форма центрифугирование в градиенте плотности

Использование золей кремнезема в качестве среды для получения градиента плотности при разделении клеток и других биологических компонентов методом центрифугирования рассматривалось в гл. 4. Кроме того, при проведении биологических исследований кремнезем может применяться в качестве носителя нли подложки культуральной среды. Такую кремнеземную подложку можно стерилизовать предварительной автоклавной обработкой, а при необходимости ее можно изготовлять в очень чистой форме, свободной от других неорганических или органических загрязнений. [c.1089]

Двухцепочечный комплекс, построенный из исходной (- -)-цепи вирусной РНК и комплементарной к ней (—)-цепи РНК, синтезирующейся в организме хозяина при вирусной инфекции, является промежуточным продуктом при воспроизведении вируса в клетке ( репликативная форма ). Для такого комплекса характерна устойчивость к действию небольших концентраций РНК-азы, он может быть выделен и отделен от других форм РНК с помощью центрифугирования в градиенте плотности или хроматографии на МАК (см., например,121). [c.37]

Разделение липопротеидов плазмы с помощью ультрацентрифугирования основано на существенном различии в плотности липидов и белков (соответственно 0,88—1,06 и 1,30—1,35). Различные классы липопротеидов плазмы, имеющие разное соотношение липид белок, характеризуются определенными значениями плотностей. Один из вариантов этого метода включает измерение скорости флотации (в единицах Сведберга, 5г) липопротеидов в водной среде данной однородной плотности. Величина 5 зависит от плотности, размера и формы молекулы липопротеида. Липопротеиды наиболее низкой плотности (низкое отношение белок липид) имеют наибольшее значение Другой вариант основан на центрифугировании по градиенту плотности. С этой целью плотность плазмы ступенчато повышают добавлением растворов веществ, не влияющих на ее свойства, в результате чего липопротеиды в процессе ультрацентрифугирования концентрируются в виде полос в тех местах раствора, где его плотность соответствует плотности липопротеида. [c.369]

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем) большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 д в течение 1—4 ч. [c.149]

Следует иметь в виду, что профиль равновесного градиента плотности сохраняется только во время вращения ротора при расчетном числе оборотов. При замедлении вращения перед остановкой ротора диффузия уже не уравновешивается центробежными силами. Это особенно проявляется у обоих концов градиента, в то время как в средней его части наблюдается определенная компенсация диффузия соли из какого-либо среднего слоя в сторону мениска пополняется диффузией в него из соседнего слоя со стороны дна пробирки. Практически в срединных трех четвертях длины градиента форма его сохраняется вплоть до полной остановки ротора. Именно здесь, а не вблизи краев градиента, должны располагаться зоны фракционируемых частиц. Само собой разумеется, что раскапывать равновесный градиент надо немедленно по окончании центрифугирования. [c.244]

Трение влияние формы 299 Молекулярная масса 300 Метод точного измерения коэффициента седиментации 301 Примеры использования скоростной седиментации 302 Зональное центрифугирование в предварительно подготовлен ном градиенте плотности 306 Определение коэффициента седиментации с помощью зонального центрифугирования в предварительно приготовленном градиенте плотности ЗП [c.578]

Обычно применяют линейные градиенты плотности, однако в некоторых случаях в верхней части колонки целесообразно создавать также и более крутые нелинейные градиенты. Практически можно воспользоваться любым методом, предложенным для получения градиентов плотности. Наиболее простая методика, не требующая никаких специальных приборов, заключается в последовательном наслаивании нескольких растворов в порядке убывашя их плотности. Неоднородности на границах примыкающих зон позднее сглаживаются благодаря диффузии. Однако в настоящее время больщинство исследователей работают с градиентными смесителями разных типов, используемыми для создания градиентов концентрации растворов при хроматографии, центрифугировании в градиенте плотности или изо-электрическом фокусировании. Некоторые виды этих устройств и математические формулы для расчета формы кривой градиента плотности описаны Свенссоном [1259]. Приборы нескольких типов, позволяющие по желанию легко получать градиент плотности нужной формы, выпускаются промышленностью. [c.29]

В угловом роторе, где длина градиента мала, можно обойтись без преформирования. Форма равновесного градиента плотности раствора -метризамида получается довольно сложной, близкой к экспоненциальной (из-за вмешательства вязкости). Иногда она оказывается слишком крутой, поэтому предпочитают преформировать неравновесный линейный градиент, и воспользоваться его устойчивостью для сравнительно непродолжительного центрифугирования. [c.272]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

В клетках Е. соИ, зараженных фагом MS2, меченным по фосфору, у/ке через несколько минут после заражения образуется меченое соединение, устойчивое к действию РНК-азы [171]. Оно было идентифицировано как двухценочечная репликативная форма РНК фага MS2 (стр. 59 и стр. 161), во-первых, по профилю тепловой денатурации и температуре плавления, во-вторых, по поведению при центрифугировании в градиенте плотности сернокислого цезия и, в-третьих, по локализации радиоактивности в одной из цепей ( плюс -цепь), представляющей родительскую РНК фага MS2. Эта репликативная форма, но-видимому, аналогична репликативной форме ДНК фага фХПА (стр. 214). [c.249]

Из клеток, зараженных фагом ФХ174, наряду с одноцепочечной ДНК, присутствующей в вирусных частицах, можно с помощью центрифугирования в градиенте плотности и хроматографией на МАК получить двухцепочечный комплекс ДНК с вдвое большим молекулярным весом зэ — так называемую репликативную форму ДНК фага ФХ174. Присутствие в зараженной вирусом клетке форм вирусной ДНК, отличающихся по своей структуре от ДНК вирусных частиц, показано и для многих других вирусов. [c.32]

Важным моментом в препаративном центрифугировании является выбор ротора. Для быстрого отбора тяжелых фракций удобны угловые роторы. В этом случае на стенке пробирки образуется тяжелый слой, стекающий конвекционным потоком ко дну. В результате осадок собирается на дне очень быстро, хотя из-за конвекций ухудшается разрешение близко седиментирующих фракций. Лучше всего седиментация протекает в ячейках с секториальной полостью, обеспечивающих почти полное отсутствие конвекции. Подробнее об ячейках с секториальной полостью см. в гл. IX. Седиментация в роторе с подвесными стаканами в этом смысле ближе к идеальной, но форма пробирок и здесь несекториальная. К тому же в таком роторе в начале и в конце вращения может происходить взмучивание осадка. Тем не менее такие роторы широко используются при работе с градиентами плотности. В роторах Андерсона рабочие полости имеют идеальную секториальную форму, их можно наполнять и освобождать прямо во время вращения. Такие роторы более других подходят для фракционирования больших объемов вещества в градиентах плотности в условиях, близких к идеальным. Для получения максимальных ускорений стали применять роторы, сделанные из титана. [c.35]

Первый эксперимент с применением метода центрифугирования в градиенте плотности [461] особенно наглядно продемонстрировал значение этого метода. В этом эксперименте бактерии выращивались на среде, богатой № , и поэтому дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) организмов, меченных изотопом тяжелого азота, обладала несколько большей плотностью, чем обычная ДНК. Через определенное время бактерии переносили в среду с обычным распределением изотопа азота и методом центрифугирования в градиенте плотности анализировали изменения плотности ДНК, выделенной из ряда последовательных генераций клеток. На основе предположения Уотсона и Крика [30] было принято, что редупликация ДНК во время деления клеток включает разделение двух цепей двойной спирали (см. стр. 130), причем каждая цепь служит матрицей для синтеза дополняющей ее цепи. Если этот механизм достоверен, то вторая генерация клеток, происходящих от клеток, меченных N , должна содержать ДНК, в которой изотопом тяжелого азота мечена одна из цепей каждой двойной спирали. В последующих генерациях должно возрастать количество ДНК с обычным распределением изотопов азота, однако при этом сохраняется также некоторое количество наполовину меченной ДНК. В любой данный момент времени в растворе должны присутствовать молекулы ДНК только с тремя четко определенными плотностями и никаких компонентов с промежуточной плотностью обнаруживаться не должно. Это предположение было полностью подтверждено данными по ультрацентрифугированию в градиенте плотности (рис. 55), и поэтому механизм редупликации ДНК, который раньше был лишь плодом смелых теоретических представлений, можно считать в настоящее время окончательно установленным. В относительно короткое время после этого классического эксперимента метод центрифугирования в градиенте плотности различными путями способствовал развитию биохимических исследований. Можно привести несколько примеров, иллюстрирующих это положение. Методом меченых атомов, подобным описанному выше, было установлено, что некоторая часть рибонуклеиновой кислоты (РНК) переходит в последующие генерации клеток в нативной форме [468]. Было найдено, что плотность ДНК является линейной функцией содержания гуанина и цитозина в различных микроорганизмах, и, таким образом, ДНК, выделенная из какого-либо вещества, образует в градиенте плотности полосу с характерным расположением [469, 470]. На диаграмме градиента плотности ДНК, полученной из тканей высших организмов, периодически обнаруживаются сателлит-ные полосы [471], которые могут быть обусловлены симбиозными организмами или другими, еще неизвестными причинами. Типичный пример этого эффекта изображен на рис. 56, который, между прочим, наглядно свидетельствует также о чувствительности метода обнаружения малых [c.165]

При скоростях ротора, много меньших, чем те, при которых проводят опыты по скоростной седиментации, в результате центрифугирования устанавливается равновесное распределение макромолекул. Форма этого распределения самым тесным образом связана с молекулярной массой и не зависит от фрикционных свойств молекулы. При наличии смеси компонентов с помощью равновесного центрифугирования получают средневесовое значение молекулярной массы. В ряде случаев можно проанализировать равновесное распределение взаимодействующих макромолекул и определить константу связывания. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является чрезвычайно эффектив- [c.265]

В условиях стабильного функционирования фотосинтетического аппарата быстрой деградации белка D1 должен сопутствовать такой же интенсивный его синтез (Gaba et a . 1987). Процесс присоединения вновь синтезированного белка D1 к комплексу ФСИ можно отслеживать, используя ради-активно меченный S-метионин, который добавляется в систему трансляции белка D1 in vitro, в результате чего он включается в состав этого протеина. Затем проводится анализ включения этого радиоактивно-меченного белка в различные формы комплекса ФСИ, полученные при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы тилакоидных мембран, предварительно солюбилизированных слабым детергентом />додецил /5-0-мальтозидом. [c.139]

Вы предлагаете элегантный способ ответа на этот вопрос. В общих чертах подход состоит в том, что Н-тимидин за время непродолжительной инкубации (2 ч) включается в митохондриальную ДНК клеток мышцы, затем клетки переносят в среду с нерадиоактивным тимидином (для изгнания метки) на разные периоды времени, после чего проводят мечение 5-бромурацил-дезоксибозидом (БУДР) в течение двух часов (рис. 7-19). Любая ДНК, реплицировавшая во время обеих инкубаций, будет радиоактивной (благодаря Н-тимидину), а ее плотность станет более высокой, чем у нормальной митохондриальной ДНК (благодаря БУДР). Поскольку молекула митохондриальной ДНК имеет форму кольца, ее можно легко отделить от ядерной ДНК и провести анализ этих двух фракций порознь. Используя центрифугирование в градиенте плотности, можно отделить ДНК с высокой плотностью (содержащую БУДР) от ДНК с низкой плотностью (не содержащую БУДР) и измерить количество радиоактивности, связанной с каждой из них. Ваши результаты полного анализа [c.95]

Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зснально-изопикнического, или рв -зонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность (рв), а не размеры или форма частиц (рис. 2.4). На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора (разд. 2.5.3) митохондрии, лизосомы, перок-сисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42 %-, 47%-, 47%-и 27%-НОЙ сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см"3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определен- [c.48]

Конвекционных явлений и эффектов завихрения удается до некоторой степени избежать, используя пробирки секториальной формы (ячейки Стромайера) в роторах с подвесными стаканами и регулируя (увеличивая и уменьшая) скорость вращения ротора перечисленных выш недостатков лишен также метод центрифугирования в градиенте плотности, [c.53]

После центрифугирования при 2000 g и 25 °С в течение 45 мин живые клетки концентрируются в области с плотностью 1.08 г/мл. Клетки собирают и промывают от перколла центрифугированием дважды при 37 g, полученный осадок миоцитов ресуспензируют в среде Джоклика, содержащей 1 % бычьего сывороточного альбумина и 2 10 М СаСЬ- Было показано [20], что при центрифугировании в градиенте перколла удаляется значительная часть погибших клеток, при этом до 90 % клеток полученной фракции жизнеспособны и имеют палочковидную форму. [c.294]

Мэтью Мезельсон и автор этой книги использовали данный метод для того, чтобы показать, что ДНК профага вставляется в бактериальную ДНК. Штамм Е. oli, содержащий кольцевой половой фактор с местом присоединения для фага подвергали лизогенолизу. Половой фактор вместе с присоединенным профагом выделяли и комбинацией центрифугирования в щелочном градиенте сахарозы и в s l, содержащем бромид этидия, показали, что он обладает кольцевой структурой большей величины. Однако этот тест не давал возможности сделать выбор между двумя альтернативами, так как лизогенная форма могла представлять собой большее кольцо или катенан, состоящий из связанного полового фактора и кольца К. После введения одноцепочечных разрывов при обработке рентгеновскими лучами кольца получали плотность, совпадающую с плотностью линейной ДНК, причем не было обнаружено зон с промежуточной плотностью. Отсюда был сделан вывод, что лизогенная форма представляет собой непрерывное кольцо. [c.344]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология