Осаждение белка ацетоном

Выделение белков из клеток растений очень сложно и обычно заключается прежде всего в экстрагировании их изучаемого материала соответствующими растворителями. Как увидим дальше, отдельные группы белков растворимы в различных растворителях, и для их экстракции из растений в качестве растворителей используют воду, растворы солей, спирта, кислот и щелочей. Экстрагированные белки могут быть осаждены из растворов различными реактивами. В качестве осадителей белков используются органические растворители — спирт, ацетон концентрированные растворы минеральных солей, чаще всего растворы сульфата аммония кислоты — трихлоруксусная, фосфорновольфрамовая, пикриновая дубильные вещества, например таннин соли тяжелых металлов — ртути, меди, свинца. После осаждения белки отмывают и высушивают. [c.212]

Существующие методы осаждения белка можно разделить на методы обратимого осаждения и методы, применение которых ведет к разрушению пространственной структуры белковых молекул. При высаливании белков, осаждении их спиртом и ацетоном на холоду получаются осадки, которые можно затем вновь растворить без потери биологических свойств белка. При осаждении кипячением, минеральными и органическими кислотами, солями некоторых тяжелых металлов белки теряют свои биологические свойства. [c.61]

Интересно, что процесс денатурации белков, вызванный всеми перечисленными органическими веществами, не зависит от температуры и, для мочевины например, может иметь отрицательный температурный коэффициент. Этим они существенно отличаются от органических растворителей — таких, как, например, спирт или ацетон. Последние денатурируют и необратимо осаждают белок из растворов при комнатной и более высоких температурах. При критической температуре, лежащей около 65°, осаждение белка происходит при относительно невысоких концентрациях органических растворителей. Тем не менее, как уже указывалось в гл. I, нри температурах, близких к точке замерзания, можно производить фракционирование белков добавлением различных количеств растворителей, не вызывая их денатурации. Полагают, что осаждающее и денатурирующее [c.185]

Малоселективными являются классические методы высаливания белков, когда растворимость белка понижается путем добавления соли, чаще всего сульфата аммония, в результате чего начинается выпадение белка из раствора. Так как растворимость различных белков зависит от концентрации соли несколько по-разному, то с помощью сульфата аммония производится частичное фракционирование белковых смесей. Когда-то это был почти единственный известный прием разделения белковых смесей. Он требовал бесчисленного повторения процедуры высаливания белка солями. Первые производства чистых белковых препаратов, например белков кровяной сыворотки или чистых протеолитических ферментов, нашедших значительные применения в медицине, были целиком основаны на высаливании белков солями. Одна пз трудностей этой технологии заключалась в необходимости избавляться от больших количеств прибавленных солей путем диализа. Поэтому в дальнейшем было предложено заменить осаждение белков солями осаждением с помощью органических жидкостей — спирта и ацетона. От последних можно избавиться путем испарения, что [c.132]

Осаждение белков из растворов. При добавлении к водным растворам белков концентрированных растворов минеральных солей (например, сернокислого аммония) белки осаждаются высаливаются). Осаждение их происходит и при добавлении органических растворителей (спирта, ацетона). Во всех этих случаях белки не изменяют своих свойств и при разбавлении водой вновь переходят в раствор. [c.296]

Работа 48. Осаждение белка ацетоном [c.66]

Растворимость биополимеров в воде в значительной мере определяется их способностью к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается предпочтительным расположением на их поверхности гидрофильных групп. У нуклеиновых кислот важным фактором, способствующим гидратации, является наличие в нейтральной и щелочной среде отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению гидрофильных биополимеров. Так, для осаждения белков используется добавление к их водным растворам ацетона. Нуклеиновые кислоты осаждаются добавлением этанола. [c.233]

Способность белков осаждаться при известных условиях представляет интерес не только с точки зрения возможности их открытия с помощью реакций осаждения, но также и с точки зрения освобождения биологических жидкостей от белков в тех случаях, когда это необходимо в аналитических целях. Помимо осаждения белков кипячением в присутствии уксусной кислоты применяется также осаждение спиртом, ацетоном, высаливание белков из раствора концентрированными растворами нейтральных солей щелочных металлов, осаждение фосфорновольфрамовой кислотой, фосфорномолибденовой кислотой, трихлоруксусной кислотой и т. д. [c.277]

При медленном испарении раствора белка, содержащего электролит в концентрации, недостаточной для его осаждения, во многих случаях получается белок в кристаллическом состоянии. Можно применять и другие способы осаждения белка из раствора — лучше всего добавление этанола или ацетона. [c.417]

Многие органические растворители (спирты, ацетон, эфир и др.) осаждают белки из нейтрального или слабокислого раствора. Если к водному раствору белка прибавлять, например, этиловый спирт, то можно достигнуть такой концентрации его (неодинаковой для разных белков), когда происходит осаждение белка. Механизм действия спирта объясняют связыванием воды, что ведет к дегидратации мицелл белка и понижению их устойчивости в растворе. [c.22]

Осаждение органическими растворителями. Для избирательного осаждения белков можно использовать органические растворители, например ацетон, метанол и этанол. Однако следует иметь в виду, что добавление этих растворителей часто приводит к денатурации белков поэтому работать с ними лучше при очень низких температурах. [c.80]

Обратимое осаждение — высаливание, когда белки после осаждения могут быть вновь переведены в раствор добавлением новой порции растворителя, например воды. Осаждение белков вызывается этиловым спиртом, ацетоном, минеральны.ми солями (например, сернокислым аммонием). При обратимом осаждении свойства белков не меняются. [c.214]

Добавление к водному экстракту, содержащему белки, таких растворителей, как этанол или ацетон, вызывает различные эффекты, которые вместе приводят к осаждению белка. Основной эффект заключается в снижении активности воды. По мере возрастания концентрации органических растворителей снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Это можно объяснить снижением диэлектрической постоянной растворителя или же просто вытеснением большой массы воды и частичной иммобилизацией ее молекул вследствие гидратации молекул органического растворителя. Молекулы воды, расположенные упорядоченным образом вокруг гидрофобных участков на поверхности белка, могут быть замещены молекулами органического растворителя, что приводит к относительно более высокой растворимости этих участков. Некоторые сильно гидрофобные белки (обычно мембранные) могут растворяться в 100%-ном органическом растворителе. Однако суммарное действие органических растворителей ка цитоплазматические и другие водорастворимые белки состоит в снижении их растворимости до уровня, при котором начинаются агрегация и осаждение. [c.73]

Спиртовой экстракт фильтруют и концентрируют примерно до половины объема при нагревании на водяной бане. Охлаждают и добавляют избыток ацетона для полного осаждения белков и окрашенных соединений тщательно перемешивают и фильтруют. [c.120]

Действительно, поразительна была простота получения препаратов. Р.Вильштеттер работал в течение многих дней для того, чтобы получить с Помощью чрезвычайно тонких и кропотливых методов препарат хотя и сравнительно высокой степени чистоты, но зато разведенный до чрезвычайности, с ничтожнейшим выходом. Новые методы сводились к элементарному приему, который был известен каждому студенту химику осаждению белка спиртом или ацетоном. [c.155]

Осаждение белков различными специфическими оса-дителями является одной из наиболее широко применяющихся операций биохимического анализа, для которой в то же время надежные доказательства немногочисленны. Вероятно, не существует осадителей, полностью отделяющих белки от всех других составных веществ биологической смеси. Многие такие вещества применяются для отделения белков при анализе на некоторые другие составные части смеси. Очевидно, что задачей аналитика является выбрать для белка такой осадитель, который не осаждал бы ничего, кроме белка, или, по крайней мере, не осаждал бы небелковый азот. Было показано, что кислоты, как осадители, удаляют меньше небелкового азота, чем основные реагенты. Наиболее часто применяются трихлоруксусная кислота и реактив Фолина — Ву или их модификации. Из некислотных осадителей наиболее распространены ацетон и спирт. Последние работы со спиртом [196] указывают, что при соответствующем использовании этого вещества можно получить хорошее отделение белков от небелковых веществ. Однако несомненно, что обычные методы введения реактива неудовлетворительны. [c.37]

Учитывая явление гидратации, можно объяснить рассмотренный выше процесс осажДения белков водоотнимающими веществами (как, например, спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей). [c.51]

Осаждение белков из растворов с сохранением их нативных свойств может быть осуществлено также осаждением при температуре от 3 до —5° С некоторыми органическими жидкостями (ацетоном, спиртом). [c.35]

Фракционный анализ белков может быть использован не только для количественного учета их, но и для определения аминокислотного состава каждой фракции. Для этого необходимо белки из растворов осадить, выделить и очистить. Осаждение белков проводится в кислой среде при нагревании для выделения используют теплые щелочные растворы, в которых большинство белков хорошо растворяется. Очистку белков проводят последовательно ацетоном, спиртом, эфиром, высушивают и используют для последующих определений на содержание аминокислот. [c.370]

Осажденные белки отделяют на центрифуге и многократно промывают, сначала 5-6 раз ацетоном, затем 1 - 2 раза горячим этиловым спиртом и подсушивают, обрабатывая осадок белков 2-3 раза эфиром. [c.371]

Для лучшей очистки белков проводят их переосажде-ние. Для этого в центрифужные пробирки добавляют теплый раствор 0,2 н. NaOH и жидкость из пробирок вместе с осадком переливают в стакан. Пробирки несколько раз промыв-ают 0,2 н. NaOH, сливая раствор в тот же стакан. Жидкость в стакане нагревают при помешивании на водяной бане до 50° до полного растворения белков. Нерастворившиеся частицы (остатки клеток) отделяют центрифугированием. Для переосаждения белков в стакан с раствором белка добавляют 50%-ную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%. Осажденные белки отделяют центрифугированием. Для очистки белков их продолжают промывать в центрифужных пробирках ацетоном (5—6 раз), горячим этиловым спиртом (1—2 раза) и эфиром (2—3 раза). После каждого добавления реактива проводят центрифугирование, а жидкость над осадком сливают. Затем препараты белков высушивают при комнатной температуре или очень слабом нагревании. В препаратах белков определяют общее содержание азота по Кьельдалю. [c.47]

Некоторые органические растворители проявляют более сильное денатурирующее действие, чем другие. Давно установлено, что спирты с длинной цепью обладают более высокой денатурирующей способностью по сравнению с короткоцепочечными спиртами. Примеры этого приведены в разд. 3.5. Хотя этанол и используется в стандартных методах фракционирования белков плазмы [30], необходимо отметить, что эти белки (лишь немногие из них относятся к ферментам) составляют группу, характеризующуюся необычной стабильностью и переносящую условия, в которых денатурируют более чувствительные белки. Ацетон обладает менее денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при низкой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. [c.76]

После добавления первой порции растворителя (ацетона или этанола), обычно до 20—30%-ной концентрации, необходимо строго поддерживать соответствующую для данного случая температуру (например, О "С) в течение 10—15 мин, прежде чем проводить центрифугирование в предварительно охлажденном роторе. Количество осадка в значительной степени зависит от температуры, увеличиваясь при более низкой температуре. (Редкое исключение из естественного закона подлости , который гласит, что стоит что-либо одно изменить, как что-то другое тут же изменится к худшему. Снижение температуры не только уменьшает возможность денатурации, но и позволяет использовать более низкие концентрации органического растворителя.) Так как очень трудно точно поддерживать температуру ниже 0°С, особенно во время центрифугирования, на практике для осаждения белков органическими растворителями обычно используют температуру 0°С 1°С. [c.78]

Осаждение белков. Добавление к водному экстракту, содержащему белки, таких растворителей, как этанол, ацетон, метанол, н-пропанол, диоксан и др., вызьшает осаждение белка вследствие снижения активности воды. По мере возрастания концентрации органических растворителей снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул белка. Молекулы белка, расположенные вокруг гидрофильных участков на поверхности белка, могут быть замещены молекулами органического растворителя. Суммарное действие органического растворителя на белки состоит в снижении их растворимости до уровня, при котором начинается агрегация и осаждение. Установлено, что вблизи изоэлектрической точки белков осаждение происходит при более низкой концентрации растворителя. Па осаждение влияет размер молекулы крупные агрегируют быстрее, чем мелкие. Наиболее широко используются в качестве [c.51]

Многочисленные исследования показали, что всякое соединение, способное сольватироваться растворителем данного ВМС и понижать его растворимость, пригодно для высаливания. Так, например, спирт и ацетон способны отлично высаливать желатину из ее водных растворов, Аналогично происходит осаждение спиртом белка из водного раствора или осаждение ацетоном каучука из раствора бензола. Следовательно, при высаливании ВМС решающую роль играет не валентность ионов, а их способность к гидратации и к адсорбции на коллоидно-дисперсных частицах. [c.227]

Ход выделения. Срезанные побеги растирают в ступке с жидким азотом или разрушают прессом Френча и белок экстрагируют 0.1 М Трис-НС1 буфером (pH 7.6), содержащим 0.01 М [3-меркаптоэтанол и 1 мМ фенилметилсульфонилфлюорид (ФМСФ). Гомогенат центрифугируют 20 мин при 15000 об/мин, осадок отбрасывают, а белки из супернатанта осаждают охлажденным ацетоном в соотношении 1 2 (одна часть супернатанта на две части ацетона). Носле осаждения белков ацетон отсасывают пипеткой, а осадок центрифугируют при 10000g в течение 10 мин. Ацетон сливают, осадок растворяют в в 0,0625 М Трис-НС1- буфере (pH 6.8). В белковых образцах определяют содержание белка любым из описанных выше методов. [c.52]

При анализе содержания в физиологических жидкостях свободных аминокислот встает задача предварительной полной очистки их от белков. Для малых объемов плазмы (5—25 мкл) была описана элегантная методика осаждения белка холодным (—30°) ацетоном в капилляре (100 X 0,6 мм) с последующим центрифугированием в нем же, после чего кончик капилляра с осадком белка просто обламывали [Arola et al., 1977]. [c.483]

Вместе с тем было показано, что белки при определенных условиях могут быть получены в кристаллическом состоянии. Обглчно это достигается путем осторожного осаждения белка из раствора водоотнимающими средствами, папример ЫазЗО.ь (МН4)2304, ацетоном и др. [c.15]

При осаждении белков спиртом, ацетоном и концентрированными растворами минеральных солей белки не теряют способности снова переходить в раствор, чем ишроко пользуются для выделения [c.699]

Присутствие органических растворителей является помехой при определении активности почти всех ферментов. Поэтому при осаждении фермента растворителем (спиртом, ацетоном, диоксаном и т. п.) активность следует контролировать только после отделения осажденного белка, его растворения и удаления остатков спирта, ацетона и т. п. По сравнению с фракционированием в растворах солей обработка органическими, легко летучими веществами, имеет то преимущество, что получение готового препарата и его высушивание может быть вьшолнено сразу, без предварительного диализа растворов, а следовательно, без разбавления и частичной (дополнительной) инактивации, которые часто сопутствуют диализу. [c.146]

Проламины выделяют по следующей методике. Спиртовой экстракт из мерной колбы переливают в прибор для отгонки спирта в вакууме. Спирт отгоняют при температуре 35°. После полного удаления спирта к оставшемуся раствору, в котором белки начинают выпадать в осадок, добавляют небольшое количество воды и оставляют в холодильнике в течение ночи. При этом основная масса белков выпадает в осадок. Для полного осаждения белков раствор насыщают ацетоном до 90% реакцию раствора доводят до слабощелочной, добавляя несколько капель 1 н. NaOH. Содержимое колбы переносят в центрифужные пробирки, колбы споласкивают ацетоном и осадок белков отделяют центрифугированием при 3—4 тыс. об/мин. в течение 5—10 минут. Затем белки в пробирках несколько раз промывают ацетоном и эфиром с последующим центрифугированием. Осадки белков высушивают в вакуум-эксикаторе. [c.53]

Определение в организме А. С. и продуктов их превращения. А. С. в биологических жидкостях. Осаждение белков трихлоруксусной кислотой, прибавление к фильтрату раствора свежеперег-нанного фурфурола и колориметрия в кислой среде (Хаггард и соавторы). А. С. в выдыхаемом воздухе. Выдыхаемый воздух проходит через трубки, содержащие пятиокись иода при температуре 148°. При сгорании А. С. освобождает иод, который собирается в 1% раствор иодистого калия и титруется гипосульфитом (Хаггард и соавторы). Определение высших кетонов в биологи-ч еских жидкостях и в выдыхаемом воздухе. Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием гидразона, экстракция последнего и колориметрия (Хаггард и соавторы, модификация метода Гринберга и Лестера). Определение альдегидов в крови. См. Ацетон (метод Гринберга и Лестера). [c.226]

Высаливание. Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солями называется высаливанием. Характерной особенностью белков, осажденных в процессе высаливания, является то, что после удаления соли они сохраняют свои нативные биологические свойства. Сушность процесса высаливания заключается в том, что ионы забирают на себя гидратную оболочку белка, одновременно нейтрализуя заряд белковой молекулы. Способность к высаливанию наиболее ярко выражена у многозарядных анионов, в частности у сульфатов. На практике для высаливания чаше всего применяют сульфаты натрия и аммония. Помимо солей для осаждения белков могут быть использованы органические водоотнимаюшие (гидрофильные) растворители — этанол, ацетон, метанол и др. Высаливание достаточно широко применяется для разделения и очистки белков. Для каждого белка существует своя зона высаливания, т. е. диапазон концентраций соли, позволяющий дегидратировать и осадить белок. После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции. [c.72]

Одним из самых старых методов получения кристаллических белков является осторожное добавление этилового спирта или ацетона к холодному белковому раствору. Этим способом в конце прошлого столетия Гонпе-Зейлер и Гюфнер получили из крови многих животных кристаллический оксигемоглобин. В руках прежних авторов этот метод был, однако, чисто эмпирическим, и результаты его применения более или менее случайными. Значительного улучшения этого метода достигли Кон, Эдсалл, Онклей и их сотрудники [17]. Применение этилового спирта и других органических растворителей для осаждения белков основано на том, что органические растворители уменьшают диэлектрическую постоянную водных растворов белка. Противоположный эффект — увеличение диэлектрической постоянной — достигается добавлением глицина. Ввиду того что растворимость белков в большой степени зависит от диэлектрической постоянной растворителя, эти методы можно использовать для ступенчатого уменьшения растворимости белков и для их выделения в кристаллической форме. Само собой разумеется, что при подобной процедуре нужно контролировать и другие физикохимические факторы температуру, pH, ионную силу. Варьируя эти факторы, можно достичь разделения некоторых белковых фракций. Результаты, полученные при помощи этих методов, более подробно описаны в гл. УП1. [c.13]

Из этого обсуждения ясно, что количественное определение белков представляет собой довольно сложную процедуру. Большие количества белка можно определить путем прямого взвешивания высушенного осадка, полученного при кипячении растворов белка или при осаждении белка в его изоэлектрической точке. Главная трудность состоит здесь в удалении солей и других растворимых соединений, так как белковые осадки при промывании дестиллированной водой часто дают коллоидные растворы. Иногда этого можно избежать, если промывать белковый осадок разведенной уксусной кислотой или смесью метилового спирта с водой в разведении 1 1, а затем ацетоном и эфиром. [c.21]

Гель фосфата кальция, приготовленный по методу Кейлина и Хартри [345] или по методу Кунитца [264], является ценным адсорбентом для многих белков [346, 347]. Одним из преимуществ этого материала является то, что при понижении рН он растворяется, поэтому при селективной адсорбции выделяемого белка на этом адсорбенте отпадает необходимость в подборе соответствующего элюирующего агента. Лактикодегидраза была адсорбирована из экстракта сердечной мышцы на геле фосфата кальция, элюирована буферным раствором, очищена осаждением вначале ацетоном, а затем раствором сернокислого аммония и, наконец, выделена из раствора последнего в кристаллическом состоянии [346]. Были применены и другие неорганические вещества, например гели гидроокисей и сульфиды металлов [348, 349]. Протромбин адсорбировали на гидроокиси магния и выделяли при разложении последней действием ССЬ [231]. [c.75]

Осаждение белков из растворов с сохранением их нгт Еных свойств может быть осуществлено такл<е при температуре ст —3 до —некоторыми органическими веществами (ацетоном, спиртом). Изолированные белки подвергают лиофильной сушке. Вода при этом удаляется в вакууме. Лиофильная сушка широко применяется для получения в сухом виде медицинских препаратов. например различных вакцин, сывороток, у-глобулина и т. д. [c.9]

После удаления нуклеиновых кислот в растворе могут остаться капсульные камедеподобные углеводы. Это создает трудности при использовании обычных методов осаждения белков. В присутствии этих веществ невозможно применение сульфата аммония и других методов фракционного осаждения. Лучше полностью осадить белок в надежде, что камедеподобные вещества останутся в растворе. Практически весь белок можно осадить при 80%-ном насыщении сульфатом аммония (разд. 3.3) или 55%-ной концентрации ацетона (разд. 3.4). В случае использования сульфата аммония для осаждения белка может понадобиться скоростное центрифугирование. Но даже после этого растворенный белковый осадок содержит вещества, снижающие воспроизводимость результатов при работе на колонке или при использовании других методов фракционирования. [c.50]

Приготовление экстрактов из дрожжей связано с несколькими проблемами. Главная из них состоит в том, что клеточные стенки у грибов очень толстые и их трудно разрушить. Поэтому для получения экстракта требуются более эффективные методы. Если экстракт нужно получить быстро, единственный надежный способ — это применение вибрационной шаровой мельницы или гомогенизатора Мэитона — Гаулина. При использовании этих методов образуется большое количество частиц низкой плотности, которые не полностью удаляются центрифугированием. Мутность может снизить эффективность осаждения белка сульфатом аммония. Однако ее можно устранить путем агрегации частиц в органическом растворителе (ацетон, 20— 25% по объему при 0°С). В прозрачном растворе остается большинство ферментов, которые осаждаются при повышении концентрации ацетона (разд. 3.4). Прозрачные экстракты получают также, используя автолиз толуолом, но в этих условиях может происходить протеолитическое расщепление белков. [c.51]

Многие реагенты способны вызывать осаждение или коагуляцию коллоидно-растворимых белков. Осаждение может быть обратимым и необратимым иными словами, выпавшее в осадок вещество может снова растворяться или же становится нерастворимым. Кипячение растворов белков, особенно при добавлении уксусной кислоты и хлористого натрия или других электролитов, приводит к необратимой коагуляции белка. Эта реакция является одной из наиболее часто применяемых для обнаружения растворенных белковых веществ (например, для открытия белка в моче). Необратимое осаждение вызывают также минеральные кислоты (азотная, платимохлористоводородная, фосфорновольфрамовая, фосфорномолибдеповая, метафосфорная, железосннеродистая), пикриновая кислота, таннин и соли тяжелых металлов. Белки сохраняют растворимость, если их осаждать из водных растворов спиртом и ацетоном кроме того, обратимое осаждение может быть вызвано различными нейтральными солями, например сульфатами аммония, натрия и магния. Для этого необходимы определенные концентрации солей, минимальная величина которых зависит от вида белка (ср. альбумины и глобулины). [c.397]