотометрией при 280 нм, но область его применения также ограниченна. [c.391]

Спектрофотометрическое обнаружение белков и пептидов в растворах заключается в измерении поглощения при длине волны, соответствующей максимальному поглощению. Большинство белков содержит остатки тирозина, фенилаланина и в меньшей степени остатки триптофана, характеризующиеся максимумом поглощения в коротковолновой части спектра. В этой же части спектра располагаются полосы поглощения, характерные для пептидной связи, а-спирали пептидной цепи, дисульфидных связей, остатков цистина и др. На практике наибольший интерес представляет широкая полоса поглощения в области 275— 280 нм, характерная для остатков тирозина и триптофана. Поглощение белков в области выше 280 нм сильно зависит от pH среды, что связано с ионизацией гидроксильных групп остатков тирозина в сильнощелбчной среде, вызывающей изменение коэффициента экстинкции и сдвиг максимума поглощения в более длинноволновую часть спектра. Изменение коэффициента экстинкции тирозина в зависимости от pH среды приведено в табл. 35.7. [c.456]

Измерения магнитной восприимчивости и спектров ЭПР — ценные методы обнаружения взаимодействий между ионами Ре(П1), однако они не дают сведений о геометрии комплексов, образуемых ионами Ре(П1) в состоянии А . Ранее уже было описано расщепление энергетических уровней пяти d-орбиталей под влиянием поля лигандов в комплексах октаэдрической, тетраэдрической и тетрагональной симметрии (рис. 54). Спектры поглощения необычных пентакоординационных соединений с основным состоянием S = = /з определяются интенсивным поглощением, которое, по всей вероятности, обусловлено переносом заряда, но переходы, определяемые полем лигандов, идентифицировать однозначно не удается [29]. Можно ожидать, что эти переходы будут по своей энергии и интенсивности сильно отличаться от переходов в октаэдрических и тетраэдрических комплексах. Хотя температурную зависимость магнитной восприимчивости в димерных системах Ре—О—Ре можно объяснить антиферромагнитным взаимодействием или между двумя спинами 5 = Vj, или между двумя спинами S = V-2 ионов в основном состоянии, основное состояние S = для комплексов октаэдрической и тетраэдрической симметрии исключается. С точки зрения изучения многоядерных железосодержащих белков интерес представляют только слабые лиганды, которые не могут привести к образованию иона в основном состоянии со спином S = /2. Поэтому в дальнейшем можно ограничиться обсуждением систем с основным состоянием 5 = Vg — единственным состоянием, которое позволило объяснить полосы поглощения, обусловленные полем лигандов, в наименьших многоядерных системах, образуемых железом, — в димерах Ре—О—Ре [40]. Сходство этих полос у мономерных и димерных шестикоординационных комплексов Ре(1И) согласуется с относительными величинами энергии антиферромагнитного спин-спинового взаимодействия (J 100 см" ) и переходов, обусловленных полем лигандов (J > 10 000 см ) Исходя из теории поля лигандов и простых электростатических соображений, можно ожидать, что поле, создаваемое четырь- [c.343]

Поэтому, чтобы избежать инфицирования гелей, в суспензии гелей, заполненные колонки и элюенты добавляют бакте-риостазы, которые не должны реагировать ни с матрицей геля, ни с хроматографируемыми соединениями, не должны денатурировать или осаждать их. Если ход хроматографирования прослеживается по УФ-поглощению, то эти соединения не должны также поглощать в той спектральной области, которую используют для обнаружения. В самом начале развития гель-хроматографии был предложен в качестве бактериостазов ряд соединений, в частности толуол, фенол, крезол, формальдегид и хлороформ (см. также гл. 5, табл, 5.10). Однако фенолы и формалин вступают в реакцию с белками и вызывают необратимые их изменения. Хлороформ, который применяется в виде насыщенных водных растворов, непригоден для работы с мягкими гелями, так как вызывает уменьшение степени набухания и, таким образом, неблагоприятно влияет на хроматографические свойства этих гелей. Он также непригоден в тех случаях, когда колонки оснащены пластмассовыми трубками, так как повреждает их. [c.376]

Колонка 3X80 см элюат — 2 М раствор хлорида натрия в 0,0 М растворе цитрата натрия скорость потока 24 мл/ч проба — 15 мл меченного И-тимидипом лнзоцимного лизата из 2 г влажны, бактериальных клеток объем отбираемых фракций 10 мл обнаружение — по поглощению при 260 нм (I) и числу импульсов в минуту ( ). Выделены 1 — ДНК, Иа — клеточные белки, По — главным образом лизоцим. [c.385]

Другим примером связывания внешних поглощающих групп с биологической макромолекулой могут служить недавние исследования эффекта Коттона в полосе Соре гемоглобина и миоглобина [87, 88]. Эти два вещества являются комплексами белков с гемами, каждый из которых имеет характерную для порфиринов полосу поглощения около 410 ммк. В нативных молекулах в области этой полосы поглощения наблюдается типичный эффект Коттона (рис. 23), который исчезает при денатурации белка. Сходный эффект Коттона был обнаружен у комплексов гемина с синтетическим полипептидом, а именно с П0ЛИ-1--ЛИЗИН0М [89]. Этот эффект Коттона, так же как эффект Коттона у системы синтетический краситель — полипептид, зависит от конформации. [c.287]

Постоянную скорость элюирования задают с помощью перистальтического насоса. Элюат, собираемый на фракционном коллекторе, анализируют в потоке или выборочно по фракциям на содержание белка, для чего обычно регистрируют изменение оптической плотности при 280 нм. Другие методы детектирования используют при отсутствии в белке хромофоров (остатков триптофана и тирозина), при работе иа микроуровне или при слишком высоком поглощении при 280 нм, например благодаря присутствию кофактора. В этих случаях можно определять оптическую плотность при 220 им, интенсивность флуоресценции или радиоактивность (при работе с мечеными белками) [14, 161] наконец, при анализе белковых фракций можно использовать химическую модификацию (разд. 1.4.5.1). Например, определенные объемы (аликвотные части) отдельных фракций можно подвергнуть щелочному гидролизу и последующему анализу по реакции с нингидрином. Для обнаружения белков можно использовать реакцию Лоури или реакцию связывания кра-снтеля. Последний метод вполне можно рекомендовать как наиболее простой и чувствительный, причем этому определению не мешает присутствие химических реагентов. Кроме того, состав фракций можно определять с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.23]

Надежность обнаружения ФТГ-Ser и ФТГ-Thr можно повысить, детектируя их дегидропроизводные на длине волны 314 нм. Для продуктов отщепления на секвенаторе величина поглощения при 314 нм сильно меняется, так как могут образовываться не только дегидропроизводные, но и продукты присоединения к ним дитиотреита. По нашим данным, ФТГ-ТЬг, полученный на газофазном секвенаторе, дает два или четыре пика, два из которых элюируются до и после ФТГ-Туг на колонке s (рис. 13.2). Полученный в тех же условиях ФТГ-Зег выходит с колонки непосредственно перед производным Ala (рис. 13.2). Вещества, элюируемые в этих положениях, не поглощают при 314 нм. При работе на ЖФ-, ТФ-, ГФ-секвснаторах получаются разные результаты. Лучшим решением вопроса в этих случаях является, как указано ранее, анализ стандартного белка. [c.417]

Допускают, что одним из неосмотических компонентов корневого давления являются актомиозиноподобные белки (см, с. 97), обнаруженные в корнях подсолнечника, тыквы, фасоли. Выявлена импульсная ритмичность скорости экссудации и скорости поглощения корнем воды, обусловленная ритмичными чередованиями сокращения и расслабления паренхимных клеток коры и центрального цилиндра. Высказывается также предположение, что энергия может тратиться на активный перенос не самой воды, а ионов, которые пассивно увлекают за собой воду, и об участии иона кальция при функционировании сократительного аппарата корней. [c.120]

Пример 13-Д. Обнаружение образования ДНК при ферментативной полимеризации мононуклеотидов. Если смесь ДНК и радиоактивных нуклеозидтрифосфатов инкубировать с ферментом ДНК Полимеразой I из Е. oli, часть радиоактивного материала переходит в форму, осаждающуюся кислотой (гл. 5, пример 5-1). Это может быть результатом чистого синтеза, приводян его к увеличению количества ДНК высокой молекулярной массы, или обмена нуклеотидов в исходных молекулах. Если имеет место чистый синтез, г отн будет повышаться, поскольку увеличивается концентрация ДНК если происходит только обмен, то количество ДНК не изменится и rio-rii будет постоянна. Во время, когда начиналась работа с полимеразой 1, ДНК можно было отличить от нуклеотидов по световому рассеянию (при использовании образцов с высокой концентрацией ДНК, не содержащих белка), ультрацентрифугированию или ультрафиолетовому поглощению (при низких концентрациях и в отсутствие избытка материала, поглощающего в УФ-области) или методом вискозиметрии. Ферментативная реакция проходит при низкой концентрации ДНК и высокой концентрации белка и УФ-поглощающих нуклеотидов таким образом, первые гри возможности исключаются. При исследовании вязкости было показано, что г увеличивается при увеличении времени инкубации это свидетельствует о том, что повысилось или количество ДНК, или ее молекулярная масса. Обе эти возможности подразумевают синтез ДНК. [c.377]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология