Аммония сульфат, осаждение белков

Удобен следующий прием медленного добавления сульфата аммония при изоэлектрическом высаливании белков в забуференный рас твор белка опускают целлофановый мешочек с твердым сульфатом аммония, электролит диффундирует через мембрану и вызывает осаждение белка. Осадок белка, содержащий неорганическую соль, диали-зуют (дистиллированная вода) сульфат аммония удаляется и белок переходит в раствор. Для переосаждения используют описанный выше прием. Кристаллизации белка можно достичь после подходящего числа повторений этого процесса. Другой удобный метод переосаждения и иногда кристаллизации — добавление этилового спирта к раствору белка в изоэлектрической точке и охлаждение. [c.689]

Растворимость белков зависит также от наличия других растворенных веществ. Например, некоторые белки не растворяются в дистиллированной воде, но растворяются в присутствии небольших концентраций нейтральных солей. При высоких концентрациях нейтральных солей белки выпадают в осадок, причем для осаждения (высаливания) разных белков требуются разные концентрации соли. Следовательно, этим способом можно фракционировать белки. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют сульфат аммония. После удаления соли (например, путем диализа) осажденный белок вновь растворяется при этом сохраняются его нативные свойства. [c.47]

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении). [c.26]

Вызвать осаждение белков из растворов можно различными путями, например прибавлением солей (сульфата аммония и др.), кислот, спирта, а также нагреванием, при котором происходит свертывание белка. В зависимости от того, чем вызвано осаждение, а также в зависимости от характера самого белка, осадок белка может оказаться мало измененным или же сильно измененным. Осаждение солями в большинстве случаев приводит к наименьшим изменениям осадок, полученный при прибавлении солей, обычно можно опять растворить, и раствор в большинстве случаев будет обладать прежними свойствами. Другие способы осаждения, как, например, нагревание (кипячение), приводят к более глубоким изменениям свернувшийся при кипячении белок уже при обычных условиях более не растворяется. [c.268]

Разделение с помощью органических растворителей. Белки можно фракционировать с помощью осал дения органическими растворителями, например этанолом, ацетоном. Белки, склонные к агрегации, осаждают сульфатом аммония в присутствии нро-нанола [51]. Органические растворители снижают раствори-люсть белков благодаря изменению диэлектрической проницаемости среды. Поскольку причина осаждения состоит в агрегации молекул вследствие электростатического взаимодействия, что аналогично осаждению в изоэлектрической точке, pH в данном случае более важный фактор, чем при осал<дении солями. Следовательно, с помощью органических растворителей можно разделить очень близкие в структурном отношении белки, имеющие разные изоэлектрические точки. Например, при pH 6,5 парваль-бумины II, III и IV были разделены путем осаждения ацетоном [163]. Белок IV выпадал в осадок при концентрации ацетона 55—60%, белки III и IV — при концентрации 60—65%, белки III и II — при концентрации 65—70%, наиболее кислотные ком-коненты смеси с изоточками р/( —4 выпадали в осадок при концентрации ацетона 70—80%. [c.50]

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков . Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки. [c.32]

Далее, на колонке аналогичной смолы, но уже с низкой степенью сшивки, адсорбируют фермент. Для этого лучше всего применять Какен С-1 (SP-3) , но можно и дуолит С-10 или S-30. Ферментный белок затем очищают вытеснительной хроматографией, высаливанием сульфатом аммония и осаждением ацетоном, после чего, в случае надобности, кристаллизуют. Выход фермента по активности 5—15%. Он расщепляет в казеине — 75% пептидных связей, в клейковине пшеницы —80%, а в яичном альбумине— 87%. Большое значение для стабильности протеазы имеет присутствие в растворах иона Са, обычно прибавляемого в виде Са-ацетата. [c.208]

После удаления нуклеиновых кислот в растворе могут остаться капсульные камедеподобные углеводы. Это создает трудности при использовании обычных методов осаждения белков. В присутствии этих веществ невозможно применение сульфата аммония и других методов фракционного осаждения. Лучше полностью осадить белок в надежде, что камедеподобные вещества останутся в растворе. Практически весь белок можно осадить при 80%-ном насыщении сульфатом аммония (разд. 3.3) или 55%-ной концентрации ацетона (разд. 3.4). В случае использования сульфата аммония для осаждения белка может понадобиться скоростное центрифугирование. Но даже после этого растворенный белковый осадок содержит вещества, снижающие воспроизводимость результатов при работе на колонке или при использовании других методов фракционирования. [c.50]

П р и м е р 5. Очистка ДНК-полимеразы I из Е. oli [Rhodes et al., 1979]. На первых этапах здесь использовали грубую очистку осаждением полиэтиленимином и сульфатом аммония. Затем следовал этап хроматографической очистки на колонке фосфоцеллюлозы, уравновешенной 0,04 М К-фосфатным буфером (pH 6,9) с обычными добавками, включая 5% глицерина. Введение глицерина продиктовано лабильностью фермента — его активность снижается вдвое за сутки. Препарат вносили в том же буфере, им же промывали колонку, а затем вели элюцию линейным градиентом концентрации этого буфера (0,04—0,3 М). Таким образом, вытесняющий белок контрион (К+) поставлялся самим буфером. [c.304]

Освободить белок от полибуфера можно осаждением сульфатом аммония или гель-фильтрацией на сефадексе G-75 (для белков с Л/ > 25 ООО). [c.336]

Изучая образование стойких эмульсий при извлечении хлороформом сока или водного экстракта клубнелуковиц, мы обратили внимание, что при разделении эцульсии в стаканах отстойной центрифуги получалось трж слоя водный и хлороформный, а между ними располагалось слизистое пастообразное сероватое вещество, как выяснилось, содержащее белок. Ш цредположили, что белок коагулируется при обработке сока растворителем. Для устранения эцульсии к соку добавили сульфат аммония до полноты осаждения. Фильтрат после отделения осадка при обработке хлороформом не давал эцульсии, но и содержание алкалоидов в нем оказалось ничтожным. Из белкового осадка выделены колхицин и колхамин приблизительно в таких же количествах, как при обычной обработке сока. Оба метода выделения проверены и сопоставлены на свежих и высушенных клубнелуковицах. Выходы алкалоидов даны в таблице 1 Очевидно таким путем мож- [c.151]

Осаждение солью. 1гак показывает фиг. 20, растворимость белков в концентрированных солевых растворах может быть весьма различной. Это свойство используется при фракционировании смеси белков. Добавлением определенного количества соли осаждают часть загрязняющих белков и удаляют эти белки центрифугированием. Дальнейшее повышение концентрации соли может привести уже к осаждению нужного белка вместе с некоторой частью оставшихся загрязняющих белков. Очищенный белок (вместе с другими белками, выпавшими в осадок после второго добавления со. ш) отделяют центрифугированием. Удобнее всего применять д,пя такого осаждения белков сульфат аммония, однако нередко для этой цели испо 1Ьзуется также сульфат патрия. [c.80]

Реакция на белок. При ряде болезней почек в моче обнаруживаются значительные количества белка, который может быть обнаружен при помощи реакций осаждения азотной и сульфосалициловой кислотами, а также при кипячении подкисленной мочи. Появление белка в моче носит название протеинурии. Помимо белка в моче могут появляться продукты распада белка — пептоны. Последние не выпадают в осадок при кипячении, но осаждаются азотной и сульфосалициловой кислотами, а также сульфатом аммония. [c.253]

Если церулоплазмин подкислить до pH ниже, чем его изоэлектрическая точка, или обработать цианидом [42], из него можно удалить медь и получить бесцветный белок. Однако при добавлении к такому белку ионов меди реставрировать исходный фермент не удается. Обратимое удаление меди из церулоплазмина достигается при обработке его диэтилдитиокарбаматом (ДТК) [43]. Предварительно медь (И), содержащаяся в белке, восстанавливается цистеином при pH 5,0 и высокой ионной силе. Образующийся затем коллоидальный комплекс ДТК с вышедшей из белка медью с помощью ультрацентрифуги отделяют от раствора апофермента. Последний может быть очищен от всплывающих примесей путем осаждения сульфатом аммония, повторного растворения и диализа. В замороженных растворах апофермент устойчив в течение нескольких месяцев. При добавлении к такому апоферменту ионов меди(1) и реокисления на воздухе из него можжо вновь получить синий церулоплазмин, который по всем своим свойствам неотличим от исходного. В процессе перевода церулоплазмина в его апофермент и обратно не было обнаружено никаких форм, в которых содержание меди было бы промежуточным, т. е. отличным от содержания ее в апоферменте и холоферменте [44]. [c.368]

Высаливание. Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солями называется высаливанием. Характерной особенностью белков, осажденных в процессе высаливания, является то, что после удаления соли они сохраняют свои нативные биологические свойства. Сушность процесса высаливания заключается в том, что ионы забирают на себя гидратную оболочку белка, одновременно нейтрализуя заряд белковой молекулы. Способность к высаливанию наиболее ярко выражена у многозарядных анионов, в частности у сульфатов. На практике для высаливания чаше всего применяют сульфаты натрия и аммония. Помимо солей для осаждения белков могут быть использованы органические водоотнимаюшие (гидрофильные) растворители — этанол, ацетон, метанол и др. Высаливание достаточно широко применяется для разделения и очистки белков. Для каждого белка существует своя зона высаливания, т. е. диапазон концентраций соли, позволяющий дегидратировать и осадить белок. После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции. [c.72]

Опыт. Яичный белок смешивают со 100 мл воды и фильтрованием в вакууме удаляют нитевидный осадок. К 30 мл полученного золя при непрерывном перемешивании добавляют твердый сульфат аммония. Когда раствор почти насыщен, образуется белый осадон альбумина. После его осаждения сливают жидкость над осадком и добавляют 30 мл воды. Осадок снова растворяется. [c.548]

Осаждение путем высаливаипя. Большая часть белков нерастворима в насыш,енном растворе соли, например сульфата аммония. Если необходимо выделить белок из раствора без заметного изменения его хими-ческох природы или свойств, то белковый раствор насыщают (NH4)2S04, и тогда белок осаждается. После фильтрования избыток (N114)2804 обычно удаляют из раствора диализом. Такой процесс высаливания находит широкое ирименение прх выделении биологически активных белков. [c.324]

На основании очень старых работ Чика и Мартина растворы белков считались термодинамически неустойчивыми системами. Авторы констатировали, что осаждение альбумина сульфатом аммония происходило тем полнее, чем больше была первоначальная навеска альбумина, при прочих равных условиях. Из этого следовало, что в данном случае имеет место явление аномальной растворимости белка. Опыты по осаждению альбумина сульфатом аммония были повторены Зёренсеном Зёренсен исходил из того, что белки являются амфотерными электролитами. Следовательно, в растворе белка всегда присутствуют или ионы ОН или ионы Н+, т. е. в системе белок-вода—соль всегда в свободном виде присутствует либо основание, [c.59]

При нейтральном или близких к нему значениях pH большинство вирусов диссоциирует лишь при добавлении сильных денатурирующих агентов. Добавлением мочевины или формамида до концентрации 8—10 М при pH 7—8 можно вызвать диссоциацию многих вирусов, а для отделения высвободившегося белка от вирусной РНК часто прибегают к методу осаждения белка сульфатом аммония. Белок ВТМ, выделенный таким способом при 20%-ном насыщении сульфата аммония, нерастворим даже в присутствии дитиотреитола, предотвращающего самоокисление. Денатурированный белок ВТМ успешно ренатурирует при растворении в 8 М растворе мочевины и последующем диализе против 0,02 М фосфата при pH 6 [7]. Под действием мочевины ренатурация белка может произойти даже после его обработки галоидоводородными солями гуанидина (4 М), которые относятся к более сильным денатурирующим агентам. У таких детергентов, как додецилсульфат натрия, наблюдается тенденция слишком прочно связываться с белками, что и является основным недостатком при их использовании для выделения белков. [c.50]

В другом варианте очистки белок, осажденный сульфатом аммония или натрия, после диализа растворяют в О, М трис-НС1-буфере с pH 7,5, содержащем 1,0 М Na l, и фракционируют на колонке сверхтонкого сефакрила S-200 (Pharma ia). На колонку размером 2,5X90 см наносят 2 мл раствора белка и элюцию проводят тем же буферным раствором при скорости протекания 10—15 мл/ч. [c.51]

Агрегацию, а следовательно, и осаяадение белковых молекул можно вызвать добавлением к раствору белка солей, например сульфата аммония. Молекулы белка и неорганические ионы при гидратации конкурируют за молекулы воды, и по достижении определенной концентрации соли взаимодействия белок — белок начинают преобладать над взаимодействиями белок — вода, что приводит к агрегации, а затем и осаждению белка. Этот метод широко применяется на начальных стадиях очистки белков. Различия в изоэлектрической точке разных белковых молекул используются при разделении белков с помощью электрофореза. [c.24]

В частности, для большинства, если не для всех белков, существует предельная концентрация сульфата аммония (высокорастворимого, очень чистого п недорогого реагента), выше которой белок выпадает в осадок. Следовательно, к раствору белка может быть добавлен твердый (NH4)2S04, пока не произойдет осаждения. Осадок собирают путем центрифугирования и затем снова растворяют в меньшем объеме любого требуемого буфера. Этот довольно общий метод непригоден, если суммарная концентрация первоначального раствора слишком низка. [c.531]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология