Метод бесклеточных экстрактов

Таблица 4-8. Основные вехи в развитии метода ультрацентрифугирования и приготовления бесклеточных экстрактов

Всякий раз, когда какая-нибудь наука достигает в изучении того или иного явления нового этапа, представители этой науки стремятся тут же установить в ней какую-либо догму, замедляя тем самым дальнейшее развитие этой науки. Так, например, когда было постулировано, что заразные болезни вызываются, как правило, микроорганизмами, всякую неудавшуюся попытку найти и вырастить организм, вызывающий данную болезнь, стали объяснять непригодностью применявшегося метода. В подобных случаях необходимо, чтобы среди специалистов или философов нашлись своего рода раскольники, способные подвергнуть сомнению сложившуюся догму. Именно такую роль и сыграл Бейеринк из города Лейдена. Хотя ему и не удалось убедить Ивановского, жившего в Петербурге, в том, что, продемонстрировав возможность передачи мозаичной болезни табака с помощью бесклеточных экстрактов, оба они обнаружили новое явление, Бейеринк все же выдвинул в 1898 году новую концепцию, появление которой помогло постепенно понять природу того, что в настоящее время мы называем вирусами Этаны развития вирусологии в течение последующих семи десятилетий показаны в табл. 1. [c.12]

Над проблемой спиртового брожения успешно работал А. Н. Лебедев. Им был разработан (1911) более простой метод получения бесклеточного экстракта из дрожжей, содержащего активный комплекс ферментов, объединяемых одним названием — зимаза. Ферменты переходят в раствор после непродолжительного автолиза дрожжей — мацерации, почему этот препарат и получил название мацерационного сока Лебедева. С этим препаратом А. Н. Лебедев провел большую работу по изучению химизма спиртового брожения. [c.245]

Исследование обмена по циклу Кребса у грибов проводится теми же путями, что и при изучении процесса гликолиза. Оценка по анализу ферментативных систем цикла ТКК затрудняется тем, что большинство его ферментов, в противоположность ферментам путей гликолиза, находящимся в цитоплазме, локализуется в органоидах клетки — митохондриях, легко разрушающихся при их изоляции в бесклеточных экстрактах грибов. При работе с этими ферментами потребовалась разработка специальных мягких методов выделения митохондриальных фракций клеток и последующего отделения ферментов от структурных белков митохондрий, с которыми они связаны, без потери их активности. Для этого было применено быстрое механическое разрушение клеток в подходящем растворителе, заключение их в раствор сахарозы, препятствующий набуханию митохондрий, удаление вредных металлов и т. д. Дыхательные гранулы из митохондрий, активно дышащие и крася- [c.70]

Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза белка. Различия заключаются, главным образом, в методах получения бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем перед другими являются возможность длительного хранения и доступность исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует проведения экспериментов с лабораторными животными. [c.190]

Основная масса известных специфических эндонуклеаз была обнаружена в результате целенаправленного применения для их поиска биохимических методов тестирования, основанных на определении способности грубых или частично очищенных бесклеточных экстрактов исследуемых культур специфически фрагментировать ДНК субстраты. Значительно меньшее число этих ферментов было выявлено благодаря изучению энзиматических основ систем хозяйской специфичности (СХС) прокариотических микроорганизмов, реализовавшихся в открытии рестриктаз II типа. В последнем случае таким опытам предшествовали генетические (биологические) эксперименты по определению наличия и изучению генетического контроля систем [c.130]

Большим достоинством обсуждаемого метода является возможность его использования для тестирования активности специфических эндонуклеаз, несмотря на присутствие некоторых количеств неспецифических эндонуклеаз. Эта особенность электрофоретического метода способствует быстрой проверке многих штаммов. Однако, в таких опытах наблюдаются и случаи относительно большого содержания неспецифических нуклеаз в бесклеточных экстрактах некоторых исследуемых культур, что может маскировать активность целевых ферментов и тем самым препятствовать их выявлению [179]. [c.136]

Одним из самых простых классических методов удаления нуклеиновых кислот является их высаждение при помощи СС. Обычно в опытах по выделению рестриктаз с этой целью используется 1—2% конечные концентрации указанного антибиотика. Для применения этого способа практически не существует ограничений в рабочих объемах бесклеточных экстрактов, что может оказаться важным фактором в препаративных опытах. Вышеуказанные особенности обсуждаемого метода удаления нуклеиновых кислот способствовали его широкому использованию в опытах по выделению рестриктаз [20, 23, 28, 52, 73, 98, 107, 115, 122, 126, 142, 145, 146, 167, 186, 234, 264, 265, 296, 303 и др.]. [c.145]

В 1930 г. вышла книга Холдейна о ферментах [I], прочесть которую стоит и сегодня. Более всего в этой книге меня поразило несоответствие между обширностью для того времени знаний о свойствах и действии ферментов и их ограниченностью в отношении химической природы ферментов вопрос о том, являются ли ферменты белками, все еще широко дискутировался. Такая односторонность была обусловлена отсутствием методов, позволяющих проводить прямое исследование ферментов. Вся информация носила косвенный характер — ее источником служили опыты по действию ферментов на соответствующие субстраты. Тем не менее уже спустя немногим более 30 лет после получения Бухнером в 1897 г. бесклеточного экстракта ферментов были заложены основы современной ферментативной стационарной кинетики. [c.11]

Микробиологическое гидроксилирование ароматического кольца широко освещено в литературе, однако в настоящее время этот метод имеет гораздо меньшую синтетическую ценность для химика-органика, чем гидроксилирование алифатических соединений, которому посвящено значительно меньшее число работ. Это обусловлено по крайней мере двумя причинами во-первых, гидроксилированное ароматическое кольцо становится чрезвычайно чувствительным к дальнейшему окислению с помощью других ферментов в клетке или в бесклеточных экстрактах, которое протекает обычно с разрывом кольца и разрушением его до меньших фрагментов (это будет обсуждаться в гл. 5) во-вторых, основная часть опубликованных работ была выполнена микробиологами или биохимиками, которых гораздо больше интересовало исследование метаболических деграда-тивных путей (возможно, для того, чтобы избавиться от нежелательных ароматических соединений), чем создание препаративных биосинтетических систем. Однако известные, пусть малочисленные более или менее полезные синтетические методы позволяют надеяться на то, что в этой области будет еще многое открыто. Выделение первой гидроксилазы в кристаллическом виде [13] позволяет предполагать, что процесс последовательной деградации можно будет в конечном счете расчленить на индивидуальные реакции. [c.117]

Выделение оксистероид-дегидрогеназ осущест-вляется обычными в химии ферментов методами. После разрушения клеток ультразвуком или растиранием с AlgOg полученные бесклеточные экстракты центрифугируются и ферменты, содержащиеся в надосадочной жидкости, выделяются комбинированием различных методов — хроматографии на ионообменниках, гелевой фильтрации, фракционированного осаждения сульфатом аммония и т. д. Удельная активность экстрактов увеличивается при этом в десятки и сотни раз. [c.119]

Актиномицет Streptomy es hydrogenans продуцирует 20р-оксистероид-дегидрогеназу, катализирующую взаимные превращения 20-кето- и 20р-оксистероидов. Этот фермент был получен в кристаллическом состоянии с выходом около 12% от содержания его в исходном бесклеточном экстракте молекулярный вес фермента, определенный седиментационным методом, имеет величину порядка 118 000 [5,140—144]. В последнее время удалось получить также частично очищенные препараты 20р-оксистероид- [c.119]

Хеллинг и сотр. [118] использовали для изучения разложения феноксиуксусных кислот метод меченых атомов. Фенокси- 0-уксус-ная кислота дает фенол- 0 под действием покоящихся клеток или бесклеточных экстрактов Arthroba ter sp., предварительно инкубированных с 2М-4Х [99]. Полное превращение и количественное сохранение в молекуле фенола показывает, что разрыв связи происходит между алифатической боковой цепью и эфирным атомом кислорода [c.36]

Систему для белкового синтеза можно получить в виде бесклеточного экстракта (см. гл. 6). Исходная процедура состояла в следующем клетки бактерии Е. соИ разрушали, из полученного экстракта методом центрифугирования удаляли фрагменты оболочек и мембран. ДНК разрушали добавлением ДНКазы (а бактериальная мРНК слишком нестабильна и не могла служить эндогенной матрицей). Полученная в результате надосадочная фракция активно транслирует любую добавленную мРНК, поскольку в этой фракции содержатся необходимые предшественники и источник энергии. Позднее были разработаны другие системы, содержащие более чистые компоненты. Такие системы были созданы из многих типов как прокариотических, так и эукариотических клеток. [c.59]

Данные наблюдения можно использовать для разработки методов очистки рекомбинационных ферментов. Бесклеточные экстракты проверяют на способность формировать димерные молекулы из мономерных колец. Экстракты из клеток дикого типа выполняют эту реакцию в них образуются молекулы типа восьмерки, которые далее могут быть разрезаны с образованием /ii-структур. Экстракты из клеток гесА в этом отношении неактивны. Re A-систему можно фракционировать и использовать компоненты в комплементационных экспериментах, подобно тому как это делается для изучения репликации ДНК (гл. 33). [c.448]

Рекомбинантные белки очищают так же, как и любые другие белки в бесклеточном экстракте. Методы очистки дрожжевых белков не отличаются от тех, которые используются для Е. oli (гл. 4). Работая с дрожжевыми системами, как правило, не приходится беспокоиться по поводу ренатурации денатурированного белкового продукта. В частности, мы не знаем ни одного примера секретируемого дрожжами белка, который не обладал бы ожидаемой биологической активностью. Для аналитических целей очистка секретируемых белков с помощью иммупоаффин-ной хроматографии представляется предпочтительной, по крайней мере по мнению первого автора данной главы. [c.236]

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

Точность этого метода определяется тем, насколько полно выявляется активность исследуемого фермента во фракции хлоропластов и в надосадочной жидкости. Некоторые ферменты типа РуБФ-карбокс-илазы при попадании в бесклеточный экстракт становятся лабильными или ингибируются. Поэтому очень важно, чтобы активность фермента в суммарном бесклеточиом экстракте (полученном без применения осмотически активных веществ) была равна сумме активностей этого фермента во фракции хлоропластов и в надосадочной жидкости. [c.560]

Методы, используемые для проверки исследуемых культур (см. разд. 2, часть II), не дают полной гарантии выявления специфических эндонуклеаз во всех штаммах, содержащих их. Одной из очевидных причин этому явлению в случае применения биохимического метода может быть маскирование рестриктазной активности неспецифическими нуклеазами. Именно неблагоприятное соотношение этих ферментов по мнению Майера и Райхенбаха [249 ] послужило причиной того, что среди 45 проверенных штаммов ytophaga только в двух случаях удалось выявить специфическое фрагментирование субстратов, проинкубированных с бесклеточными экстрактами исследуемых культур. Таким образом, применение традиционного метода тестирования наличия рестриктаз в исследуемых культурах дало в обсуждаемом случае исключительно низкую частоту встречаемости продуцентов. Для того, чтобы выяснить, насколько полученные данные отражают истину, необходимо применить другие методические подходы. [c.24]

Н. influenzae Rd, деградируется бесклеточным экстрактом указанного штамма. Это было продемонстрировано путем ультрацентрифугирования продуктов реакции в градиенте сахарозы и с использованием вискозиметрического метода. [c.135]

Первым этапом по поиску продуцентов специфических эндонуклеаз является получение бесклеточных экстрактов исследуемых культур. Для разрушения клеток в таких опытах обычно используется их обработка ультразвуком [104, 246, 261]. Иногда ультразвуковой дезинтеграции предшествует обработка клеток лизоцимом [245] или лизостафином [258]. В литературе имеются сведения и о некоторых реже используемых для разрушения клеток в обсуждаемых экспериментах, приемах. Так, Смит с соавт. [251] продемонстрировали, что рестриктазы, локализованные в периплазматическом пространстве клеток, могут быть переведены в раствор в результате осмотического шока, и успешно использовали этот прием в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. Механическое разрушение клеток при помощи гомогенизатора Поттера было предложено Майером и Райхенбахом [179]. Эти исследователи сравнивали три различных метода разрушения клеток ультразвуковую дезинтеграцию, осмотический шок и механический. Оказалось, что наиболее эффективным приемом в отношении выхода рестриктаз является обработка клеток ультразвуком. Осмотический шок и применение гомогенизатора Поттера дали выход соответственно на 40—60% и 20—40% ниже. Оказалось, что осмотический шок высвобождает рестриктазы только из грамотрицательных бактерий. По мнению авторов, механическое разрушение дает вполне приемлемые для опытов по поиску продуцентов рестриктаз результаты. Этот способ является менее трудоемким по сравнению с другими апробированными методами. Он успешно [c.136]

Наряду с вышеуказанными, относительно простыми методами первичной обработки бесклеточных экстрактов, имеются примеры использования с этой целью и более сложных приемов. Так, в экспериментах по поиску рестриктаз в штаммах рода Proteus, грубые экстракты пропускали через биогель А 0,5 м и тестировали активность целевых ферментов в собираемых фракциях [104]. В аналогичных экспериментах, заключавшихся в проверке 147 штаммов бактерий, их бесклеточные экстракты пропускали через фосфоцеллюлозу [261] и тестировали рестриктазную активность в фракции, содержащие несор-бировавшие белки и элюате, полученном при помощи ступенчатой элюции связанных сробентом белков 1 М раствором КС1. Трудоемкость последних двух приемов является очевидной. [c.137]

Пропускание бесклеточных экстрактов через фосфоцеллюлозу [261] можно рассматривать как способ, позволяющий совмещать в одном опыте проверку наличия рестриктазной активности в бесклеточных экстрактах (фракция, содержащая не-сорбировавшиеся белки) и частично очищенных препаратах (элюат). К сожалению, авторы цитированной работы, открывшие 15 продуцентов рестриктаз в 147 проверенных таким способом штаммах, не указывают, где (в проскоке или элюате) и в каком соотношении ими были обнаружены рестриктазные активности. Отсутствие этих данных не позволяет оценить потенциальные возможности обсуждаемого метода в отношении совмещения в одном опыте проверки активности целевых ферментов в бесклеточных экстрактах и частично очищенных их препаратах. [c.138]

В случае использования биологических методов, как следует из приведенных выше примеров, огромное число штаммов исключается из круга исследуемых уже на первых стадиях проверки. Биохимической проверке доступны все штаммы. Однако, и в этом случае существует множество причин, по которым имеющиеся в клетках специфические эндонуклеазы могут быть не обнаружены. Вряд ли все их можно предусмотреть и перечислить. Среди Очевидных причин видимого отсутствия искомой активности (кроме упомянутого выше отсутствия сайтов узнавания в субстрате) в опытах in vitro можно перечислить следующие отсутствие сайтов узнавания может иммитироваться природными модификациями субстратов как в виде метилирования, так и более сложными ее вариантами [19, 155]. Предположительно часть рестриктаз может инактивироваться в ходе получения бесклеточных экстрактов или маскироваться присутствием большой, относительно рестриктазной, активностью неспецифических нуклеаз. Несмотря на исключительно высокую чувствительность электрофоретического метода [241],. из-за маскирующего действия нуклеаз она может только снизиться. Проявление последнего фактора особенно должно сказаться на обнаружении рестриктаз, содержащихся в клетках в незначительных количествах. Состав рестрикционных смесей,, используемых для определения активности рестриктаз в опытах по их поиску, может оказаться далеко не оптимальным. В ка- [c.140]

В поиске путей решения вышеперечисленных вопросов определенный вклад могут внести биологические методы поиска СХС. Известны случаи, когда достоверно биологическими методами доказано существование СХС, но определить эндонуклеазную активность in vitro не удается [81, 150, 265]. Причины этого явления могут быть тривиальными (например, инактивация ферментов в бесклеточных экстрактах) или более сложными (потребность в неизвестном кофакторе (—ах)). Целенаправленное изучение причин этого явления могло бы способствовать поиску подходов в решении проблемы тестируемости хотя бы части рестриктаз биохимическими методами. [c.141]

Основными этапами выделения любой рестриктазы является получение бесклеточных экстрактов и собственно очистка целевых ферментов, осуществимая с применением традиционных приемов препаративной биохимии белковых соединений (высаливание, хроматографическое фракционирование и т. д.). Вместе с тем следует отметить, что процессам выделения рестриктаз, как и других ферментов нуклеинового обмена, характерен ряд специфических особенностей. В первую очередь это замечание относится к тому вниманию, которое уделяется разделению целевых ферментов и нуклеиновых кислот, в принципе способных влиять на перераспределение как рестриктаз, так и нуклеаз между фракциями, получаемыми в результате применения различных методов выделения целевых ферментов. Поэтому этот этап является одним из ключевых в схемах выделения рестриктаз, от результатов проведения которого во многом зависит успех дальнейшей их очистки. [c.143]

К попыткам создания унифицированной схемы очистки рестриктаз можно отнести и работу Бекси [32], апробировавших с этой целью прямое фракционирование бесклеточных экстрактов четырех продуцентов рестриктаз различной таксономической принадлежности на голубой сефарозе. Однако, эффективность этого метода была продемонстрирована на небольшой группе рестриктаз и для определения его универсальности необходимы дополнительные исследования. [c.159]

Большую роль в этом отношении сыграл разработанный А. Н. Лебедевым простой и изящный метод получения из дрожжей бесклеточного сока путем мацерации клеток. Мацерациониый сок Лебедева и в наиге время используется для получения растворов ферментов из дрол> жей и других клеток. В нашем столетии из дрожжевого сока, водных экстрактов мьинц и других тканей были выделены многочисленные ферменты. [c.168]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология